Droga do postępu w badaniach przedklinicznych chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem: perspektywa na modelach pochodzących od gryzoni i HiPSC, część 2

Oprócz modeli transgenicznych opracowywanych przez poszczególne laboratoria akademickie, Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) kieruje obecnie projektem Target Discovery and Preclinical Validation Project Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD), będącym konsorcjum wieloinstytucjonalnych i multidyscyplinarnych grantów które wspólnie zamierzają przyspieszyć proces odkrywania leków na AD (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

Wraz z szybkim rozwojem biotechnologii, technologia transgeniczna była stopniowo stosowana w dziedzinie biologii. Technologia transgeniczna to technologia inżynierii genetycznej, która wprowadza obce geny do organizmów, aby nadać im określone cechy. Jednakże pojawiły się kontrowersje dotyczące związku między modelami transgenicznymi a pamięcią.

Niektórzy badacze uważają, że modele transgeniczne mogą mieć pozytywny wpływ na pamięć. Na przykład niektóre eksperymenty na zwierzętach transgenicznych wykazały, że zmiana niektórych genów umożliwia poprawę zdolności uczenia się i pamięci zwierząt. Wyniki eksperymentów pokazują, że technologia transgeniczna może potencjalnie poprawić zdolności poznawcze człowieka.

Chociaż wyniki tych badań są bardzo interesujące, musimy również zachować ostrożność, ponieważ wyniki tych procesów eksperymentalnych nie są wynikiem awansu człowieka lub pochopnego zastosowania. Musimy przeprowadzić więcej badań nad tą technologią, aby zrozumieć jej potencjalne ryzyko dla środowiska i ludzi oraz zmierzyć jej możliwy wpływ społeczny. Jednocześnie musimy również przyznać, że poprawa pamięci nie zależy tylko od genów, ale także od zdrowia fizycznego i zdrowego trybu życia, dzięki normalnym kanałom można osiągnąć dobry stan pamięci.

Krótko mówiąc, powinniśmy patrzeć z niecierpliwością na pozytywne aspekty technologii transgenicznej oraz odpowiednio ją regulować i oceniać. Poprzez racjonalne wykorzystanie technologii transgenicznej możemy zmienić nasz genom, co pomoże nam rozwiązać niektóre problemy medyczne i środowiskowe, promując jednocześnie postęp człowieka w wielu dziedzinach, w tym poprawę pamięci. Można zauważyć, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwstarzeniowe, co może pomóc w zmniejszeniu utleniania i reakcji zapalnych w mózgu, chroniąc w ten sposób zdrowie organizmu. układ nerwowy. Ponadto Cistanche może również promować wzrost i naprawę komórek nerwowych, poprawiając w ten sposób łączność i funkcjonowanie sieci neuronowych. Efekty te mogą pomóc poprawić pamięć, zdolność uczenia się i szybkość myślenia, a także mogą zapobiegać występowaniu dysfunkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

Szczególnie istotna dla tego przeglądu jest część AMP-AD, nazwana inicjatywą Model Organism Development and Evaluationfor LOAD (MODEL-AD). Celem MODEL-AD jest wygenerowanie nowych transgenicznych linii myszy, które dokładnie modelują fenotypy AD i służą jako udoskonalona platforma dla procesu opracowywania leków oraz bardziej przetłumaczalnych i biologicznie istotnych modeli do przedklinicznej walidacji DMT.

Inicjatywa MODEL-AD składa się z Centrum przy Szkole Medycznej Uniwersytetu Indiana, Laboratorium Jacksona, Sage Bionetworks, Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Pittsburghu oraz centrum przy Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

Konsorcjum to zamierza wspólnie opracować następną generację modeli AD in vivo w oparciu o dane ludzkie w rygorystyczny i ściśle kontrolowany sposób. W ten sposób ma na celu dostosowanie cech patofizjologicznych modeli AD do odpowiednich stadiów choroby klinicznej przy użyciu możliwych do przełożenia biomarkerów w celu zwiększenia przekładalności wyników przedklinicznych.57

Do chwili obecnej wygenerowano 54 modele myszy AD, w tym myszy fAD, APOE, APP, MAPT/tau, a także modele LOAD oparte na akumulacji Ab i innych wcześniej zidentyfikowanych wariantach związanych z LOAD (https://www.model-ad.org /strain-table/), które są dostępne w JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Chemiczno-toksyczne modele AD

Oprócz nowszych modeli transgenicznych, modele gryzoni z AD historycznie opierały się na ekspozycji na toksyczne związki, które powodują selektywną neurodegenerację prowadzącą do zaburzeń poznawczych i behawioralnych podobnych do tych obserwowanych u pacjentów z AD.

Podczas gdy w badaniach zarówno AD, jak i PD zastosowano różne modele ekspozycji na toksyny, modele AD zostały w dużej mierze zastąpione nowszymi modelami transgenicznymi omówionymi powyżej.

Chemiczne modele ADindukują patologię podobną do AD, wykorzystując albo związki, które selektywnie i odwracalnie zakłócają aktywność neuronów cholinergicznych, albo toksyny, takie jak kwas okadaikowy i różne klasy metali ciężkich, które trwale zakłócają procesy homeostazy komórkowej prowadzące do śmierci komórki 58 (Tabela 2). Chociaż modele te powodują pewne deficyty neurologiczne i behawioralne przypominające objawy AD, w tym zaburzenia uczenia się i pamięci, w dużej mierze brakuje w nich zmian patologicznych AD (tj. blaszek Ab i NFT).

Modele zwierzęce, które wyraźnie koncentrują się na zaburzeniach neuronów cholinergicznych, opierają się na nieco przestarzałej cholinergicznej hipotezie AD.59 W takich modelach antagoniści receptora muskarynowego, na przykład złożona skopolamina, są dostarczani do docelowych obszarów mózgu, takich jak HP, w celu blokowania endogenną aktywność acetylocholiny i powodują upośledzenie funkcji poznawczych w zakresie uczenia się i pamięci.60

Inne modele interwencji chemicznej w AD obejmują miejscowe lub obwodowe podawanie neurotoksyn, prowadzące do nieswoistej śmierci komórek nerwowych61–64 (Tabela 2).

Transgeniczne modele PD

Podobnie jak w przypadku AD, transgeniczne mysie modele PD umożliwiają badanie klinicznych cech choroby wywołanych manipulacją loci genetycznymi związanymi z mendlowskimi postaciami choroby, a setki unikalnych linii są obecnie dostępne w sprzedaży.

Podobnie jak AD, większość klinicznych przypadków PD klasyfikuje się jako sporadyczne, a dziedziczne formy choroby stanowią mniej niż 1% wszystkich przypadków.89 Zmiany genetyczne w genach SNCA, LRRK2 i UCH-L1 są powiązane z autosomalnie dominującymi postaciami choroby PD, podczas gdy zmiany w genach PRKN, PINK1 i DJ-1 są powiązane z postaciami autosomalno-recesywnymi90 (Tabela 1).

Dwa geny najczęściej atakowane w transgenicznych modelach choroby Parkinsona to SNCA i LRRK2.91,92 Mutacje w tych genach powodują rodzinną chorobę Parkinsona i są również powiązane ze sporadyczną postacią choroby Parkinsona za pośrednictwem GWAS.93

Ponadto dobrze ustalono rolę nadekspresji SNCA w rodzinnej (przypadki potrójnej/duplikacji) i sporadycznej PD.94

Do chwili obecnej większość modeli transgenicznych manipulujących SNCA nie tylko wprowadza rodzinne mutacje zmiany sensu, ale także stosuje strategię nadekspresji poprzez wstawienie wielu kopii ludzkiego lub mysiego genu SNCA w celu naśladowania zwiększonej produkcji a-synukleiny (a-syn), samej lub w połączeniu z rodzinna mutacja zmiany sensu.95–97

Mutacja zmiany sensu w LRRK2 jest najczęściej opisywaną mutacją związaną z rodzinną chorobą Parkinsona,98 a na podstawie różnych znanych mutacji LRRK2 wygenerowano kilka transgenicznych linii myszy.

Na przykład mutacja GS2019S skutkuje mutacją wzmocnienia funkcji ze zwiększoną aktywnością kinazy.99 Inne modele, takie jak mutacje R1441C/G, T1348N i A2016T, opisują zmiany w ekspresji lub agregacji asyn, a w niektórych przypadkach: nominalne niedobory motoryczne; jednakże dokładne deficyty i cechy kliniczne znacznie się różnią w zależności od modelu.89,92,100

Oprócz genów SNCA i LRRK2, wygenerowano wiele innych linii transgenicznych, w których celem są inne geny związane z PD (Tabela 1). Podczas gdy wiele z tych modeli skutecznie zmienia ekspresję i agregację a-syn, większość wykazuje niewielką lub żadną neurodegenerację, w związku z czym funkcje motoryczne pozostają stosunkowo nienaruszone92 (Tabela 1).

Dokładna analiza agregatów a-syn wytwarzanych w wielu z tych linii transgenicznych ujawniła ponadto, że utworzone wtręty nie przypominają naturalnie występujących ciał Lewy'ego (LB) obserwowanych pośmiertnie w mózgach osób cierpiących na chorobę Parkinsona, lecz zamiast tego wykazują unikalny skład strukturalny.101

Niepowodzenie modeli transgenicznych w odtwarzaniu zarówno molekularnych, jak i neurodegeneracyjnych aspektów choroby Parkinsona jest prawdopodobnie spowodowane kombinacją kilku czynników. Najważniejszą z tych obaw jest to, że charakter i zakres zaangażowania genów powiązanych rodzinnie oraz bardziej powszechna, sporadyczna postać choroby pozostaje niejasna, co podaje w wątpliwość znaczenie modeli opartych na manipulacji tymi genami w zdecydowanej większości przypadków PD.

Innym ograniczeniem jest to, że modele transgeniczne powodują nadekspresję transgenu, który nie naśladuje poziomów fizjologicznych, a zatem może wprowadzać artefakty. Co więcej, sporadyczna postać choroby prawdopodobnie wiąże się ze zmianami w wielu genach, a na podatność dodatkowo wpływają elementy środowiska, co sugeruje, że monogeniczne modele transgeniczne mogą mieć ograniczoną użyteczność.

Ogólnie rzecz biorąc, wiele z tych samych problemów, które nękają transgeniczne modele AD, dotyczy modeli PD: obecnie brak jest zrozumienia dokładnej roli genów pochodzenia rodzinnego w etiologii PD oraz zakresu, w jakim przyczyniają się one do sporadycznych postaci choroby.

Te problemy sprawiły, że niezwykle trudno było stworzyć atransgeniczny model PD, który wiernie odtwarza akumulację a-syn i tworzenie LB, co z kolei prowadzi do wzorca neurodegeneracji i zaburzeń zachowania odpowiadających obserwowanym w populacjach klinicznych.

Obecne modele transgeniczne podsumowują tylko niektóre z tych cech, w wyniku czego udowodniono, że mają niewielką wartość predykcyjną w ocenie skuteczności potencjalnych DMT. Dla kontrastu, chemiczno-toksyczne modele PD są nadal szeroko stosowane ze względu na ich zdolność do wiernego odtwarzania selektywnej neurodegeneracji DA charakterystycznej dla PD.

Modele chemiczno-toksyczne PD

W ciągu ostatniego półwiecza do modelowania wzorca neurodegeneracji obserwowanego w chorobie Parkinsona stosowano szeroką gamę toksycznych związków. Spośród nich wyłoniono cztery modele uszkodzeń chemicznych, które są najczęściej wykorzystywane w badaniach przedklinicznych, a ich skutki zostały szczegółowo scharakteryzowane.

Należą do nich 6-hydroksydopamina (6-OHDA), analog katecholamin; 1-metylo-4-fenylo1,2,3,6-tetrahydropirydyna (MPTP), syntetyczny analog opioidu; rotenon, pestycyd; i parakwat, herbicyd102 (Tabela 2). Inny nietransgeniczny model PD opiera się na wstrzyknięciu wstępnie uformowanych włókienek (PFF; rekombinowane monomeryczne białka a-syn przekształcone w postać agregatu włóknistego) do mózgów zwierząt, co wywołuje hiperfosforylację endogennych białek a-syn i wywołuje patologię podobną do LB w SN pars Compacta (SNpc)87,88 (Tabela 2).

Te modele oparte na toksynach mogą indukować, w różnym stopniu, agregację a-syn i selektywną neurodegenerację neuronów DA w szlaku nigrostriatalnym, co jest zauważalną wadą ich odpowiedników w modelu transgenicznym.

Ścieżki zaangażowane w wywoływanie śmierci komórek i stopień utraty neuronów DA różnią się jednak znacznie w zależności od modelu, który szczegółowo omówiono w innym miejscu.103 Ostatecznie efektem utraty komórek DA w chorobie Parkinsona jest to, że jądra motoryczne prążkowia nie są już w stanie utrzymać normalne funkcje fizjologiczne, powodujące szeroki zakres upośledzenia zdolności motorycznych.

Jednakże utrata neuronów DA nigrostriatalnego sama w sobie nie jest modelem choroby Parkinsona per se, lecz naśladuje bardziej ogólny parkinsonizm charakteryzujący się szerszym spektrum objawów motorycznych.104

W tym momencie, chociaż niektóre modele oparte na toksynach, w tym PFF, przewlekłe MPTP i podawanie rotenonu, mogą indukować agregaty a-syn i tworzenie podobne do LB, różnią się one od charakterystycznych wtrąceń LB w PD i ogólnego rozmieszczenia tych agregatów nie odzwierciedla wzorca zaobserwowanego w PDbrains.102

Modele te mają również ograniczone możliwości modelowania postępującego charakteru choroby Parkinsona i rozprzestrzeniania się patologii na inne obszary mózgu, ponieważ pacjenci z chorobą Parkinsona w późniejszych stadiach choroby cierpią również na neurodegenerację w obszarach podkorowych, a ostatecznie w korowych.105

Podsumowując, modele oparte na ekspozycji na toksyny wykazują pewne podobieństwa do patologii obserwowanych w chorobie Parkinsona; jednakże mechanizm śmierci komórek wywołanej przez toksyny prawdopodobnie różni się od mechanizmu leżącego u podstaw utraty neuronów w PD.106,107 Warto zauważyć, że typowe schematy dawkowania w modelach PD z chemikaliami i toksynami trwają od dni do tygodni, podczas gdy przebieg PD rozwija się przez dziesięciolecia i postępuje w ciągu lata.

Ograniczenia te sugerują, że modele oparte na ekspozycji na toksyny, mające na celu wywołanie selektywnej śmierci neuronów DA w szlaku nigrostriatalnym, przedstawiają niepełny obraz PD i wyjaśniają, dlaczego próby identyfikacji DMT w takich modelach nie przyniosły skutku w badaniach klinicznych.12

Modele wektorów wirusowych dla PD i ADZalety systemów wektorów wirusowych

Systemy dostarczania wektorów wirusowych oferują kilka korzyści, które trudno osiągnąć innymi podejściami.108 Po pierwsze, systemy wektorów wirusowych zapewniają solidną kontrolę nad czasową ekspresją interesującego genu.

Po drugie, starzenie się jest głównym czynnikiem ryzyka zaburzeń ze spektrum AD-PD, a możliwość dostarczenia wektora w dowolnym momencie życia zwierzęcia stanowi główną zaletę przy projektowaniu badania. Po trzecie, wektory wirusowe wspierają lokalne dostarczanie i ekspresję transgenów, umożliwiając w ten sposób dokładne i specyficzne ukierunkowanie na interesujące obszary mózgu.

Po czwarte, precyzyjne manipulowanie dawkowaniem można łatwo osiągnąć przy użyciu wektorów wirusowych. Po piąte, interesujący model można stworzyć dla wielu gatunków zwierząt, od małych gryzoni po duże naczelne inne niż ludzie.

Po szóste, można łatwo dokonać różnych odmian genów, aby uzyskać interesujący fenotyp. Po siódme, wszechstronność i elastyczność różnych platform wektorowych wykorzystywanych do transferu genów za pośrednictwem wirusów do ośrodkowego układu nerwowego jest ogromna.

Systemy wirusowe, w tym rekombinowane wektory związane z adenowirusami (UAV) i wektory lentiwirusowe (LV), skutecznie i niezawodnie wspierają odpowiednio krótko- i długoterminową ekspresję genów, zarówno lokalnie, jak i globalnie. Wreszcie systemy oparte na wektorach wirusowych są znacznie bardziej ekonomiczne zarówno pod względem nakładu pracy, jak i kosztów, w porównaniu z innymi modelami chorób.

Modele wektorów wirusowych AD i PD: AAV i LV

Podejście oparte na wektorach wirusowych do modelowania fenotypów AD i PD in vivo zostało wykorzystane przez kilka różnych grup stosujących rAAV lub LV. Od czasu ich pierwszego zastosowania na początku tysiąclecia opracowano i wykorzystano różnorodne modele wirusowe w leczeniu AD.

We wstępnych modelach tauopatii AAV wykorzystano AAV2/2 do ekspresji ludzkiego białka P301L w mózgach myszy i szczurów.109,110 W tych badaniach wektor AAV-tau-P301L wstrzyknięto do podstawnej części przodomózgowia dorosłych szczurów, co doprowadziło do zwiększenia poziomu tau przez co najmniej 8 miesięcy po transdukcji. Co istotne, 3–4 tygodnie po transdukcji znaleziono hiperfosforylowane agregaty tauandu przypominające NFT.110,111

Badania te dostarczyły pierwszego dowodu na tezę, że wstrzyknięcie tau AAV-P301L może skutkować trwałą ekspresją białka i jego agregacją u myszy i szczurów.

Konsekwentnie, wstrzyknięcie AAV typu dzikiego (WT) lub potrójnie zmutowanego APP spowodowało utworzenie płytek Ab, ale nie spowodowało jawnej neurodegeneracji. Odkrycia te kontrastują z powyższymi obserwacjami, że AAV-WTtau lub AAV-P301L tau były zdolne do wywoływania znacznej neurodegeneracji neuronów piramidowych HP.112

W nowszych eksperymentach wykorzystano AAV2/5 do dostarczenia WT tau i wektora kontrolnego GFP do grzbietowej części HP starszych szczurów Fischer 344.113 Obydwa wirusy ulegały silnej ekspresji w neuronach HP i prowadziły do ​​nieprawidłowej struktury aksonów, degeneracji aksonów i fragmentacji tau w Aksony HP porównano z kontrolnymi aksonami wyrażającymi GFP, które wyglądały normalnie.

W innym modelu tau P301L wyrażane przez promotor ludzkiej synapsyny I zostało dostarczone przez wektor AAV2/9 do bocznej kory śródwęchowej, co umożliwiło autorom wykrycie wielu form fosforylowanych i zagregowanych wariantów tau przed utratą synaps ścieżek perforujących i neurodegeneracją.114

Dane te potwierdzają użyteczność podejścia opartego na AAV w leczeniu AD, szczególnie w modelowaniu wczesnych zmian patologicznych, takich jak zwyrodnienie i degradacja aksonów. W kilku badaniach wykorzystano modele wirusowe mające na celu wywołanie innych patologicznych aspektów LOAD.115,116 Na przykład AAV-BRI-Ab42 i Do kontrolowanej ekspresji i wydzielania peptydów Ab u gryzoni HP wykorzystano wektory AAV-BRI-Ab40.116

Warto zauważyć, że zwierzęta, którym wstrzyknięto AAV-BRIAb42-, wykazały, że wektory te są zdolne do indukowania tworzenia łysinek, ale nie zaobserwowano tego w przypadku ekspresji rAAV2/1-BRIAb40.

W innym badaniu AAV2/2 zastosowano do dostarczenia Ab40 i Ab42, C-końcowego fragmentu APP zawierającego peptydy Ab (C100) i mutanta V717F C100 do HP i móżdżku myszy.

Co ciekawe, mutanty Ab42 i V717F wykazały większą indukcję mikrogleju i przerwania bariery krew-mózg (BBB) ​​w porównaniu z formami Ab40, ale nie aktywowały tworzenia płytek, indukcji astrocytów ani neurodegeneracji. Wykorzystanie technologii AAV i LV do ekspresji różnych form Ab i jego prekursorów pozostanie podstawową metodą badania ich roli w LOAD.117

Niedawno LV wykorzystano do ekspresji TDP-43, Ab42 lub obu w korze ruchowej szczurów, co odkryło, że utrata TDP-43 implikuje mikroglej jako przyczynę zwyrodnienia synaptycznego obserwowanego w LOAD. 118

Co więcej, lenti-TDP-43 wywoływał zmiany w przetwarzaniu APP związane z wytwarzaniem Ab42 oraz indukował aktywność kaspazy i zapalenie układu nerwowego, które podobnie obserwowano w przypadku lenti-Ab42.

Połączona ekspresja białka TDP-43 i Ab42 dała wynik podobny do samego TDP-43, ale z dodatkową cechą utraty neuronów, co sugeruje możliwy efekt synergiczny między tymi dwoma czynnikami. Inne badanie wykorzystujące LV do ekspresji TDP-43 w korze ruchowej wykazało zmieniony metabolizm aminokwasów, stres oksydacyjny i śmierć neuronów.119

Wyniki te łącznie pokazują użyteczność systemów modeli AD opartych na LV do wyjaśnienia kluczowych czynników patogennych związanych z dysfunkcją białek związaną z AD, podczas gdy Ab i tau zostały szeroko przetestowane w LOAD, zgodnie z długo utrzymywanym poglądem, że Ab jest głównym podejrzanym w patogenezie AD . Niemniej jednak ciągłe niepowodzenia w badaniach leków mających na celu obniżenie poziomu amyloidu wymagają ponownego skupienia wysiłków na innych potencjalnych winowajcach.

Wiele niedawnych badań wykazało, że APOEε4 może przyczyniać się do toksyczności związanej z fenotypem AD i jak dotąd APOE pozostaje najważniejszym i powtarzalnym genetycznym czynnikiem ryzyka AD.120

Biorąc pod uwagę rolę APOEε4 w patogenezie AD i potencjalny efekt ochronny izoformy ε2, Hu i wsp.121 wygenerowali modele mysie, wykorzystując izoformy AAV8-APOE sterowane promotorem GFAP specyficznie wyrażanym w astrocytach we wszystkich obszarach mózgu, co spowodowało ogólny wzrost w poziomach APOE w całym mózgu myszy.

Nadekspresja APOEε4 za pośrednictwem wirusa u myszy APOEε4-TR zwiększała słabo lipidowane cząsteczki lipoproteiny APOE i zmniejszała cholesterol związany z APOE u myszy APOEε4-TR. I odwrotnie, nadekspresja APOEε2 w APOEε4-TR myszy wzmocniły lipidację APOE i związany z nią cholesterol.

Ponadto nadekspresja APOEε4 podniosła poziom endogennego Ab, podczas gdy nadekspresja APOEε2 wykazywała tendencję do obniżania endogennego Ab. Na podstawie tych danych autorzy sugerują, że zwiększanie APOEε2 w nośnikach APOEε4 jest korzystną strategią w leczeniu AD, podczas gdy zwiększanie APOEε4 w nośnikach APOEε4 jest szkodliwe. W innym badaniu przeprowadzono bezpośrednią iniekcję domózgową przy użyciu AAV w celu ekspresji APOEε2.

Badanie wykazało, że nadekspresja APOEε2 znacząco zmniejszała poziomy rozpuszczalnego (w tym oligomerycznego) i nierozpuszczalnego Ab w mózgu, jak również obciążenie amyloidem, w dwóch mysich modelach amyloidozy mózgu, w których patologia jest zależna od ekspresji mysiej lub ludzkiej izoformy APOEε4.122

Zhao i wsp.122 wykazali ponadto, że rozległą redukcję Ab w mózgu można osiągnąć poprzez pojedyncze wstrzyknięcie wirusa poprzez dostarczenie dowzgórza AAV wyrażającego APOEε2.

Łącznie dane te sugerują, że dostarczanie genu APOEε2 z AAV przy użyciu AAV może zapobiec szkodliwemu wpływowi APOEε4 na patologię amyloidu w mózgu; zatem podejście to może stanowić realną drogę terapeutyczną w leczeniu lub zapobieganiu LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com