Czynnik indukowany niedotlenieniem jamy ustnej Inhibitor hydroksylazy prolilowej Enarodustat przeciwdziała zmianom metabolizmu energetycznego nerek we wczesnych stadiach cukrzycowej choroby nerek

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Wstęp

Wydział Nefrologii i Endokrynologii, The University of Tokyo Graduate School of Medicine, Tokio, Japonia; Stypendium badawcze dla młodych naukowców, Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki, Tokio, Japonia; Laboratoria Badań Biologicznych i Farmakologicznych,

Centralny Instytut Farmaceutyczny, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japonia; Wydział Farmakologii Systemowej, The University of Tokyo Graduate School of Medicine, Tokio, Japonia; Laboratorium Biologii Syntetycznej, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Suita, Japonia; oraz WPI International Research Center for Neurointelligence, The University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), The University of Tokyo, Tokyo, Japan.

Inhibitory hydroksylazy prolilowej czynnika indukowanego niedotlenieniem (HIF), znane również jako stabilizatory HIF, zwiększają endogenną produkcję erytropoetyny i służą jako nowe środki terapeutyczne przeciwko anemii uchronicznynerkachoroba. HIF indukuje ekspresję różnych genów związanych z metabolizmem energetycznym jako adaptacyjną odpowiedź na hipoksję. Jednak pozostaje niejasne, w jaki sposób metaboliczne przeprogramowanie tkanki wewnętrznej poprzez stabilizację HIF wpływa na patofizjologięnerka choroby. Wcześniejsze badania sugerują, że ogólnoustrojowe zaburzenia metaboliczne, takie jak hiperglikemia i dyslipidemia, powodują zmiany metabolizmu nerek, prowadząc do dysfunkcji nerek, w tym cukrzycowej choroby nerek. Tutaj analizujemy wpływ enarodustatu (JTZ-951), doustnego stabilizatora HIF, na metabolizm energii nerek we wczesnych stadiach cukrzycowej choroby nerek, używając szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną i myszy z cukrzycą indukowaną alloksanem. Analiza transkryptomu wykazała, że ​​narodowość przeciwdziała zmianom metabolizmu nerkowego cukrzycy. Analiza transkryptomu wykazała, że ​​metabolizm kwasów tłuszczowych i aminokwasów był regulowany w górę w tkance nerek u chorych na cukrzycę i obniżany przez enarodustat, podczas gdy metabolizm glukozy był podwyższony. Te symetryczne zmiany zostały potwierdzone przez analizę metabolomiczną. Podczas gdy metabolity glikolizy i cyklu kwasów trikarboksylowych były akumulowane, a aminokwasy redukowane w tkance nerkowej zwierząt z cukrzycą, te zaburzenia metaboliczne były łagodzone przez enarodustat. Ponadto enarodustat zwiększył stosunek glutationu do dwusiarczku glutationu i łagodził stres oksydacyjny w tkance nerek zwierząt z cukrzycą. W ten sposób stabilizacja HIF przeciwdziała zmianom w metabolizmie energetycznym nerek zachodzącym w początkowym okresiecukrzycowynerkachoroba.

Cistanche jest bardzo dobry dla funkcji nerek

Oświadczenie tłumaczące

Inhibitory hydroksylazy prolilowej czynnika indukowanego niedotlenieniem (HIF) (znane również jako stabilizatory HIF) zwiększają endogenną produkcję erytropoetyny i służą jako nowe środki terapeutyczne przeciwko anemii uchronicznynerkachoroba. Nasze analizy transkryptomu i metabolomu tkanki nerkowej w szczurzych i mysich modelach cukrzycy wykazały, że enarodustat (JTZ-951), doustny stabilizator HIF, przeciwdziała zmianom metabolizmu energetycznego nerek we wczesnych stadiach cukrzycowej choroby nerek. Wyniki dostarczają ważnych danych do ekstrapolacji wpływu stabilizatorów HIF na nerkowy metabolizm energetyczny w warunkach klinicznych, chociaż potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić, w jaki sposób to przeprogramowanie nerkowego metabolizmu za pomocą stabilizatorów HIF wpływa na progresjęcukrzycowynerkachoroba.

Wprowadzenie

Inhibitory hydroksylazy prolilowej czynnika indukowanego niedotlenieniem (HIF) zwiększają endogenną produkcję erytropoetyny i służą jako nowe środki terapeutyczne przeciwko anemii w przewlekłychnerkachoroba. Komórki są wyposażone w mechanizm obronny przed niedotlenieniem, a HIF jest głównym regulatorem tej obrony. Nerki są fizjologicznie narażone na niedotlenienie, a przewlekłe niedotlenienie jest uznawane za ostatnią powszechną drogę prowadzącą do schyłkowej choroby nerek. Biorąc pod uwagę, że HIF indukuje ekspresję różnych genów związanych z odpowiedziami hipoksji, stabilizatory HIF mogą mieć plejotropowy wpływ na progresjęnerkachorobya także poprawa niedokrwistości w przewlekłejnerkachoroba. Co ciekawe, HIF indukuje ekspresję genów glikolitycznych i kinazy dehydrogenazy pirogronianowej, która hamuje wykorzystanie pirogronianu przez dehydrogenazę pirogronianową do napędzania mitochondrialnego cyklu kwasu trójkarboksylowego (TCA). do adaptacji komórek narażonych na niedotlenienie. Pozostaje jednak niejasne, w jaki sposób metaboliczne przeprogramowanie tkanki nerek poprzez stabilizację HIF wpływa na patofizjologięnerka choroby. Cukrzycowa choroba nerek (DKD) jest główną przyczyną schyłkowej choroby nerek. Ogólnoustrojowe zaburzenia metaboliczne, takie jak hiperglikemia i dyslipidemia, powodują zmiany metabolizmu nerek, prowadzące do dysfunkcji nerek, w tym DKD. Wcześniejsze badania wykazały zwiększony przepływ metaboliczny i akumulację glukozy i metabolitów cyklu TCA w tkance kory nerkowej cukrzyków, co może być związane z dysfunkcją mitochondriów i progresją DKD. Postawiliśmy hipotezę, że stabilizatory HIF mogą odwrócić zmiany metabolizmu w tkance kory nerkowej cukrzyków, biorąc pod uwagę, że HIF, jako adaptacyjna odpowiedź na niedotlenienie, zmniejsza przepływ metaboliczny w komórkach, aby zahamować zużycie tlenu. Tak więc, wykorzystując analizy transkryptomu i metabolomu, przeprowadziliśmy badanie sprawdzające słuszność koncepcji, aby kompleksowo zrozumieć, w jaki sposób enarodustat (JTZ-951), doustny stabilizator HIF, wpływa na zmiany metabolizmu nerek występujące we wczesnych stadiach DKD.

WYNIKI: Enarodustat indukuje przeprogramowanie metaboliczne z cyklu TCA do glikolizy w komórkach kanalika proksymalnego nerki

Ponieważ kora nerkowa składa się głównie z kanalików proksymalnych, najpierw zbadaliśmy wpływ enarodustatu na przepływ metaboliczny komórek kanalików proksymalnych nerkowych in vitro. Najpierw przeprowadzono test stresu Mito (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) i test szybkości glikolitycznej (Agilent) w hodowanych komórkach HK-2, ludzkiej linii komórek nabłonka kanalika proksymalnego (Figura 1a). Enarodustat znacznie zmniejszył oddychanie mitochondrialne (cykl TCA) i zwiększył podstawową glikolizę, wskazując na przeprogramowanie metaboliczne z cyklu TCA do glikolizy (Rysunek 1; Rysunek uzupełniający S1). Przeprowadziliśmy również eksperyment z użyciem małego interferującego RNA (siRNA) dla HIF -1 (Rysunek 2; Rysunek uzupełniający S2). Uderzenie HIF-1 przez siRNA odwróciło zmiany metaboliczne (oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne, rezerwowa pojemność oddechowa i produkcja adenozynotrójfosforanu [ATP]) wywołane przez enarodustat, co pokazało, że przeprogramowanie metaboliczne zachodziło głównie przez HIF-1 stabilizacja (Rysunek 2; Rysunek uzupełniający S2). Aktywność dehydrogenazy pirogronianowej, ważnego czynnika dla komórek wykorzystujących pirogronian do napędzania cyklu TCA, również została zmniejszona przez enarodustat (ryc. 2f), co było zgodne z wcześniej opublikowanymi obserwacjami.

Podstawowe dane dotyczące szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną

Na podstawie wyników eksperymentów in vitro postawiliśmy hipotezę, że stabilizatory HIF mogą łagodzić zmiany metabolizmu w tkance kory nerkowej u chorych na cukrzycę poprzez przeprogramowanie metaboliczne z cyklu TCA do glikolizy. Najpierw wybraliśmy szczury z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ) jako model dla eksperymentu weryfikującego koncepcję, aby przetestować wyżej wspomnianą hipotezę. W tym modelu cukrzyca jest szybko wywoływana, co pozwala nam w krótkim czasie zaobserwować efekty netto cukrzycy i stabilizatorów HIF na metabolizm energetyczny w tkance nerkowej. Protokół badania i podstawowe dane z eksperymentów na szczurach z cukrzycą indukowaną STZ przedstawiono na Figurze 3a. Podzieliliśmy szczury na 3 grupy: grupę A (pozorę), grupę B (DKD) i grupę C (DKD – enarodustat). Stężenie glukozy w osoczu krwi, glikozylowanej hemoglobiny HbA1c, triglicerydów i cholesterolu całkowitego w dniu 14. były istotnie podwyższone w grupach chorych na cukrzycę w porównaniu z grupą A, podczas gdy nie było istotnych różnic między grupami B i C (ryc. 3d-g). Chociaż poziomy kreatyniny w osoczu nie różniły się między grupami, wydalanie albuminy z moczem było znacznie zwiększone, a kłębuszkowe powiększenie było zauważalne w grupie B w porównaniu z grupą A, a enarodustat miał tendencję do odwracania tych zmian (ryc. 4). Poziom azotu mocznikowego we krwi był wyższy w grupach chorych na cukrzycę, co odzwierciedla odwodnienie spowodowane cukrzycą. Podsumowując, nerki szczurów leczonych STZ w naszym badaniu reprezentują wczesne stadia DKD. Analizy transkryptomu i metabolomu przeprowadzono przy użyciu tkanki kory nerkowej tych szczurów.

Analiza transkryptomu tkanki kory nerkowej

Wyniki analizy transkryptomu tkanki kory nerkowej przedstawiono na rycinach 5 i 6. Analiza głównych składowych i analiza hierarchicznych klasterów wykazały, że grupy A, B i C zostały podzielone odpowiednio na różne klastry (ryc. 5a i b). Geny o zróżnicowanej ekspresji wybrano przez │log2 krotność zmiany (FC) │ większe lub równe 0.5 i wartość Q < 0.05.="" analizy="" ontologii="" genów="" i="" szlaków="" kanonicznych="" wykazały,="" że="" geny="" związane="" z="" metabolizmem="" kwasów="" tłuszczowych="" były="" podwyższone="" w="" grupie="" b="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" a.="" w="" przeciwieństwie="" do="" tego,="" geny="" związane="" z="" metabolizmem="" glukozy="" i="" odpowiedzią="" na="" hipoksję,="" w="" tym="" sieć="" hif-1,="" były="" podwyższone="" w="" grupie="" c="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" b="" (rysunek="" 5c="" i="" d).="" przeprowadziliśmy="" również="" analizę="" wzbogacania="" zestawu="" genów="" (gsea)="" przy="" użyciu="" danych="" transkryptomicznych="" (ryc.="" 6,="" tabele="" 1="" i="" 2).="" zestawy="" genów="" metabolizmu="" kwasów="" tłuszczowych="" i="" aminokwasów="" były="" podwyższone="" w="" grupie="" b="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" a="" (figura="" 6).="" w="" przeciwieństwie="" do="" tego,="" te="" zestawy="" genów="" były="" regulowane="" w="" dół,="" a="" zestawy="" genów="" metabolizmu="" glukozy="" były="" regulowane="" w="" górę="" w="" grupie="" c="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" b,="" co="" pokazuje,="" że="" enarodustat="" odwrócił="" zmiany="" metabolizmu="" wywołane="" przez="" cukrzycę="" (figura="" 6).="" co="" więcej,="" zestawy="" genów="" cyklu="" tca="" były="" obniżone="" w="" grupie="" c="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" b="" (tabela="" 2),="" co="" jest="" zgodne="" z="" pojęciem="" przeprogramowania="" metabolicznego="" indukowanego="" przez="" enarodustat="" w="" kanalikach="" proksymalnych="" obserwowanym="" w="" naszym="" badaniu="" in="" vitro.="" podsumowując,="" enarodustat="" przeciwdziałał="" cukrzycowym="" zmianom="" metabolizmu="" nerek="" z="" perspektywy="">

Analiza metabolomiczna tkanki kory nerkowej

Zmierzyliśmy bezwzględne stężenia 116 metabolitów związanych z energią w tkance kory nerkowej szczurów (n =4, dla każdej grupy) losowo wybranych z każdej grupy (tabela uzupełniająca S1; rysunek uzupełniający S3). Przeprowadzono częściową analizę dyskryminacyjną najmniejszych kwadratów (PLS-DA) w celu oceny istotności dyskryminacji klasowej (ryc. 7). Przeprowadziliśmy analizę wzbogacenia zestawu metabolitów (MSEA) z wykorzystaniem metabolitów o zmiennym znaczeniu w projekcji PLS-DA (VIP) 1. Różnice w metabolizmie aminokwasów, takich jak glicyna, seryna, metionina, asparaginian, glutaminian, arginina, prolina, oraz b-alaninę pomiędzy grupami A i B. Zaobserwowano również różnice w metabolizmie aminokwasów między grupami B i C. Ponadto procesy metabolizmu glukozy, takie jak glikoliza i glukoneogeneza, wykazywały różne trendy między grupami B i C (ryc. 7).

Wizualizacja danych transkryptomu i metabolomu na mapie szlaku metabolicznego energii

Zwizualizowaliśmy dane transkryptomu i metabolomu w celu pełnego zrozumienia zmian w metabolizmie energii (ryc. 8). Stwierdzono, że metabolity glikolizy i cyklu TCA kumulują się w grupie B w porównaniu z grupą A, co może być spowodowane nadmiernym napływem glukozy i nadregulacją metabolizmu kwasów tłuszczowych w DKD. Stężenie aminokwasów było zmniejszone w grupie B w porównaniu z grupą A, odzwierciedlając zwiększenie metabolizmu aminokwasów (Figura 8a). W przeciwieństwie do tego, akumulacja metabolitów glikolizy została zmniejszona przez enarodustat, ze względu na ułatwiony przepływ glikolizy. Enarodustat odwrócił również wywołane cukrzycą zmiany w metabolitach i aminokwasach cyklu TCA (ryc. 8b). Co więcej, enarodustat złagodził akumulację dwusiarczku glutationu (GSSG) w tkance nerek cukrzycowej, a tym samym wykazał wyższy stosunek glutation/GSSG, co sugerowało, że enarodustat łagodził stres oksydacyjny w DKD (Rysunek 8a i b). Zmniejszenie stresu oksydacyjnego zostało potwierdzone przez poziomy markera peroksydacji lipidów, dialdehydu malonowego w tkance kory nerkowej: enarodustat odwrócił akumulację dialdehydu malonowego w tkance kory nerkowej cukrzyków (rysunek uzupełniający S4). Podsumowując, integracja danych transkryptomu i metabolomu wykazała, że ​​enarodustat przeciwdziała zmianom metabolizmu energii nerek zachodzącym we wczesnych stadiach DKD.

Symetryczne zmiany metabolizmu (cukrzyca vs. enarodustat) zostały potwierdzone w alternatywnym modelu

Przeprowadziliśmy analizę transkryptomu u myszy z cukrzycą indukowaną alloksanem, innym zwierzęcym modelu cukrzycy, aby potwierdzić nasze odkrycia w modelu szczurzym. Protokoły badań i dane tła dla modelu mysiego przedstawiono na rycinie 9. Wydalanie albuminy z moczem było znacznie zwiększone w grupie B w porównaniu z grupą A, co zostało odwrócone przez enarodustat (ryc. 9d). Dodatkowo zastosowaliśmy kompleksową 3-analizę wymiarową (jasne, niezakłócone koktajle do obrazowania mózgu i ciała oraz analiza obliczeniowa [CUBIC]–nerka)16 w celu zwizualizowania kłębuszków nerkowych. Glomerulomegalia była zauważalna w grupie B w porównaniu z grupą A, co zostało odwrócone przez enarodustat (ryc. 9e). Analiza transkryptomu tkanki nerkowej u myszy z cukrzycą indukowaną alloksanem wykazała symetryczne zmiany metabolizmu (cukrzyca vs. enarodustat) w taki sam sposób, jak w modelu szczura z cukrzycą indukowaną STZ (ryc. 10): metabolizm kwasów tłuszczowych był podwyższony przez cukrzycę, podczas gdy glukoza metabolizm został podwyższony przez enarodustat. Co więcej, metabolizm aminokwasów był regulowany w górę przez cukrzycę i obniżany przez enarodustat. W ten sposób enarodustat przeciwdziałał zmianom metabolizmu energii nerek zachodzącym we wczesnych stadiach DKD w mysim modelu z cukrzycą indukowaną alloksanem, jak również w modelu szczura z cukrzycą indukowaną STZ.

DYSKUSJA

W tym badaniu wykazaliśmy, że enarodustat (JTZ-951), doustny stabilizator HIF, przeciwdziała zmianom metabolizmu energii nerek zachodzącym we wczesnych stadiach DKD w szczurzych i mysich modelach cukrzycy. Analizy transkryptomu i metabolomu wykazały symetryczne zmiany metabolizmu w tkance nerek (cukrzyca vs. enarodustat): metabolizm kwasów tłuszczowych i aminokwasów był podwyższony w DKD, podczas gdy enarodustat obniżył te szlaki i dodatkowo podwyższył metabolizm glukozy (ryc. 5-10).

Nie do końca wyjaśniono, czy stabilizacja HIF ma działanie ochronne na patofizjologię DKD, czy nie. Wcześniejsze badania wykazały, że tkanka nerki cukrzycowej jest narażona na hipoksję17, a ekspresja HIF w tkance nerek cukrzycowej jest niewystarczająca w odpowiedzi na stan niedotlenienia, który jest częściowo spowodowany stresem oksydacyjnym.18 Stabilizacja HIF za pomocą chlorku kobaltu poprawiła stan stresu oksydacyjnego i zmniejszyła białkomocz i uszkodzenie kanalików śródmiąższowych w DKD wywołanej przez STZ.19 Wyniki badań na zwierzętach wykazały również, że stabilizacja HIF chroniła przed rozwojem otyłości,20 poprawiała wrażliwość na insulinę20 i obniżała poziom cholesterolu w surowicy.21 Wyniki te sugerują ochronny wpływ stabilizacji HIF na rozwój DKD. W przeciwieństwie do tego, donoszono, że suprafizjologiczna stabilizacja HIF przez delecję von Hippel-Lindau indukuje zwłóknienie nerek.22 Rola stabilizacji HIF w progresji DKD może być zależna od kontekstu, biorąc pod uwagę plejotropowe działanie HIF i istnienie różnych fenotypów DKD. Celem tego badania było wyjaśnienie wpływu netto stabilizacji HIF na metabolizm energetyczny w nerkach chorych na cukrzycę. Poprzednie doniesienia wskazywały, że w DKD występują zmiany metabolizmu energetycznego. Sas i wsp.10 wykazali zwiększony przepływ energii metabolicznej i akumulację metabolitów glukozy w tkance kory nerkowej cukrzyków, co może być związane z dysfunkcją mitochondriów. Ty i wsp.23 donieśli, że fumaran, metabolit cyklu TCA, kumulował się w tkance nerek u chorych na cukrzycę i bezpośrednio przyczyniał się do progresji DKD. Wcześniej wykazaliśmy, że metabolity cyklu TCA kumulują się w tkance nerkowej cukrzyków, co jest odwracane przez hamowanie kotransportera sodowo-glukozowego 2 lub ograniczenie kalorii.11 Ponadto Qi i wsp.24 wykazali, że enzymy w szlakach glikolitycznych, w tym kinaza pirogronianowa M2 (PKM2), były podwyższone u pacjentów z cukrzycą typu 1 bez DKD w porównaniu z pacjentami z DKD. Aktywacja PKM2 odwróciła akumulację metabolitów glikolizy i przywróciła funkcję mitochondriów, częściowo poprzez zwiększenie przepływu glikolitycznego.24,25 Te wcześniejsze doniesienia sugerują, że akumulacja glikolizy i metabolitów cyklu TCA może wpływać na progresję DKD, którą można złagodzić przez ułatwioną glikolizę, w tym PKM2. aktywacja. W naszym badaniu stabilizacja HIF przez enarodustat odwróciła zmiany metabolizmu energetycznego i złagodziła akumulację glikolizy i metabolitów cyklu TCA w tkance kory nerkowej cukrzyka (ryc. 8). Ekspresja enzymów glikolitycznych, w tym PKM2, była również regulowana w górę przez enarodustat (rysunek uzupełniający S4B). Co więcej, enarodustat złagodził akumulację GSSG i zwiększył stosunek glutation/GSSG, co sugeruje, że enarodustat złagodził stres oksydacyjny w DKD (Rysunek 8). To wywołane przez enarodustat zmniejszenie stresu oksydacyjnego zostało również potwierdzone przez zmiany poziomu dialdehydu malonowego w tkance kory nerkowej (rysunek uzupełniający S4A). Wyniki te sugerują, że stabilizacja HIF powinna odgrywać rolę ochronną w patofizjologii DKD przynajmniej z perspektywy metabolicznej. Pewne jest, że nie możemy zbadać, czy przeprogramowanie metaboliczne poprzez stabilizację HIF ma bezpośredni wpływ na progresję DKD, ponieważ ze względu na plejotropową rolę HIF może być niemożliwe dostrzeżenie wpływu netto zmian metabolizmu na wyniki nerkowe. Jednak w naszym badaniu łagodne wydalanie albumin z moczem i nieprawidłowości patologiczne nerek (pogrubienie kłębuszków nerkowych i pogrubienie błony podstawnej kłębuszków) wywołane cukrzycą zostały złagodzone przez enarodustat, w połączeniu z normalizacją metabolizmu energetycznego nerek. Wyodrębniliśmy geny, których zmiany ekspresji korelowały z poziomami albuminy w moczu (257 sond; 232 geny) z danych z mikromacierzy w mysim modelu z cukrzycą indukowaną alloksanem i przeprowadziliśmy analizę wzbogacania szlaku (rysunek uzupełniający S5). W rezultacie szlaki związane z błoną mitochondrialną i oddechowym transportem elektronów są regulowane w górę, związane z poziomem albumin w moczu, co wskazuje, że obciążenie mitochondriów jest ściśle związane z wydalaniem albumin z moczem. Zatem istnieje możliwość, że normalizacja metaboliczna tkanki nerek cukrzycowej przez stabilizatory HIF może zmniejszyć obciążenie mitochondriów i złagodzić progresję DKD. Nasze dane sugerują patofizjologię DKD z perspektywy metabolicznej w następujący sposób: Hiperglikemia stwarza zapotrzebowanie na energię do reabsorpcji glukozy w kanalikach proksymalnych nerek; w ten sposób cykl TCA w mitochondriach jest przymusowo aktywowany w celu zaspokojenia zapotrzebowania energetycznego we wczesnych stadiach DKD (zwiększenie metabolizmu kwasów tłuszczowych i aminokwasów). Stabilizatory HIF mogą łagodzić to obciążenie mitochondriów poprzez przeprogramowanie metaboliczne z cyklu TCA do glikolizy (regulacja w dół metabolizmu kwasów tłuszczowych i aminokwasów oraz regulacja w górę glikolizy), co może pełnić rolę ochronną przed postępem DKD. Aby wyjaśnić, w jaki sposób obciążenie mitochondrialne w tkance nerkowej bezpośrednio wpływa na patofizjologię DKD, potrzebne są dalsze badania, w tym omika pojedynczych komórek. Innym interesującym pytaniem jest, czy stabilizatory HIF bezpośrednio wpływają na wchłanianie glukozy w kanalikach proksymalnych. Nasze dane in vitro wykazały, że produkcja ATP jest znacznie zmniejszona przez enarodustat poprzez przeprogramowanie metaboliczne z cyklu TCA do glikolizy (ryc. 1 i 2). Biorąc pod uwagę, że ATP jest wymagane do reabsorpcji glukozy przez kotransporter sodowo-glukozowy 2, wysunęliśmy najpierw hipotezę, że reabsorpcja glukozy może być dezaktywowana przez enarodustat. Jednak poziomy glukozy w moczu nie różniły się istotnie między grupą B i grupą C w obu modelach zwierzęcych (rysunek uzupełniający S6). Prawdopodobnie zmniejszenie produkcji ATP przez enarodustat jest znacznie łagodniejsze w sytuacji fizjologicznej w porównaniu z jego efektem in vitro; zatem stabilizacja HIF nie wpływa na wchłanianie glukozy przez kotransporter sodowo-glukozowy 2, przynajmniej w naszych doświadczeniach na zwierzętach. Nasze badanie miało 2 ograniczenia. Po pierwsze, wykorzystaliśmy szczury z cukrzycą indukowaną STZ i myszy z cukrzycą indukowaną alloksanem jako modele wczesnej fazy DKD i obserwowaliśmy krótkoterminowe skutki stanów cukrzycowych. Jednak w warunkach klinicznych stabilizatory HIF byłyby podawane pacjentom z niedokrwistością w późnym stadium DKD. Potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć wpływ stabilizacji HIF na zmiany metabolizmu nerek w późnej fazie DKD. Po drugie, w badaniu brakowało wystarczającej mocy statystycznej w odniesieniu do rozproszenia stężeń metabolitów w danych metabolomicznych, podczas gdy dane transkryptomu miały wystarczająco dużą moc statystyczną, aby wyjaśnić cały obraz metabolizmu energetycznego. Ponieważ niewiele metabolitów wykazywało znaczącą różnicę między grupami, przeprowadziliśmy PLS-DA i wybraliśmy metabolity z wynikiem VIP PLS-DA większym lub równym 1 dla MSEA. Chociaż trudno jest zweryfikować krzyżowo zmianę metaboliczną przy użyciu samych danych metabolomicznych, wyniki analizy metabolomicznej były zgodne z danymi transkryptomicznymi (ryc. 7 i 8), zapewniając dodatkowe wsparcie dla obserwowanych skutków zmian transkryptomu na metabolizm energetyczny nerek. Podsumowując, enarodustat (JTZ-951), doustny stabilizator HIF, przeciwdziała zmianom metabolizmu energetycznego nerek we wczesnych stadiach DKD. Nasze badanie sugeruje, że stabilizacja HIF może służyć jako potencjalna interwencja ukierunkowana na rozregulowany metabolizm energetyczny nerek w DKD.

METODY

Test wytrzymałościowy Mito i test szybkości glikolitycznej

Komórki HK-2 wysiano na mikropłytce 96-dołkowej przy gęstości 1 * 10⁴komórki/studzienkę. Następnego dnia przepływ metaboliczny mierzono w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora Seahorse XFe96 (Agilent) przy użyciu zestawu Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) lub zestawu do oznaczania szybkości glikolitycznej (103344- 100; Agilent). Stężenia glukozy, pirogronianu i glutaminy w pożywkach hodowlanych wynosiły odpowiednio 10 mmol/l, 1 mmol/l i 2 mmol/l.

transfekcja siRNA

Knockdown HIF-1 został przeprowadzony przez Stealth RNAi dla ludzkiego HIF1A (HSS104774 [nr 1] i HSS104775 [nr 2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Jako kontrolę negatywną zastosowano Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific).

Western blotting

Pierwotnymi przeciwciałami użytymi do barwienia były przeciwciała przeciw ludzkiemu HIF-1 (królicze poliklonalne, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) i przeciwciało przeciw ludzkiej aktynie (królicze poliklonalne, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Przeciwciałem drugorzędowym było kozie przeciwkrólicze przeciwciało IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Eksperymenty na zwierzętach

Szczury Crl:CD (Sprague Dawley) i myszy Crl:CD1 (Instytut Badań nad Rakiem) otrzymano z Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Japonia). Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu Tokijskiego (numer zatwierdzenia P17-110). Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (Przewodnik opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych). Protokoły badań przedstawiono na rycinach 3 i 9.

Analiza transkryptomu

Całkowity RNA z tkanki kory nerkowej wyizolowano przy użyciu zestawu GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). Całkowite RNA (100 ng) znakowano za pomocą zestawu do znakowania Quick Amp Low Input (Agilent), a następnie hybrydyzowano z SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (dla szczura; Agilent) i SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }} x60K Mikromacierz (dla myszy). Wszystkie eksperymenty z mikromacierzami zostały przeprowadzone przez DNA Chip Research Inc. (Tokio, Japonia). Surowe dane przetwarzano za pomocą pakietu R limma in Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) w celu wykonania korekcji tła i normalizacji danych przy użyciu metody normalizacji kwantyli. Efekty wsadowe usunięto za pomocą ComBat (Bioconductor) w eksperymencie na szczurach. Geny o zróżnicowanej ekspresji określono jako „log2 FC” większe lub równe 0,5 i wartość Q < 0,05.="" analizy="" ontologii="" genów="" i="" szlaków="" kanonicznych="" przeprowadzono="" przy="" użyciu="" silnika="" korelacji="" basespace="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" dane="" z="" mikromacierzy="" zostały="" zdeponowane="" w="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibus="" jako="" serie="" gse131221="" (szczur)="" i="" gse139317="">

Analiza wzbogacania zestawu genów

GSEA to metoda obliczeniowa, która określa, czy zdefiniowany a priori zestaw genów wykazuje statystycznie istotne, zgodne różnice między dwoma stanami biologicznymi. GSEA przeprowadzono przy użyciu GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Za istotne uznano ścieżki z fałszywym wskaźnikiem odkrywania <>

Analiza metabolomiczna

Pomiary metabolizmu zostały wykonane przez Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japonia). Stężenia metabolitów obliczono normalizując powierzchnię piku każdego metabolitu w odniesieniu do powierzchni wzorca wewnętrznego i stosując krzywe wzorcowe, które otrzymano z 3-kalibracji punktowych. Zobacz także Metody uzupełniające.

Analiza wzbogacania zestawu metabolitów

Analiza danych metabolomicznych została przeprowadzona przy użyciu zintegrowanej platformy internetowej MetaboAnalyst 4.0. Przeprowadzono PLS-DA i obliczono powiązane wyniki VIP. Metabolity z wynikiem VIP PLS-DA większym lub równym 1 zastosowano do analizy MSEA.

Kwantyfikacja obszarów kłębuszkowych w patologiach nerek

Losowo wykonaliśmy 3 patologiczne zdjęcia z obrazu barwionego kwasem nadjodowym-Schiffa dla każdej próbki i zmierzyliśmy każdy obszar kłębuszków odpowiednio przy użyciu Fidżi (rozkład ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

CUBIC-nerka

Kompleksowe 3-obrazowanie wymiarowe kłębuszków nerkowych w tkance nerkowej przeprowadzono za pomocą CUBIC zgodnie z naszymi poprzednimi artykułami. W skrócie, utrwalone nerki myszy zanurzono w CUBIC-L w celu usunięcia lipidów, a następnie poddano barwieniu immunofluorescencyjnemu. Ostatecznie współczynnik załamania światła dopasowano poprzez umieszczenie próbek w CUBIC-R plus. Kompleksowe trójwymiarowe obrazy z przezroczystych nerek uzyskano za pomocą specjalnie skonstruowanej mikroskopii fluorescencyjnej z lekkim arkuszem (MVX10-LS; Olympus, Tokio, Japonia). Pierwszorzędowym przeciwciałem użytym do barwienia było przeciwciało przeciw podocynie (królicze poliklonalne, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Przeciwciałem drugorzędowym było sprzężone z Alexa Flour 555- ośle przeciwkrólicze IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Analiza statystyczna

W przypadku porównań wielokrotnych zastosowano {{0}}analizę wariancji, a następnie, w stosownych przypadkach, testy wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). Za istotne statystycznie uznano p < 0,05.="" dane="" przedstawiono="" jako="" średnią="" ±="">

UJAWNIENIE

MN otrzymał honoraria, honoraria doradcze lub finansowanie badań od KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim i Alexion. TT otrzymał grant badawczy od JT. Enarodustat (JTZ-951) został dostarczony przez JT, Tokio, Japonia. EAS i HRU są współtwórcami patentów należących do RIKEN. Część tego badania została przeprowadzona we współpracy z Olympus Corporation i miłym oprogramowaniem wspieranym przez Bitplane. Drugi autor zadeklarował brak sprzecznych interesów.

PODZIĘKOWANIE

Jesteśmy wdzięczni dr Shuhei Yao i dr Shinji Tanace za cenne dyskusje. Dziękujemy również dr Tsuyoshi Inoue, dr Satoru Fukudzie i pani Kahoru Amitani za ich wsparcie techniczne. Praca ta została częściowo wykonana przy wsparciu Centrum Nauki Izotopów Uniwersytetu Tokijskiego. Praca ta była wspierana przez stypendystę Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant JSPS KAKENHI 19J11928 dla SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (grant JSPS KAKENHI 18H02824 dla MN ), stypendium na badania naukowe (C) (grant JSPS KAKENHI 17K09688 dla TT) oraz stypendium na badania naukowe nad obszarami innowacyjnymi (grant KAKENHI 26111003 dla MN).