Ścieżka postępu w badaniach przedklinicznych chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem: perspektywa na modelach pochodzących od gryzoni i pochodzących z HiPSC, część 5

Zalety systemów komórkowych i modeli chorób pochodzących z hiPSC

Ulepszone platformy do modelowania chorób i odkrywania leków

Potencjał modeli in vitro opartych na hiPSC w zakresie dostarczania dużej ilości informacji w przypadku NDD z badaniem ludzkiego komponentu genetycznego jest wysoki.

Związek między genetyką człowieka a pamięcią jest szeroko omawianym zagadnieniem, szczególnie we współczesnym społeczeństwie, gdzie kładziemy nacisk na rozwój osobisty i uczenie się. Chociaż informacja genetyczna determinuje nasze podstawowe cechy w chwili urodzenia, pamięć różni się od ustalonych cech, takich jak wzrost i kolor skóry. Zamiast tego można ją kultywować i udoskonalać, a ponadto odgrywa ważną rolę w życiu codziennym.

Po pierwsze, badania naukowe pokazują, że pamięć nie jest bezpośrednio powiązana z genami genetycznymi. Chociaż niektórzy ludzie rodzą się mądrzejsi od innych, na dłuższą metę pamięć można stopniowo poprawiać poprzez naukę i kultywację. W procesie uczenia się od szkoły podstawowej do uniwersytetu musimy stale wykorzystywać i doskonalić naszą pamięć, aby poprawić nasze wyniki w nauce. Na przykład zapamiętujemy problemy i rozwiązania poprzez wielokrotne powtarzanie i ćwiczenia, co pomaga ćwiczyć naszą zdolność pamięci.

Po drugie, zdrowy tryb życia również bardzo pomaga naszej pamięci. Zdrowie fizyczne ma ogromny wpływ na pamięć, na przykład odpowiedni sen, zdrowa dieta i umiarkowane ćwiczenia. Zaczynamy od własnego ciała i dbamy o zdrowie poprzez ćwiczenia i zdrowy tryb życia, który sprawi, że nasza pamięć będzie wyraźniejsza i ostrzejsza.

Wreszcie możemy poszerzać naszą zdolność pamięci poprzez ciągłe poszerzanie horyzontów i uczestnictwo w różnych nowych rzeczach. Na przykład możemy spróbować nauczyć się nowego języka i uczestniczyć w zajęciach towarzyskich, takich jak podróże, a te doświadczenia mogą stworzyć więcej wspomnień w naszych umysłach.

Krótko mówiąc, związek między genetyką człowieka a pamięcią jest złożony i różnorodny i oczywiście będą występować odpowiednie różnice wynikające z osobistych różnic genetycznych. Nie powinniśmy jednak ignorować tego, co możemy zrobić: poprawa naszej pamięci i zdolności samokontroli poprzez ciągłą naukę, zdrowy tryb życia i ciągłe poszerzanie horyzontów to dla nas najlepszy sposób na przezwyciężenie różnic genetycznych. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche to tradycyjna medycyna chińska o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność Cistanche wynika z różnych składników aktywnych, w tym kwasu garbnikowego, polisacharydów, glikozydów flawonoidowych itp. Składniki te mogą na wiele sposobów promować zdrowie mózgu.

Kliknij Wiedz, aby poprawić pamięć krótkotrwałą

Możliwość korelacji genów kandydujących na NDD z fenotypami komórkowymi, takimi jak profile ekspresji RNA i białek, zmiany morfologiczne i sygnatury biochemiczne w komórkach pochodzących z hiPSC, ułatwia badania dotyczące sposobu, w jaki ludzkie składniki genetyczne złożonych NDD, takich jak AD i PD, ulegają ekspresji na poziom komórkowy.

Co więcej, hiPSC umożliwiają włączenie do modelu złożoności genetycznej leżącego u podstaw podłoża genetycznego pacjenta, co jest często negowane (np. modele chemiczne) lub nadmiernie upraszczane (np. modele zwierzęce o wariantach monogenetycznych).

Powszechnie wiadomo, że początek, postęp i nasilenie neurodegeneracji zależą od złożonych czynników genetycznych i wzajemnego oddziaływania kilku wariantów genetycznych o stosunkowo niewielkich skutkach.

Ten wrodzony krajobraz genetyczny uchwycony w modelach hiPSC pochodzących od pacjentów pozwala nam badać determinanty genetyczne i czynniki biologiczne, w połączeniu z możliwością generowania modułowych, wysokiej wierności modeli NDD in vitro, w oparciu o naszą obecną wiedzę na temat biologii chorób. Technologia hiPSC stanowi obecnie jedyną dostępną technologię ludzką oparte na modelach, w których uchwycony zostaje pełny krajobraz genetyczny pacjentów.

Ponadto możliwość zastosowania technologii edycji genomu, takich jak CRISPR-Cas9, z wykorzystaniem hiPSC, umożliwiła wygenerowanie modeli izogenicznych do oceny precyzyjnych wariantów genetycznych. Oprócz skalowalności, hiPSC są samoodnawialne.

Zatem modele wywodzące się z hiPSC stanowią czołowy, obiecujący system do badań przedklinicznych. Co więcej, ludzka różnorodność genetyczna uchwycona w badaniu hiPSCcapacity pochodzącym od pacjenta sprawia, że ​​nadają się one do oceny podejść „medycyny spersonalizowanej”.

Możliwość skutecznego badania przesiewowego indywidualnych reakcji na leczenie i identyfikowania osób niereagujących lub słabo reagujących przed podaniem w warunkach klinicznych dodatkowo podkreśla przydatność modeli opartych na hiPSC do ocen przedklinicznych (ryc. 2).

Łącznie potencjalne informacje wygenerowane w wyniku badań przedklinicznych w modelach hiPSC są solidne, istotne dla pacjentów i niezbędne do wdrożenia w projektowaniu badań klinicznych (np. stratyfikacja uczestników badania) w celu poprawy dokładności wyników.

Pokonywanie ograniczeń modeli zwierzęcych

HiPSC oferują sposób na przezwyciężenie wielu problemów występujących w obecnych modelach zwierzęcych, jak omówiono wcześniej. Po pierwsze, modele wywodzące się z iPS stanowią platformę opartą na człowieku do oceny potencjalnych terapii w rzeczywistym krajobrazie genetycznym choroby ludzkiej.

Po drugie, pozyskując komórki od pacjentów, można obejść wiele problemów technicznych dotyczących najlepszego sposobu modelowania mutacji chorobowych u ludzi, ponieważ model zawiera unikalne tło genetyczne pacjenta. Po trzecie, komórki hiPSC są łatwo dostępne dla manipulacji genetycznych i farmakologicznych, co umożliwia wysokowydajne testy strukturalne i funkcjonalne oceniające fenotyp choroby.

W tym celu niedawno opracowaliśmy model neuronalny DA pochodzący z hiPSC uzyskany od pacjenta z PD z potrójną replikacją SNCA w celu oceny kompleksowego LV GT mającego na celu zmniejszenie poziomów SNCA. Nasza interwencja w LV skutecznie obniżyła poziomy SNCA i uratowała fenotypy związane z chorobą poprzez wytwarzanie reaktywnych form utleniających (ROS) i zachowanie żywotności komórek.140

Po czwarte, w porównaniu ze standardowym modelem gryzoni, wygenerowanie modeli opartych na hiPSC in vitro można osiągnąć w znacznie krótszym czasie, rzędu 30 dni, w przeciwieństwie do modeli zwierzęcych, które mogą wahać się od miesięcy do lat.

Po piąte, zgodnie z poprzednim punktem, modele oparte na hiPSC są znacznie tańsze i energochłonne niż modele na gryzonie, szczególnie biorąc pod uwagę bieżące obowiązki w zakresie utrzymania zwierząt i infrastrukturę, przepisy, a także wymogi dotyczące szkoleń i zgodności. Coraz bardziej ekonomiczne przedkliniczne modelowanie chorób zwiększa dostępność dla grup badawczych w celu oceny domniemanych terapii poprawiających przekładalność i ostatecznie poprawiających efektywność rozwoju DMT.202

W sumie te zalety dają modelom pochodzącym z PSC wyraźną przewagę w badaniu neurodegeneracji, a modele takie mogą potencjalnie generować nowe odkrycia, które były niedostępne w poprzednich modelach hodowli komórkowych i chorób zwierzęcych.

Omówione tutaj badania wykazują konieczność i wartość włączenia modeli 2D i 3D opartych na hiPSC do badań mechanistycznych NDD wyjaśniających czynniki związane z przyczyną choroby i szlakami patogenicznymi, a także do badań translacyjnych i badań nad odkrywaniem leków, takich jak identyfikacja i walidacja celów terapeutycznych .

Łącznie modele NDD wywodzące się z hiPSC stanowią krok naprzód w badaniach medycznych dzięki ulepszonemu modelowaniu chorób, które jest w znacznym stopniu wykonalne, przy stosunkowo krótszych eksperymentach, które są opłacalne i, co najważniejsze, dokładne i odpowiednie do modelowania chorób ludzkich.

Rysunek 2. Schemat ulepszonego procesu opracowywania leku DMT na NDD poprzez zwiększone włączenie i/lub substytucję modeli pochodzących z hiPSC Rozwój dowolnego domniemanego DMT rozpoczyna się od fazy odkrywania, która obejmuje zarówno identyfikację odpowiednich celów genowych, jak i mechanizmów choroby.

Kolejne modele chorób opracowywane są we wczesnej fazie przedklinicznej w celu zbadania patofizjologii chorób komórkowych i walidacji celów leków, a także wczesnych badań przesiewowych i optymalizacji wczesnych CGT-IP/DMT. Stopniowy rozwój DMT, obejmujący dalszy rozwój modelu i walidację celów, a także badanie skutków odbiegających od docelowych, następuje w środkowej fazie przedklinicznej.

W miarę postępu DMT dalsze informacje dotyczące aktywności farmakokinetycznej i farmakodynamicznej uzyskuje się w późnej fazie przedklinicznej. Zwiększone wykorzystanie modeli opartych na hiPSC na tych etapach stanowi atrakcyjne ulepszenie istniejącego procesu opracowywania leków z kilku powodów; mianowicie są opłacalne, wszechstronne i, co najważniejsze, przezwyciężają wiele wrodzonych ograniczeń istniejących zwierzęcych modeli NDD.

Na tym etapie można składać wnioski IND dla domniemanych DMT, które obecnie obejmują 4 krytyczne cele, które muszą zostać spełnione w przypadku każdego powstającego DMT, w szczególności CGT-IP: (1) wybór celu, (2) rozwój i optymalizacja związku wiodącego, (3) wstępna i zwiększanie schematu dawkowania oraz (4) ustalenie wykonalności i ROA.

Każdy z nich można dokładnie i odpowiednio dostosować, zastępując modele oparte na hiPSC w badaniach przedklinicznych. DMT mogą następnie uzyskać zgodę FDA na rozpoczęcie badań klinicznych.

Można uwzględnić włączenie modeli opartych na hiPSC do dodatkowej fazy 1a, co ułatwia lepszą selekcję kandydatów na etapie rekrutacji i identyfikację potencjalnych osób nie odpowiadających lub słabo odpowiadających na podstawie przedklinicznych badań genetycznych.

DMT o możliwym do wykazania bezpieczeństwie w fazie 1a przechodzą następnie przez badania kliniczne fazy 1, 2 i 3, po czym te o znaczącym pozytywnym działaniu otrzymują zgodę organów regulacyjnych na stosowanie nowych leków (NDA) i są dopuszczone do stosowania przez konsumentów pod ciągłym nadzorem nad bezpieczeństwem farmakoterapii w celu zidentyfikowania wszelkich wcześniej niezidentyfikowanych niekorzystne skutki w czasie.

Ograniczenia modeli in vitro pochodzących z hiPSC Czas i odtwarzalność

Technologie hodowli hiPSC pojawiły się w ciągu ostatniej dekady, a ich użyteczność w modelowaniu chorób i przedklinicznej ocenie przypuszczalnych DMT jest stosunkowo nowa.

Podobnie jak w przypadku każdej nowej technologii, próbując dokładnie odtworzyć biologiczną charakterystykę NDD, należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Przede wszystkim hodowla hiPSC oraz generowanie dokładnych i niezawodnych modeli komórkowych może być kosztowne, pracochłonne i czasochłonne. Weryfikacja linii hiPSC zgodnie ze standardem odpowiednim do badań medycznych kosztuje średnio od 10000 do 25 USD000.203

Procesy przeprogramowania, różnicowania i dojrzewania ulegają wydłużeniu. Przeprogramowanie komórkowe tkanki starterowej w hiPSC może zająć co najmniej 20–30 dni,151 a późniejsze różnicowanie i dojrzewanie komórek różni się w zależności od pożądanego typu komórek i zastosowanej metody; na przykład wytworzenie dojrzałych neuronów, astrocytów i mikroglekanu wymaga odpowiednio od 6 do 15 tygodni204 4 do 9 tygodni205,206 lub od 5 do 9 tygodni164,207.

W rezultacie badacze często wolą wykorzystywać komórki progenitorowe jako stabilne półprodukty do eksperymentów, ponieważ są one zasadniczo reprezentatywne dla typu komórek docelowych i można je wygenerować w krótszym czasie.204 Zatem ograniczenia czasowe i koszty wymagane do ustalenia systemu hiPSCmodel mogą budzą niepokój wielu grup badawczych.

Ponadto czas wymagany do rozwoju kluczowych fenotypów komórkowych związanych z chorobą w komórkach pochodzących z hiPSC jest również brany pod uwagę przy modelowaniu NDD. Podczas gdy objawy kliniczne i patologiczne ujawniają się przez dziesięciolecia życia pacjenta, fenotypy molekularne związane z chorobą w modelach pochodzących z hiPSC wykryto około 2 miesiące po dojrzewaniu.208

Niemniej jednak ograniczenia wynikają z ograniczonej żywotności modeli opartych na hiPSC w hodowli, która może nie wystarczyć do uzyskania pełnego obrazu przypominającego chorobę na poziomie komórkowym i tkankowym.

Strategie mające na celu przyspieszenie procesu różnicowania i dojrzewania, takie jak włączenie Notch i inhibitorów sekretazy g w celu skrócenia czasu dojrzewania209 oraz neurogeniny-2 (Ngn2) lub nadekspresji NeuroD1158, okazały się częściowo skuteczne i wprowadziły inne obawy związane z ekspresją ektopową.

Inne ograniczenia są związane z odtwarzalnością systemów w powtarzalnych eksperymentach i nieodłączną zmiennością między modelami, w tym niepowodzeniami dotyczącymi czystości kultur pochodzących z hiPSC i obecnością niepożądanych heterogenicznych populacji komórkowych.210

Dlatego ważne jest uwzględnienie heterogeniczności populacji komórek podczas stosowania modeli choroby pochodzących z hiPSC, szczególnie w badaniach przesiewowych i ocenie skuteczności DMT. Co więcej, donoszono, że kultury hiPSC wykazują niestabilność genomową i są podatne na nabywanie aberracji i mutacji genetycznych podczas ekspansji i przeprogramowania komórek.211

Należy także zachować ostrożność podczas stosowania linii izogenicznych generowanych różnymi technikami edycji genomu, ponieważ mogą wystąpić potencjalne efekty niepożądane (np. niezamierzona zmienność klonalna w obrębie linii izogenicznych i mutageneza poza celem).212,213 Dlatego ważne jest okresowe ocenianie stabilność genomowa hiPSC zapewnia rygorystyczne badania przesiewowe DMT.

Wyzwania w podsumowaniu sporadycznej patofizjologii NDD i fenotypów komórkowych

Złożoność NDD oraz brak kompleksowej charakterystyki i mechanistycznego zrozumienia ich fenotypów komórkowych stwarza wyzwania w zakresie możliwości podsumowania ich za pomocą modeli komórkowych, w tym systemów opartych na hiPSC.

Przyczyny NDD są złożone i wieloczynnikowe, obejmują wielogenowe czynniki ryzyka (tj. wielogeny i warianty), objawy epigenetyczne, starzenie się, płeć i czynniki środowiskowe, takie jak wyzwalacze stresu oksydacyjnego, z których niektóre są trudne do wywołania, szczególnie w niekończącej się liście różnych przyczyn. kombinacji w systemie laboratoryjnym.

Co więcej, większość modeli AD-PD wywodzących się z hiPSC pochodzi od pacjentów z mutacjami rodzinnymi, które stanowią jedynie bardzo mały odsetek wszystkich przypadków.214,215 Ponieważ mechanizmy leżące u podstaw postaci rodzinnej i sporadycznej mogą się różnić, istnieje potrzeba ustalenia modeli opartych na hiPSCs i fibroblasty uzyskane od pacjentów z sAD lub sporadyczną chorobą Parkinsona.

W tym celu w ostatnich latach pojawiły się inicjatywy dotyczące repozytoriów komórek pacjentów; obejmują one stosowane komórki macierzyste (ASC), Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (CiRA), rdzeń pluripotencjalnych komórek macierzystych Cedars Sinai Induced Pluripotencjalne komórki macierzyste, Europejski Bank indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (EBiSC), Koreański Narodowy Bank Komórek Macierzystych (KSCB), Narodowy Instytut Agingu (NIA) , Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru mózgu (NINDS), Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych (NIGMS) i Instytut Badawczy WiCell (WiCell) (Tabela S2).

Oczekiwany rozwój tych kolekcji ułatwi ustalenie modeli opartych na hiPSC, bardziej odpowiednich do badań powszechnych sAD i sporadycznych PD.

Niemniej jednak modele hiPSC pochodzące od sporadycznych pacjentów z NDD wytwarzają odpowiednie fenotypy komórkowe charakterystyczne dla AD181 i PD216 pod wpływem manipulacji środowiskowych, takich jak ekspozycja na neurotoksyny i chemiczna indukcja stresu oksydacyjnego.

Ponadto niedawne badanie ujawniło zmiany w ekspresji białek mitochondrialnych i podwyższony stres oksydacyjny w hiPSC generowanych przez pacjentów z sAD, pomimo wyraźnego braku patologii Ab i tau,217 co sugeruje, że modele hiPSC mogą ujawnić cenny wgląd w zniuansowaną patofizjologię specyficzną dla sporadycznych podtypów NDD.

Co więcej, w niedawnym badaniu Meyera i wsp.218 wykorzystano hiPSC pochodzące od pacjentów z sAD i stwierdzono, że poziom MAPT, kodujący białko tau, był znacząco podwyższony w komórkach pochodzących z sAD w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną.

Zatem pomimo tych wyzwań obecne modele wywodzące się z hiPSC są doskonałymi surogatami, które dają możliwość naśladowania patofizjologii choroby i ustalenia złotego standardu cech choroby z pełnymi podstawami genetycznymi u sporadycznych pacjentów, które można wykorzystać jako miary wyników w celu ulepszenia kolejnych modeli chorób.

For more information:1950477648nn@gmail.com