Program fibrogenezy nerek jest kontrolowany przez mikroRNA regulujące metabolizm oksydacyjny

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc,d

Santiago Lamesa,**

a Program Procesów Fizjologicznych i Patologicznych, Centro de Biología Molecular „Severo Ochoa” (CSIC-UAM), 28049, Madryt, Hiszpania

b Zakład Genomiczny, Parque Científico de Madrid, Madryt, Hiszpania

c Klinika Patologii, Szpital Universitario „Ramn y Cajal”, IRYCIS, Madryt, Hiszpania

d Wydział Medycyny i Specjalności Medycznych, Fundacja Badawcza Szpitala Uniwersyteckiego „Príncipe de Asturias”, IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madryt, Hiszpania

Słowa kluczowe: MicroRNAS, zwłóknienie nerek, utlenianie kwasów tłuszczowych, macierz zewnątrzkomórkowa, CPT1A, mitochondria

Kulturystyka cistanche jest bardzo dobra dla funkcji nerek

A B S T R A C T

Nadmierna akumulacja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest cechą charakterystyczną chorób zwłóknieniowych. W nerkach jest to ostatnia powszechna droga chorób, która prowadzi do przewlekłej niewydolności nerek. Podczas gdy cytokiny, takie jak TGF, odgrywają fundamentalną rolę w transformacji miofibroblastów, ostatnie prace wykazały, że dysfunkcja mitochondriów i wadliwe utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO), które zagrażają głównemu źródłu energii dla komórek nabłonka kanalików nerkowych, są uważane za fundamentalne czynniki. do rozwoju i progresji zwłóknienia nerek. Doniesiono, że mikroRNA (miRNA), które regulują ekspresję genów po transkrypcji, kontrolują włóknienie nerek. Aby zidentyfikować miRNA zaangażowane w metaboliczne zaburzenia zwłóknienia nerek, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe macierzy miRNA w mysim modelu jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO). MiR-150-5p i miR-495-3p zostały wybrane ze względu na ich związek z patologią człowieka, ich rolę w metabolizmie mitochondrialnym i ich celowanie w enzym CPT1A transportujący kwasy tłuszczowe. Znaleźliśmy 2- i 4-krotność regulacji w górę odpowiednio miR-150-5p i miR-495-5p w obu modelach UUO i nefropatii wywołanej kwasem foliowym (FAN) , podczas gdy TGF- 1 podwyższał ich ekspresję w ludzkiej linii komórek nabłonka kanalików nerkowych HKC-8. Te miRNA działały w synergii z TGF- pod względem jego działania pro-zwłóknieniowego poprzez wzmocnienie markerów związanych z włóknieniem Acta2, Col1 1 i Fn1. Badania bioenergetyczne wykazały zmniejszenie wskaźnika zużycia tlenu związanego z FAO (OCR) w komórkach HKC-8 w obecności obu miRNA. Konsekwentnie, poziomy ekspresji ich genów docelowych związanych z mitochondriami CPT1A, PGC1 i mitochondrialnego czynnika transkrypcyjnego A (TFAM) zostały zmniejszone o połowę w komórkach nabłonka nerek narażonych na te miRNA. W przeciwieństwie do tego, nie wykryliśmy zmian w masie mitochondrialnej i potencjale transbłonowym (ΔѰm) ani produkcji anionu rodników ponadtlenkowych w mitochondriach. Nasze dane potwierdzają, że miR-150 i miR- 495 mogą przyczyniać się do fibrogenezy nerek poprzez nasilenie niewydolności metabolicznej, która jest krytycznie zaangażowana w komórki nabłonka kanalików, prowadząc ostatecznie do zwłóknienia.

1. Wstęp

Przewlekła choroba nerek (PChN) to stan kliniczny, w którym utrzymuje się pogorszenie czynności nerek. Powszechnie uważa się, że jest nieodwracalny i postępujący. Stanowi ważny problem zdrowia publicznego, który może dotyczyć 12–14 procent populacji ogólnej [1]. Może występować u około 30-40% pacjentów z wysoce rozpowszechnionymi patologiami, takimi jak cukrzyca i nadciśnienie, gdzie przyczynia się do dyktowania ewolucji i rokowania. Niezależnie od etiologii choroby, progresja PChN prowadzi do zwłóknienia kanalików śródmiąższowych i kłębuszków [2]. Zwłóknienie kanalikowo-śródmiąższowe obejmuje rozszerzenie przestrzeni między błoną podstawną kanalików a naczyniami włosowatymi okołokanalikowymi poprzez odkładanie się białek macierzy (ECM) (głównie kolagenu typu I i III oraz fibronektyny) w połączeniu z komórkami zapalnymi, utratą komórek kanalików i akumulacją miofibroblastów [3].

Transformujący czynnik wzrostu- (TGF- ) jest uważany za kluczową, wszechobecną cytokinę profibrotyczną i główny regulator różnicowania miofibroblastów w włóknieniu [4]. Ostatnie badania wykazały, że globalny defekt utleniania kwasów tłuszczowych (FAO), prowadzący do kompromisu w głównym źródle energii dla komórek nabłonka kanalików, odgrywa ważną rolę w rozwoju zwłóknienia nerek [5,6]. TGF- hamuje FAO w sposób zależny od SMAD3-i PGC1A, wpływając tym samym na transkrypcyjne regulatory wychwytu i utleniania kwasów tłuszczowych, w tym CPT1A [5]. Zmiany w FAO prowadzą ostatecznie do wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów i wyczerpania ATP, co prowadzi do zwłóknienia [5,7]. Strategie mające na celu przywrócenie zaburzeń metabolicznych funkcjonujących w PChN mogą więc dostarczać opcji terapeutycznych [8].

MikroRNA (miRNA) stały się kluczowymi regulatorami ekspresji genów dzięki ich działaniu na regulację potranskrypcyjną. W nerkach wykazano, że miR odgrywają kluczową rolę w nefrogenezie, homeostazie i chorobie [9]. MiRNA są również zdolne do regulowania procesów włóknienia i zostały nazwane „włóknieniem” [10]. Ponadto, ze względu na brak skutecznej terapii zapobiegającej lub odwracającej włóknienie nerek [11], zaproponowano manipulację ekspresją miRNA poprzez dostarczanie miRNA lub inhibitorów in vivo jako obiecującą strategię terapeutyczną dla PChN [12]. Ponadto krążące miRNA mogą stanowić biomarkery diagnostyczne, a nawet prognostyczne [13].

Kontrola zwłóknienia nerek za pośrednictwem MiRNA zachodzi głównie poprzez regulację sygnalizacji TGF- 1 w sposób zależny od komórki i kontekstu, wykorzystując szlak Smad jako jeden z głównych celów [14]. W poprzednich pracach zidentyfikowaliśmy kilka miRNA, które mają wpływ na zwłóknienie nerek poprzez regulację określonych szlaków metabolicznych [15,16]. Nadekspresja miR-9-5p zapobiega odróżnicowaniu komórek nabłonka kanalików nerkowych i przeprogramowuje zaburzenia metaboliczne związane ze zwłóknieniem [16], podczas gdy utrata funkcji miR-33, genetyczna lub farmakologiczna, powoduje zwiększenie FAO i zapobieganie akumulacji lipidów w komórkach nabłonka kanalików. Wiąże się to ze zwiększoną podażą energii, poprawą bioenergetyki mitochondrialnej oraz zapobieganiem eksperymentalnemu zwłóknieniu nerek [15]. Zatem miRNA regulujące bioenergetykę komórkową są również zdolne do regulowania fibrogenezy nerek. W tym badaniu zastosowaliśmy strategię opartą na macierzy miRNA w modelu jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) przewlekłego uszkodzenia nerek, aby zidentyfikować miRNA zaangażowane w fenotyp zwłóknienia nerek poprzez modyfikację szlaków metabolicznych. Wybierając kilka genów związanych z funkcją mitochondriów (CPT1A, TFAM, PGC1A), zidentyfikowaliśmy zarówno miR-150, jak i miR-495 jako miRNA zdolne do zmniejszania wskaźnika zużycia tlenu związanego z FAO (OCR) i promowania TGF{ {21}}indukowana transformacja fibrogenna w ludzkiej linii komórek nabłonka kanalików nerkowych HKC-8. Nasze odkrycia podkreślają znaczenie miRNA jako mitochondrialnych regulatorów metabolicznych zaangażowanych w fibrogenezę nerek.

2. Materiał i metody

Linie komórkowe i warunki hodowli. Ludzkie komórki nabłonkowe kanalików proksymalnych nerek (HKC-8) hodowano w DMEM/F12 (pożywka Eagle'a w modyfikacji Dulbecco 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) uzupełnionej 15 mM HEPES, 5% (vol/vol) płodowa surowica bydlęca (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml hydrokortyzonu (Sigma, St. Louis, MO), 50 jednostek/ ml penicyliny i 50 ug/ml streptomycyny (Gibco, Rockville, MD) w 37◦C i 5% CO2. Ta linia komórkowa została udostępniona dzięki uprzejmości laboratorium dr Susztaka (Philadelphia, Pennsylvania, USA). Traktowanie ludzkim rekombinantem 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) przeprowadzono po głodzeniu komórek HKC-8 bez surowicy przez 12 godzin.

Procedura transfekcji. Komórki wysiano na 60 mm szalki hodowlane do osiągnięcia 70 procent konfluencji . Zostały one transfekowane 40 nM miRNA naśladującym miR-150, miR-495 lub mirVana™ miRNA naśladującym kontrolę negatywną (firma Ambion, USA) przy użyciu lipofektaminy 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). . Komórki inkubowano z lipofektaminą-pre-miRNA w 37°C przez 6 godzin. Następnie do szalek hodowlanych dodano 5 ml świeżej pożywki zawierającej 10% FBS i komórki utrzymywano w hodowli przez 6 godzin do wykorzystania w kolejnych doświadczeniach. W przypadku kombinacji z traktowaniem TGF- 1, stosowano go do komórek po nadekspresji miRNA zgodnie z poprzednią sekcją.

Immunoblot. Komórki przepłukano w PBS, homogenizowano i poddano lizie w 100 µl buforu do lizy RIPA zawierającego 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1 procent dezoksycholanu sodu, 1 procent NP-40 i 25 mM Tris– HCl pH 7,6, w obecności proteazy (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) i inhibitorów fosfatazy (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i zebrano przez skrobanie. Ćwiartkę każdej próbki nerki (uzyskaną po rozcięciu na pół zarówno wzdłuż, jak i w poprzek) homogenizowano w 300 µl buforu RIPA z 5 mm kulkami ze stali nierdzewnej (Qiagen, Valencia, CA) przy użyciu TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) wibrując przy 50 Hz przez 15 min w 4°C. Próbki sklarowano przez odwirowanie przy 10 000 g przez 15 min w 4°C. Następnie osad odrzucono, a supernatant przechowywano jako lizat białkowy. Stężenia białka określono za pomocą zestawu BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL) i zmierzono w systemie Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Równe ilości białka (10-50 ug) z całkowitego ekstraktu rozdzielono na 8-10% żelach SDS-poliakrylamidowych i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (GE Healthcare, Chicago, IL) przy 12 V przez 20 min w półsuchym System Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia).

Błony zablokowano przez inkubację przez 1 godzinę z 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS zawierającym 00,5% Tween-20 i poddano blottingowi przez noc ze specyficznymi przeciwciałami: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4◦C przez noc), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4◦C przez noc), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 godz., temperatura pokojowa ). Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi IRDye 800 kozimi przeciwkróliczymi i IRDye 600 kozimi przeciw mysim (1:15 000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE), membrany zobrazowano w trzech powtórzeniach za pomocą Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Densytometrię pasmową przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ 1.48 (http://rsb.info.nih.gov/ij), a względną ekspresję białka określono przez normalizację do GAPDH. Zmiany krotności znormalizowano do wartości warunku kontrolnego.

Ekstrakcja RNA. Całkowity RNA wyekstrahowano z komórek HKC-8 lub nerek myszy przy użyciu zestawu miRNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Ilość i jakość RNA określono przy 260 nm za pomocą spektrofotometru Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Analiza ekspresji mRNA. Odwrotną transkrypcję (RT) przeprowadzono z 500 ng całkowitego RNA przy użyciu zestawu iScript™ cDNA Synthesis (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT-PCR przeprowadzono z użyciem iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), przy użyciu 96-dołkowego systemu Bio-Rad CFX96 RT-PCR z termocyklerem C1000 (Bio-Rad, Hercules, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Wartość Ct otrzymano z każdej krzywej amplifikacji przy użyciu oprogramowania do analizy CFX96 dostarczonego przez producenta. Względną ekspresję mRNA oznaczono metodą 2 − ΔΔCt [17]. Do normalizacji wykorzystano gen 18S. Sekwencje starterów użyte do oznaczenia ilościowego mRNA to: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: TGGAATCGTGGATTGGG: FW: TTCAATGGATTGACC, GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATCTTC: GATATCTCCATTGTAGGCATTC: AGTACTCCATTG Zmiany krotności znormalizowano do wartości warunku kontrolnego.

Kwantyfikacja ekspresji miRNA. Ilościową ocenę ekspresji miRNA przeprowadzono przy użyciu zestawu miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Dania). Po RT matrycę cDNA amplifikowano przy użyciu starterów LNA specyficznych dla mikroRNA dla dojrzałego miR150-5p lub miR-495-3p (Exiqon, Feedback, Dania). qRT-PCR przeprowadzono w 96-dołkowym systemie Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR z termocyklerem C1000 przy użyciu iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) zgodnie z instrukcjami producenta . Wartość Ct dla trzech powtórzeń studzienek otrzymano z każdej krzywej amplifikacji przy użyciu oprogramowania CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Wartości Ct znormalizowano do endogennego kontrolnego 5S rRNA. Poziomy miRNA w osoczu zostały znormalizowane do miR-103a-5p. Względną ekspresję miRNA oznaczono metodą 2 − ΔΔCt [17]. Zmiany krotności znormalizowano do wartości warunku kontrolnego.

Mysie modele zwłóknienia nerek. Myszy trzymano w ośrodku dla zwierząt bez specyficznych patogenów (SPF) w CBMSO zgodnie z przepisami UE dotyczącymi wszystkich procedur. Zwierzęta były traktowane zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych zawartym w Dyrektywie 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego. Zatwierdzenie zostało przyznane przez lokalną komisję etyczną Centro de Biología Molecular „Severo Ochoa” w Madrycie, komisję etyki w CSIC oraz jednostkę regulacyjną ds. procedur doświadczalnych na zwierzętach z Comunidad de Madrid.

Jednostronna niedrożność moczowodu (UUO): Zabieg chirurgiczny UUO wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem [18]. W skrócie, myszy znieczulono izofluranem (3-5 procent do indukcji i 1-3 procent do podtrzymania) i podzielono na dwie grupy eksperymentalne: grupę UUO i grupę pozorowaną. W grupie UUO myszy ogolono po lewej stronie brzucha, wykonano pionowe nacięcie skóry skalpelem i odciągnięto skórę. Wykonano drugie nacięcie przez otrzewną w celu odsłonięcia nerki. Lewy moczowód podwiązano dwukrotnie 15 mm poniżej miedniczki nerkowej jedwabiem chirurgicznym, a następnie przecięto moczowód pomiędzy dwoma podwiązkami. Następnie podwiązana nerka została delikatnie umieszczona z powrotem we właściwej pozycji anatomicznej i dodano sterylną sól fizjologiczną w celu uzupełnienia utraty płynu. Nacięcia zaszywano, a myszy umieszczano pojedynczo w klatkach. Operację pozorowaną przeprowadzono w podobny sposób, ale bez podwiązania moczowodu. Jako środek przeciwbólowy zastosowano buprenorfinę. Pierwszą dawkę podawano 30 min przed operacją, a następnie co 12 godzin przez 72 godziny w dawce 0,05 mg/kg podskórnie. W tym modelu nerkowy przepływ krwi i szybkość przesączania kłębuszkowego ulegają znacznemu zmniejszeniu w ciągu 24 godzin, a zapalenie śródmiąższowe (szczyt po 2-3 dniach), rozszerzenie kanalików, zanik kanalików i zwłóknienie są widoczne po 7 dniach. Zatkana nerka osiąga maksymalną dysfunkcję po około 2 tygodniach od zabiegu. Myszy uśmiercono przez przedawkowanie CO2, a próbki kontrolne i próbki krwi z niedrożnością nerki i krwi pobrano po perfuzji PBS 3, 5, 7, 10 i 15 dni po UUO.

Nefropatia wywołana kwasem foliowym (FAN): W tym modelu zwłóknienie nerki wywołano przez dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie 250 mg kwasu foliowego (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) na kg masy ciała rozpuszczonego w 0,3 M wodorowęglan sodu (nośnik), jak opisano wcześniej [19]. Zwierzęta kontrolne otrzymały 0,3 ml nośnika (ip). Myszy uśmiercono przez przedawkowanie CO2, a nerki i próbki krwi pobrano po perfuzji PBS po 15 dniach podawania FA.

profilowanie mikroRNA. Aby zidentyfikować specyficzne miRNA, które regulują wynik zwłóknienia, jako platformę profilowania mikroRNA wybrano macierz Custom miRCURY LNA microRNA (Exiqon, Feedback, Dania). Platforma ta składała się w sumie z 175 unikalnych testów specyficznych dla mysich miRNA obecnych w Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac., Wielka Brytania). Dla każdego mikroRNA do analizy wybrano dominującą nić. Wybór MiR oparto na przewidywanych genach docelowych związanych ze zwłóknieniem nerek, metabolizmem mitochondrialnym, procesami redoks i rytmem okołodobowym. Analizę tę przeprowadzono za pomocą narzędzi bioinformatycznych do przewidywania celu miRNA w oparciu o sekwencję, mikrokosmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org/vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) i miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Po ekstrakcji RNA z 7-dniowych próbek nerki UUO frakcję miRNA obecną w 20 ng całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Dania) zgodnie z instrukcjami producenta. Otrzymane cDNA analizowano za pomocą paneli miRCURY miRNA PCR w systemie Roche LightCycler 480 Real-Time PCR stosując miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Dania). Każdą próbkę analizowano w dwóch powtórzeniach. Procedurę tę przeprowadzono w Zakładzie Genomiki Fundacion Parque Científico de Madrid (Madryt, Hiszpania). Oprogramowanie LC480 zostało wykorzystane do uzyskania wartości Cq (Cq) dla każdego miRNA. Wartość delta Ct (ΔCt) obliczono normalizując wartości Ct do endogennego snRNAU6. Mapa cieplna została wygenerowana z danymi PCR w czasie rzeczywistym przedstawionymi jako ΔCt. Klasteryzacja hierarchiczna została zbudowana według wartości ΔCt. Wartość delta Ct (ΔΔCt) obliczono odejmując ΔCt grupy próbek odniesienia (nerka kontrolna) od ΔCt każdej próbki nerki z zablokowaniem. Względna kwantyfikacja (RQ) lub krotność zmiany każdego miRNA została wygenerowana przy użyciu metody 2 − ΔΔCt [17]. MiRNA o zróżnicowanej ekspresji zidentyfikowano za pomocą parametrycznego testu Limma. Aby uwzględnić testowanie wielu hipotez, wartości P zostały skorygowane (dostos.) za pomocą korekcji wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) Benjamini-Hochberg [25]. Wyniki przedstawiono na wykresie wulkanicznym.

Analiza miRNA w osoczu krwi pacjentów z CKD. Poziomy wybranych miRNA analizowano w próbkach osocza z kohorty 100 pacjentów z CKD, co opisano szczegółowo poniżej. Krew z żyły obwodowej zebrano w próżniowych pojemnikach próżniowych pokrytych EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ). Aby uzyskać osocze, krew wirowano przy 400 g przez 20 min, supernatant przeniesiono do nowej probówki i wirowano przy 800 g przez 20 min. Osocze zebrano i przechowywano zamrożone w porcjach w temperaturze -80◦C. Osocze miRNA wyekstrahowano z krwi przy użyciu zestawu miRCURYTM RNA Isolation Kit—Biofluids and UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Dania). Analizy poziomów miR-150 w tych próbkach przeprowadzono zgodnie z opisem w części dotyczącej procedury oznaczania ilościowego ekspresji miRNA. Pomiary szybkości zużycia tlenu. Współczynnik zużycia tlenu związanego z utlenianiem kwasów tłuszczowych (OCR) (związany z fosforylacją oksydacyjną) oraz tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) (związane z produkcją mleczanu i glikolizą) badano za pomocą analizatora metabolicznego Seahorse Bioscience zgodnie z instrukcjami producenta [26]. Komórki HKC-8 wysiano na płytkę p60 i przeprowadzono transfekcję mikroRNA, jak opisano powyżej, gdy osiągnęły one 70 procent konfluencji 48 godzin później, komórki HKC-8 potraktowano 10 ng/ml TGF{{ 18}} przez 48 godz. Następnie komórki wysiano w ilości 2 x 104 komórek na studzienkę w mikropłytce do hodowli komórkowej Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Po przywieraniu komórek, pożywkę hodowlaną zastąpiono pożywką o ograniczonym podłożu, pożywką Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM) uzupełnioną 0,5 mM glukozą i 1 mM glutaminianem. Godzinę przed pomiarem testu komórki inkubowano z pożywką testową Krebs-Henseleit Buffer (KHB) uzupełnioną 0,2% karnityną w 37°C bez CO2. Piętnaście minut przed testem do odpowiednich studzienek dodano 400 µM inhibitora CPT1 Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i komórki inkubowano w 37°C bez CO2. Na koniec, bezpośrednio przed testem, dodano BSA lub 200 µM substrat palmitynian-BSA FAO (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Natychmiast przeprowadzono test stresu XF Cell Mito Stress w analizatorze energii Seahorse XFe24, dodając kolejno kilka modulatorów funkcji mitochondriów. Najpierw po pomiarze podstawowym zastosowano inhibitor syntazy ATP oligomycynę (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Zmniejsza to przepływ elektronów przez ETC, powodując zmniejszenie oddychania mitochondrialnego. Następnie dodano środek rozprzęgający cyjanek 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), który załamuje gradient protonów i zaburza potencjał błony mitochondrialnej. W rezultacie przepływ elektronów przez ETC jest niezahamowany, a zużycie tlenu przez kompleks IV osiąga maksimum. Trzecia i ostatnia iniekcja jest mieszaniną inhibitorów kompleksu III i I antymycyna/rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Ta kombinacja wyłącza oddychanie mitochondrialne i umożliwia obliczenie oddychania niemitochondrialnego napędzanego przez procesy poza mitochondriami. Substraty/inhibitory przygotowano w tej samej pożywce, w której przeprowadzono doświadczenie, i wstrzykiwano je automatycznie z portów odczynników we wskazanych czasach. Pomiary rejestrowano przez 3-min okresy czasu (w całkowitym okresie 2 godzin) i wartości normalizowano dla całkowitej zawartości białka. Białko wyekstrahowano ze studzienek 0,1% roztworem NP-40-PBS i oznaczono ilościowo za pomocą testu białka BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Dla każdej grupy doświadczalnej zastosowano cztery dołki. Test Seahorse XFp Cell Mito Stress Test został wykorzystany do określenia kluczowych parametrów funkcji mitochondriów: podstawowe oddychanie mitochondrialne, oddychanie związane z ATP, wyciek protonów (zużycie tlenu niezwiązane-- z ATP), oddychanie maksymalne, oddychanie niemitochondrialne i rezerwową pojemność oddechową, jak opisano wcześniej [27].

Test lucyferazy. Aby scharakteryzować kandydujące miejsca wiązania miRNA-150 i miRNA-495 w ludzkim CPT1A 3′-UTR, test reporterowy lucyferazy zawierający CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347). Ukierunkowane mutacje w regionach nasiennych przewidywanych miejsc miR-150 i miR-495 w obrębie 3′ - UTR zostały wygenerowane przy użyciu zestawu do ukierunkowanej mutagenezy Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) zgodnie z zgodnie z protokołem producenta. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CCTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Wszystkie konstrukty zostały zsekwencjonowane przed użyciem, aby potwierdzić, że mają prawidłową strukturę. Komórki HKC-8 wysiano na płytce z dołkami ap24- i przejściowo kotransfekowano 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (nienaruszone lub zmutowane konstrukcje) i 4 ng pGL3-Promotor (lucyferaza świetlika pod kontrolą promotora SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) plazmidów reporterowych i 40 nM miRNA miRNA naśladującego miR-150, miR -495 lub kontrola negatywna naśladująca miRNA mirVana™ (firma Ambion, USA) przy użyciu lipofektaminy 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), gdy osiągnęły konfluencję wynoszącą 70 procent, jak opisano powyżej. Dla każdej grupy doświadczalnej zastosowano cztery dołki. Testy lucyferazy przeprowadzono 24 godziny później przy użyciu systemu reporterowego Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI). Sygnały lucyferazy waniliowej i świetlika wykrywano stosując system detekcji Glomax multi (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Aktywność lucyferazy z renilli normalizowano przez aktywność lucyferazy świetlika.

Potencjał błony mitochondrialnej (MMP). Zmiany w MMP określono jako różnice we fluorescencji estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Gromadzi się w ujemnie naładowanych spolaryzowanych mitochondriach i fluoryzuje na pomarańczowo. Kiedy potencjał błony mitochondrialnej załamuje się w komórkach poddanych stresowi apoptotycznemu lub metabolicznemu, odczynnik TMRM jest rozproszony w cytozolu komórki, a poziom fluorescencji dramatycznie spada. Komórki HKC-8 hodowano i transfekowano, jak opisano w sekcjach dotyczących hodowli komórek i procedury transfekcji. Następnie pożywkę hodowlaną zastąpiono zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) wolnym od czerwieni fenolowej z 10 mM Hepes. Traktowanie oligomycyną (5 μM) i FCCP (4 μM) przez 5 min zastosowano jako warunki kontroli pozytywnej i negatywnej. Następnie komórki barwiono 250 nM TMRM przez 30 min w 37°C. Komórki zebrano trypsyną, odwirowano (3000 obr./min, 5 min) i osad ponownie zawieszono w 200 μl HBSS z 1 procentem Albumina surowicy bydlęcej (BSA) i 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Intensywność fluorescencji mierzono metodą cytometrii przepływowej przy długości fali emisji 570 nm dla TMRM (FL2) [28] w systemie BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland , LUB). Dla każdych warunków doświadczalnych, co najmniej 20 000 singletów analizowano w trzech powtórzeniach.

Produkcja anionu rodników nadtlenkowych w mitochondriach. Ocenę produkcji anionu nadtlenkowo-rodnikowego przeprowadzono za pomocą wskaźnika anionowego mitochondrialnego nadtlenkoworodnikowego Mito-SOX™ Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wysoce selektywnego barwnika fluorogennego dla mitochondrialnego anionu rodnikowego nadtlenkowego w żywych komórkach, zgodnie z danymi producenta. instrukcje. Komórki HKC-8 hodowano i transfekowano, jak opisano w sekcjach dotyczących hodowli komórek i procedury transfekcji. Następnie pożywkę hodowlaną zastąpiono zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) wolnym od czerwieni fenolowej z 10 mM Hepes. Traktowanie antymycyną A (150 μM) i karbonylcyjankiem m-chlorofenylohydrazonem (CCCP) (50 μM) przez 5 minut zastosowano jako warunki kontroli pozytywnej i negatywnej. Następnie komórki barwiono 5 µM MitoSOX™ Red przez 30 min w 37°C. Komórki zebrano w sposób opisany w części dotyczącej potencjału błony mitochondrialnej. Intensywność fluorescencji mierzono metodą cytometrii przepływowej przy długości fali emisji 580 nm dla MitoSOX™ Red (FL2) w systemie BD FacsCanto™ II (BD Bioscience, San Jos, CA) i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland, LUB). Dla każdych warunków doświadczalnych, co najmniej 20,000 singletów analizowano w trzech powtórzeniach.

Znakowanie mitochondrialne. Ocenę zawartości mitochondriów przeprowadzono za pomocą MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), który biernie dyfunduje przez błonę plazmatyczną i kumuluje się w aktywnych mitochondriach niezależnie od potencjału błony mitochondrialnej, zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki HKC-8 hodowano i transfekowano, jak opisano w rozdziałach dotyczących hodowli komórek i procedury transfekcji. Następnie pożywkę hodowlaną zastąpiono zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) wolnym od czerwieni fenolowej z 10 mM Hepes. Komórki barwiono 150 nM z MitoTracker™ green FM przez 30 min w 37°C. Do analizy metodą cytometrii przepływowej, komórki zbierano jak opisano w części dotyczącej potencjału błony mitochondrialnej. Intensywność fluorescencji mierzono przy długości fali emisji 516 nm dla MitoTracker™ green FM (FL1) w systemie BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC , Ashland, OR). Dla każdych warunków doświadczalnych, co najmniej 20 000 singletów analizowano w trzech powtórzeniach. W celu obrazowania fluorescencyjnego jądra barwiono również DAPI (Sigma, St. Louis, MO) przez 5 min w temperaturze pokojowej. Żywe komórki wizualizowano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 710 z obserwowaną komórką, obiektywem 63X/1,2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 i analizowano za pomocą oprogramowania Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Niemcy). .

Określanie liczby kopii mitochondrialnych. Genomowy DNA wyekstrahowano z komórek HKC-8 przy użyciu zestawu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Obfitość mitochondriów określano za pomocą zestawu Human Mitochondrial DNA Copy Number Assay Kit (Detroit R&D, Detroit, MI). Względną liczbę kopii mtDNA przedstawiono jako stosunek mtDNA do DNA jądrowego.

Próbki od pacjentów z PChN. Do analizy stężeń miRNA w osoczu wybrano kohortę 100 pacjentów z PChN (stadium 3–4) ze szpitala Principe de Asturias. Obejmował dwie różne podgrupy sklasyfikowane według ewolucji ich funkcji nerek na podstawie wskaźnika GFR MDRD [29] w okresie 24 miesięcy: 50 pacjentów wykazało mniej niż 10 procentnerkapogorszenie funkcji, podczas gdy pozostali doświadczyli co najmniej 40-procentowego zmniejszenia czynności nerek lub rozpoczęli;nerkowyterapia zastępcza (dializa). Określiliśmy również ilościowo stopień zwłóknienia wnerkabiopsje z innej kohorty 26 pacjentów z dysfunkcją przeszczepu ponerkaprzeszczep ze szpitala Ramn y Cajal. Wszystkie biopsje oceniano zgodnie z kryteriami Banff 2007 [30].

Analiza statystyczna. Dane analizowano za pomocą testów nieparametrycznych, chyba że wskazano. Różnicę między dwiema niezależnymi grupami zbadano testem Manna-Whitneya, podczas gdy więcej niż dwie grupy porównano testem Kruskalla-Wallisa. Wartość P wynosząca 0.05 lub mniej została uznana za statystycznie istotną (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" dane="" analizowano="" przy="" użyciu="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" dane="" są="" przedstawiane="" jako="" średnia="" ±="" błąd="" standardowy="" średniej="">

3. Wyniki

Dane dotyczące ekspresji miRNA w zwłóknieniu wywołanym przez UUOnerki. Aby rozszyfrować udział miRNA w regulacji metabolicznejnerkowyfibrogeneza, 7-dniowy model UUO przeprowadzono u myszy WT. RNA wyizolowano z kontroli i zwłóknienianerkapróbki i profil ekspresji miRNA analizowano w dostosowanej macierzy mikroRNA. Wybór miRNA oparto na ich potencjalnym ukierunkowaniu na kluczowe enzymy biorące udział w metabolizmie mitochondrialnym, procesach redoks i rytmie okołodobowym po analizie „in silico” (więcej szczegółów w rozdziale Metody). Mapa cieplna ujawniła wyraźnie odrębne wzorce ekspresji w niektórych miRNA podczas porównywania włóknistych i kontrolnychnerkapróbki (rys. 1A). Analiza wykresu wulkanu wykazała, że ​​73 ze 175 miRNA było różnie wyrażanych, 17 w górę i 56 w dół, w próbkach włóknistej nerki w porównaniu z próbkami kontrolnymi (ryc. 1B, tabela uzupełniająca 1). Wśród nich wybrano specyficzne miRNA, które mogą regulować zwłóknienie w nerkach poprzez szlaki metaboliczne. W tym celu przeprowadzono analizę in silico 3′UTR (region nieulegający translacji) określonych genów zaangażowanych w funkcje metaboliczne i mitochondrialne, CPT1A, TFAM, PGC1A przy użyciu trzech niezależnych narzędzi prognostycznych (Targetscan, miRWalk i miRanda). Kryteria selekcji obejmowały również poziom ekspresji w nerkach, nowość celów, stopień znajomości szlaku metabolicznego i znaczenie biologiczne. Związek z ludzką patologią, poziomem ekspresji w tkankach nerkowych, ich rolą w metabolizmie mitochondrialnym i potencjalnym ukierunkowaniem na enzym CPT1A transportujący kwasy tłuszczowe zachęciły nas do skupienia się na trzech miRNA, miR-150-5p, miR-495-3p i miR-33-5p, jako kandydaci zdolni do regulowania zmian metabolicznych związanych z włóknieniem nerek (ryc. 1C). Warto zauważyć, że CPT1A 3′-UTR zawiera jedno miejsce nasienne dla miR-150 i dwa miejsca nasienne dla miR-495. Zaobserwowaliśmy, że miR-150 i miR-495 zmniejszyły aktywność testu reporterowego lucyferazy zawierającego CPT1A 3′-UTR odpowiednio o ~15% i 25%. Ta regulacja w dół została całkowicie zniesiona w przypadku mutacji punktowych (PM) w 3'-UTR CPT1A dla miejsca wiązania miR-150 (PM2) i częściowo nieobecna w obu miejscach wiązania miR-495 (PM1 i PM3) (rysunek uzupełniający 1A i B). Dane te wskazują na bezpośrednią interakcję CPT1A z miR-150 i miR-495. MiR-33-5p był przedmiotem odrębnego badania [15]. MiR-150-5p i miR-495-3p były podwyższone w próbkach włóknistych nerek w porównaniu z próbkami kontrolnymi, ze zmianą krotności 3,69 (wartość P: 0.012 ) i 1,95 (wartość p: 0,012).

MiR-150 i miR-495 wzmacniają odpowiedź profibrotyczną TGF u człowiekanerkowykomórki nabłonka rurkowego. Przeprowadzono ilościową reakcję łańcuchową odwrotnej transkrypcji-polimerazy (qRT-PCR) w celu potwierdzenia zmiany ekspresji miR-150-5p i miR-495-3p, która została zidentyfikowana przez profilowanie ekspresji miRNA w UUOnerkapróbki (rys. 2A i B). Dodatkowo analizowano kinetykę ekspresji miR-150-5p i miR- 495-3p w nerkach 3, 5, 7, 10 i 15 dni po zabiegu UUO za pomocą qRT-PCR. Ekspresja tych miRNA była znacząco 2-krotnie zwiększona 5 dni po UUO i pozostała podwyższona 15 dni po UUO (ryc. 2C i D). Poziom ekspresji tych miRNA oceniano również w modelu nefropatii kwasu foliowego (FAN). Znaleźliśmy 4- i 2-krotną regulację w górę odpowiednio miR-495-3p i miR-150-5p w zwłóknieniunerkapróbki z modelu FAN (rys. 2E). TGF- 1, jeden z głównych regulatorów fibrogenezy, również indukował ekspresję miR-150 i miR-495 w komórkach HKC-8 ponad 2-krotnie i {{ 6}}krotnie, odpowiednio, po 48 godzinach, potwierdzając potencjalną rolę tych miRNA w zdarzeniach związanych z sygnalizacją TGF (ryc. 3A i B). Aby ocenić, czy miR-150 i miR-495 były zaangażowane w profibrotyczną transformację komórek nabłonka kanalików przez TGF- 1, ludzka linia komórkowa HKC-8 została transfekowana miR -150-5p lub miR-495-3p i leczony TGF- 1 przez różne czasy. Zwiększenie poziomów miR-150-5p i miR-495-3p znacząco zwiększyło ekspresję poziomu mRNA indukowanego przez TGF- 1- dla markerów związanych z włóknieniem Acta2, Col1 1 i Fn1 ( Rys. 3C i D). Podobnie, nadekspresja miR-150-5p lub miR-495-3p silnie obniżyła CPT1A i zwiększyła obfitość białka -SMA (Fig. 3E i F). Dane te sugerują, że te miRNA mogą uczestniczyć w patogenezienerkowyzwłóknienie poprzez promowanie zależnego od TGF- 1-odróżnicowania nabłonkowego komórek kanalików, a także przez upośledzenie ekspresji krytycznego enzymu zaangażowanego w FAO.

MiR-150 i miR-495 indukują zmiany bioenergetyczne mitochondriów i zmniejszają ekspresję genów zaangażowanych w kluczowe funkcje mitochondriów. Aby uzyskać wgląd w konsekwencje metaboliczne wywołane podaniem miR-150-5p lub miR-495-3p, zbadaliśmy profil bioenergetyczny człowiekanerkowykomórki nabłonka rurkowego.

Ryc. 1. Dane dotyczące ekspresji miRNA w zwłóknieniu indukowanym UUO. (A) Mapa cieplna pokazująca względną ekspresję miRNA kontralateralnego i zablokowanegonerkimyszy C57/BL6-J poddanych procedurze UUO przez 7 dni (n=6). Skala waha się od zielonego do czerwonego (wyrażenie od wysokiego do niskiego), a liczby reprezentują wartości ΔCt. Po lewej stronie wskazano miRNA wybrane do badania. (B) Analiza wykresu wulkanicznego miRNA modulowanych przez UUO. Log10 względna kwantyfikacja (RQ) i ujemna (-) skorygowana (dostos.) log10 wartości P są wykreślone odpowiednio na osiach x i y. Każde miRNA jest reprezentowane przez kropkę. 73 ze 175 miRNA wykazywało zmienioną ekspresję w próbkach zwłóknionych (przystosowana wartość P Większa lub równa 0,05). Podkreślono wybrane miRNA do dalszej analizy. (C) miR-150-5p i miR-495-3p zostały wybrane na podstawie ich zdolności do celowania in silico genów CPT1A, TFAM i PGC1A. Dla każdego wybranego mikroRNA, konserwatywnych miejsc docelowych nasion w 3'UTR tych genów, wskazano ich krotność zmiany i istotność (dostos. wartość P).

Rys. 2. Poziomy ekspresji miR-150-5p i miR-495-5p innerkiz modeli UUO i FAN. (A, B) Analiza qRT-PCR ekspresji miR-150-5p (A) i miR-495- 3p (B) wnerkiod myszy 7 dni po UUO w próbkach wcześniej analizowanych za pomocą macierzy mikroRNA. (C–E) Analiza qRT-PCR ekspresji miR-150-5p i miR-495-3p po modelu FAN (C) oraz 3, 5, 7, 10 i 15 dni po UUO dla miR-150-5p (D) i miR{{10}p (E). Wykresy słupkowe przedstawiają średnią krotności zmian poziomów ekspresji ± sem od 6 (A, B, E) i 3 (C i D) myszy na grupę. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" w="" porównaniu="" z="" odpowiadającymi="" im="" warunkami="" kontrolnymi;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" w="" porównaniu="" do="">nerkiod myszy z takim samym eksperymentalnym leczeniem.

Jako modelową cytokinę zaangażowaną w zmiany profibrotyczne zastosowano TGF- 1. Aby określić stan bioenergetyczny tych komórek, podczas sekwencyjnego leczenia związkami, które modulują aktywność mitochondriów w obecności palmitynianu, zmierzono wskaźnik zużycia tlenu związanego z FAO (OCR) i wskaźnik pozakomórkowego zakwaszenia (ECAR) komórek HKC-8. , przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XF24 (więcej szczegółów w rozdziale Metody). Po 48 godzinach z TGF- 1, komórki HKC-8 w obecności miR-150-5p wykazywały stały spadek podstawowego OCR związanego z generowaniem ATP, oddychania związanego z ATP i oddychania maksymalnego, co odnosi się do OCR wrażliwego na FCCP (rys. 4A). Upośledzenie OXPHOS zostało odzwierciedlone przez zmniejszenie zawartości ATP w komórkach HKC-8 z nadekspresją miR-150-5p (Fig. 4C). Nie zaobserwowaliśmy, aby te miRNA indukowały zmiany w ECAR (dane nie pokazane). Zgodnie z tym, poziomy ekspresji mRNA ich mitochondrialnego-

powiązane geny docelowe CPT1A, PGC1 i mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (TFAM) były zmniejszone o połowę w komórkach traktowanych miR-150 naśladującym w porównaniu do komórek naśladujących miRNA traktowanych NC (ryc. 4E). Badania przy użyciu tego samego podejścia eksperymentalnego z miR-495-3p dały podobne wyniki (ryc. 4B, D, F). Jednak masa mitochondrialna, określona na podstawie liczby kopii mtDNA i barwienia mitochondriów za pomocą MitoTrackerTM green FM, nie była znacząco modulowana przez miRNA-150 i miRNA- 495 zarówno w warunkach podstawowych, jak i przy traktowaniu TGF. Zasadniczo zaobserwowano tendencję spadkową tego parametru (rysunek uzupełniający 2A, B, C). Ogólnie rzecz biorąc, dane te potwierdzają, że miR-150 i miR-495 promują a

działanie profibrotyczne w komórkach nabłonka kanalików poprzez upośledzenie funkcji mitochondriów.

MiR-150 i miR-495 nie zmieniają mitochondrialnego potencjału przezbłonowego (ΔѰm) ani mitochondrialnego rodnika ponadtlenkowego

Ryc. 3. MiR-150 i miR-495 wzmacniają zależną od TGF- 1- odpowiedź profibrotyczną u ludzinerkowykomórki nabłonka rurkowego. (A, B) Analiza RT-PCR ekspresji miR{{0}}p (A) i miR-495-3p (B) w komórkach HKC-8 traktowanych 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 dla wskazanych czasów. (C, D) poziomy mRNA alfa-aktyny mięśni gładkich (-SMA), kolagenu typu alfa 1 -1 (Col1 1), fibronektyny (FN) z komórek transfekowanych miR-NC i naśladującym miR -150-5p (C) lub miR-495-3p (D) określono metodą qRT-PCR z użyciem zieleni Sybr. Komórki traktowano TGF- 1 (10 ng/ml) po nadekspresji miRNA tam, gdzie wskazano (patrz również rozdział Metody). (E, F) Immunobloty przedstawiające poziomy CPT1A i -SMA poziomy białka w komórkach transfekowanych miR-NC i naśladującym miR-150-5p (E) lub miR{{20}p (F) dla we wskazanych punktach czasowych. Do normalizacji wykorzystano GAPDH. Wykresy słupkowe (prawe panele) przedstawiają średnią ekspresji krotności zmiany ± sem z 3 niezależnych eksperymentów. *P < {{30}},05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" w="" porównaniu="" z="" odpowiadającymi="" im="" warunkami="" kontrolnymi;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" w="" porównaniu="" z="" komórkami="" traktowanymi="" mir-nc="" w="" tych="" samych="" warunkach="">

Fig. 4. MiR-150 i miR-495 wzmacniają indukowaną przez TGF 1- represję FAO w komórkach HKC-8. (A, B) Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) komórek HKC-8 transfekowanych

40 nM miR-NC i naśladować miR-150-5p (A) lub miR-495-3p (B) i wystawione na 10 ng/ml TGF{{5} } po nadekspresji miRNA (patrz także sekcja dotycząca metod). Wykresy słupkowe (prawe panele) pokazują wskaźniki OCR związane z pojemnością podstawową, przeciekiem protonów, połączoną z ATP, maksymalną i rezerwową oraz stanami oddechowymi niemitochondrialnymi. Dane są reprezentowane po normalizacji według ilości białka. (C, E) Poziomy ATP w komórkach HKC-8 transfekowanych miR-NC i naśladujących miR-150-5p (C) lub miR-495-3p (E). (D, F) Poziomy mRNA CPT1A, PGC1A i TFAM w komórkach HKC-8 transfekowanych miR-NC i mimicznym miR-150-5p (D) lub miR-495-3p (F) były określane przez qRT-PCR przy użyciu zieleni Sybr. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią ± sem 4 niezależnych eksperymentów. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" w="" porównaniu="" z="" odpowiadającymi="" im="" warunkami="" kontrolnymi;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" w="" porównaniu="" z="" komórkami="" traktowanymi="" mir-nc="" w="" tych="" samych="" warunkach="">

produkcja anionów. Potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) generowany przez pompy protonowe (Kompleksy I, III i IV) jest niezbędnym składnikiem w procesie magazynowania energii podczas fosforylacji oksydacyjnej. Zwiększony ΔѰm może prowadzić do mitochondrialnych zaburzeń redoks, podczas gdy jego spadek powoduje zmniejszenie produkcji ATP, pogarszając żywotność komórek [254]. Anion rodnika ponadtlenkowego (O2•− ) jest wolnym rodnikiem, który może powstawać w mitochondriach w wyniku wycieku elektronów, który może wystąpić w kilku etapach ETC. Generowanie O2•− w macierzy mitochondrialnej również w sposób krytyczny zależy od stosunków NADH/NAD plus i CoQH2/CoQ oraz lokalnego stężenia O2 [255]. Jego nadprodukcja może prowadzić do utraty mitochondrialnej homeostazy redoks poprzez różne mechanizmy, stan, który jest związany z wieloma stanami patologicznymi, w tym AKI i PChN [201]. ΔѰm badano barwnikiem TMRM, a wytwarzanie anionu rodnikowego ponadtlenkowego barwnikiem MitoSOX. Najpierw zwalidowaliśmy te testy przez traktowanie komórek FCCP i CCCP jako kontrolami negatywnymi, odpowiednio dla TMRM i MitoSOX oraz oligomycyną i antymycyną A jako kontrolami pozytywnymi, odpowiednio dla TMRM i MitoSOX, w ludzkiej linii komórkowej HKC{{7} }. W przypadku testu TMRM, traktowanie oligomycyną wywołało 3-krotny wzrost średniej fluorescencji TMRM w porównaniu z barwnikiem kontrolnym, podczas gdy traktowanie FCCP spowodowało 9-krotny spadek. Antymycyna A i CCCP powodowały odpowiednio 35-krotny wzrost i 2-krotny spadek w teście MitoSOX (rysunek uzupełniający 3A i B). Aby ustalić, czy miR-150 i miR-495 wpływają na metabolizm mitochondrialny wywołały zmiany w tych parametrach, komórki HKC-8 zostały transfekowane miR-150-5p lub miR{{17} }p mimic lub odpowiedni miR-NC. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w kwantyfikacji fluorescencji sond TMRM lub MitoSOX między warunkami leczenia wybranymi miRs i miR-NC (ryc. uzupełniająca 3C).

Poziomy MiR-150 i miR-495 nie ulegają zmianie w próbkach osocza i nerek od pacjentów z CKD. Oceniliśmy ekspresję wybranych miRNA w biopsjach osocza i nerek od pacjentów z PChN. Analiza biopsji nerki od 26 pacjentów (Hospital Ramn y Cajal) nie wykazała korelacji między stopniem zwłóknienia a odpowiednio poziomami miR-150-5p i miR-495-3p (ryc. uzupełniający 4A i B) . Poziomy miR-150-5p w krążeniu w osoczu, miRNA o najwyższej ekspresji nerkowej z tych dwóch, zostały również określone w kohorcie 100 pacjentów z CKD (Hospital Principe de Asturias). Ze względu na ograniczenia w dostępności próbki nie byliśmy w stanie określić wartości miR- 495-3p w tej kohorcie w surowicy. Pacjenci ci zostali wcześniej podzieleni na dwie podgrupy w oparciu o ewolucję ich czynności nerek w okresie 24 miesięcy, tak że 50 pacjentów wykazało mniej niż 10% pogorszenie czynności nerek, podczas gdy reszta z nich doświadczyła co najmniej 40% zmniejszenia czynności nerek. funkcjonować. Ilościowa ocena qRT-PCR poziomów miR-150-5p w osoczu nie wykazała wyraźnego trendu w kierunku zróżnicowanej ekspresji w dwóch podgrupach pacjentów (ryc. uzupełniająca 4C).

4. Dyskusja

Odkrycie miRNA jako kluczowych regulatorów procesów patofizjologicznych przyczyniło się do badań nad ich zastosowaniem jako środków terapeutycznych w niemal każdym środowisku klinicznym, w tym w chorobie nerek [31]. Zwłóknienie nerek jest bardzo rozpowszechnionym wynikiem przewlekłej choroby nerek (PChN) o niezależnej etiologii, a jego obecność jest wyraźnym predyktorem ewolucji. W związku z tym wiele wysiłku poświęcono identyfikacji miRNA związanych z włóknieniem nerek [32,33]. W tym badaniu skupiliśmy się na coraz istotniejszej roli zaburzeń metabolicznych wnerkowyszkodaZidentyfikowaliśmy dwa miRNA, miR-150 i miR-495, które były wcześniej nieznanymi aktorami na scenie. Ponadto odkryliśmy, że wywierają one głęboki wpływ na bioenergetykę komórkową poprzez synergię z TGF- i modyfikację kluczowych szlaków metabolicznych związanych z tłuszczami.kwas utlenianie.

Uszkodzenie nabłonka współistnieje z defektem tkanki tłuszczowejkwasutlenianie, główne źródło energii dla komórek nabłonka kanalikowego [5]. Prowadzi to do ich odróżnicowania, indukując upośledzenie funkcji kanalików, wywołując zatrzymanie cyklu komórkowego i promując uwalnianie krytycznych cytokin profibrotycznych, które mogą przyczyniać się do aktywacji śródmiąższowych miofibroblastów [5, 34]. Ekspresja MiR-150 i miR-495 została zwiększona u myszyzwłóknienienerkii wczłowiek nerkakomórki nabłonkowe (HKC-8) po leczeniu TGF- , co sugeruje ich udział w odpowiedzi profibrotycznej. Co ciekawe, analiza in silico regionów genomowych kodujących miR-150 i miR-495 pozwala na identyfikację miejsc wiązania dla czynników transkrypcyjnych związanych z sygnalizacją TGF i innymi szlakami zaangażowanymi w uszkodzenie UUO (poszukiwania w genecards.org dla miR-150 i miR-495). Zarówno miR-150, jak i miR-495 zmniejszyły poziom ekspresji swoich genów docelowych CPT1A, PGC1 i TFAM, co znalazło odzwierciedlenie w zmniejszonej podstawowej, połączonej z ATP i maksymalnej zawartości OCR i ATP po leczeniu miR-150 i miR-495. Efektowi temu towarzyszyła zwiększona odpowiedź profibrotyczna TGF- w komórkach HKC-8. Odkryliśmy, że TGF- zmniejsza masę mitochondrialną i mitochondrialne DNA. Po leczeniu miRNA-150 i miRNA-495 zaobserwowano tendencję spadkową w zawartości mitochondriów w warunkach podstawowych, chociaż nie osiągano istotności. Wskazuje to na mechanizm niezależny od roli PGC1 lub TFAM i najprawdopodobniej związany z efektem metabolicznym związanym z regulacją w dół CPT1A jako główną zmienną, na którą wpływa obecność miRNA. Zmiany w bioenergetyce mitochondrialnej mają kluczowe znaczenie w chorobie nerek [35]. Kontynuując, ostatnio wykazaliśmy, że CPT1A jest enzymem krytycznym dla zachowania zdrowego przedziału kanalików, ponieważ jego nadekspresja chroni przed zwłóknieniem nerek [6]. Jednak PGC1

a geny TFAM są również ściśle związane z funkcją mitochondriów i biogenezą [36]. Upośledzona ekspresja tych genów jest związana z PChN, a jej zachowanie przyczynia się do integralności nerek, jak pokazano w kilku modelach uszkodzeń. Tak więc Han i in. odkryli, że kanalikowe wzmocnienie funkcji PGC1 chroniło myszy przed zwłóknieniem nerek wywołanym przez Notch i odwracało dysfunkcję mitochondriów związaną z tym modelem [37]. Podobnie, ponowna ekspresja Tfam w komórkach kanalików zapobiega przeprogramowaniu metabolicznemu i profibrotycznemu wywołanemu przez Notch [38]. Można zatem wyobrazić sobie, że zmniejszona ekspresja mRNA tych genów mitochondrialnych, indukowana przez miR-150 i miR-495, również przyczynia się do uszkodzenia fenotypu nabłonka.

Obserwowany przez nas spadek OCR związany z uszkodzeniem komórek nabłonka jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami, w tym z naszymi badaniami miR-33 i miR-9 [15,16]. Natomiast Kang i in. donosili również, że utlenianie glukozy było niższe w ludzkich i mysich modelach zwłóknienia nerek [5], nasze dane pokazują, że spadek OCR za pośrednictwem mikroRNA nie wywołuje per se zmian w ECAR, co sugeruje, że zamknięcie glikolityczne w warunkach zwłóknienia najprawdopodobniej zależy na bodźce zwłóknieniowe, a nie na zaburzoną fosforylację oksydacyjną. Kilka miRNA zostało zidentyfikowanych jako główne modyfikatory funkcji mitochondriów, w tym archetypowy profibrotyczny miRNA, miR-21 [39]. Tłumienie ekspresji PPAR przez miR-21 zostało przywołane jako mechanizm, przez który to miRNA wywiera swoje działanie profibrotyczne. Oprócz hamowania FAO, docelowe geny miR-21 wykazały, że to miRNA wycisza szeroki zakres procesów mitochondrialnych. Inne przykłady to mir-9 [16], miR-33 [15] i miR-30e [40,41]. Jednak według naszej wiedzy istnieje niewiele doniesień dotyczących regulacji mikroRNA genów CPT1A, PGC1 i TFAM w kontekście zwłóknienia nerek. Co ciekawe, mikroRNA-214, które promuje przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) podczas zwłóknienia nerek, bezpośrednio celuje w TFAM w komórkach raka okrężnicy [42]. Represję tę odnotowano również dla miR-590-3p [43]. Rodzina miR-29, jeden z najlepiej scharakteryzowanych regulatorów wytwarzania ECM w zwłóknieniu narządów, bezpośrednio celuje w PGC1, zachowując homeostazę serca. Tak więc patologiczne wyciszenie miR-29 prowadzi do regulacji w górę PGC1, powodując głębokie zmiany w biogenezie mitochondriów, które przyczyniają się do choroby serca [44]. Chociaż nasze dane wyraźnie potwierdzają rolę miR-150 i miR-495 w zwłóknieniu nerek, konieczne byłyby dalsze badania in vivo w celu potwierdzenia tego twierdzenia.

Aby ocenić integralność mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC), skupiliśmy się na dwóch cechach: ΔѰm i produkcji anionu rodników ponadtlenkowych. Zaobserwowaliśmy, że miR-150 i miR-495 nie zmieniały tych parametrów. Stabilna ΔѰm jest wymagana do żywotności komórek, a jej wielkość różni się w zależności od typu komórek [45]. Jego utrzymanie jest ściśle dostrojone, ponieważ wzrost ΔѰm może prowadzić do zaburzeń w stanie redoks, a jego spadek powoduje zmniejszenie produkcji ATP i może wywołać apoptozę. W naszym badaniu zmiany ΔѰm oznaczono ilościowo za pomocą kationowego barwnika fluorescencyjnego TMRM, natomiast produkcję anionu rodników ponadtlenkowych w mitochondriach mierzono za pomocą barwnika fluorogennego MitoSOX Red. Zastosowanie tych narzędzi w stanach wpływających na czynność nerek nie jest widoczne w literaturze. Niemniej jednak, w obliczu braku zmian w naszym badaniu, nie podjęliśmy dogłębnych innych strategii oceny hormezy redoks, a zatem nie możemy wykluczyć, że te miRNA mogą zmieniać ton nukleofilowy lub funkcję kilku składników ETC.

W warunkach klinicznych sugerowano, że miR-150 jest pro-fibrotycznym miRNA w toczniowym zapaleniu nerek poprzez modulację sygnalizacji TGF [46,47], podczas gdy miR-495 był związany z ochronną rolą w cukrzycowym zapaleniu nerek zwłóknienie [48]. Aby poznać ich potencjalny udział w PChN, oceniliśmy ich poziom w surowicy i miąższu w dwóch różnych kohortach pacjentów. Zaproponowano poziomy miRNA w surowicy jako potencjalne biomarkery progresji PChN [49,50]. Zatem poziomy miR-21 w krążeniu w surowicy i obfitość miR-29c w egzosomach moczu korelują ze zwłóknieniem nerek, co sugeruje ich potencjalną rolę jako biomarkerów [51, 52]. Jednak poziomy miR-150 i miR-495 nie różniły się ani w próbkach osocza, ani w nerkach od pacjentów z CKD. Różne wzorce ekspresji mikroRNA wśród gatunków i typów komórek mogą wyjaśniać ten brak różnicy w poziomach miR-150 i miR-495 w tkance włóknistej [53]. Chociaż w niektórych przypadkach odnotowywane poziomy mikroRNA w osoczu mogą odzwierciedlać te w tkance nerkowej, należy również wziąć pod uwagę inne mechanizmy związane z sekrecją miRNA do układu krążenia lub przeciwwagą tego sekrecji przez inne narządy [13,54].

Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki potwierdzają, że miR-150 i miR-495 promująnerkowynabłonkowykomórkaodróżnicowanie najprawdopodobniej poprzez pozbawienie energii, przenoszone przez represję genów związanych z funkcją mitochondriów CPT1A, PGC1 i TFAM. Stanowią również podstawę do realizacji swojej roli in vivo, a także ich potencjalnej użyteczności jako biomarkerów diagnostycznych lub prognostycznych.

Autorskie Wkłady

SL wymyślił i kierował badaniami. VM zaprojektowała, wykonała i przeanalizowała większość eksperymentów. RR wspomagał analizę macierzy mikroRNA. DRP i LGB przeprowadziły badania w dwóch różnych kohortach pacjentów z CKD. Wszyscy autorzy pomagali w dyskusji wyników, a SL i VM napisali manuskrypt.

Oświadczenie o sprzecznym interesie

Autorzy nie mają konfliktu interesów.

Podziękowanie

Praca ta była finansowana z grantów hiszpańskiego Ministerstwa Nauki SAF2015-66107-R i PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) współfinansowanych przez Fundusz Rozwoju Regionalnego, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 i RD16/0009/0016 (SL i DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid „NOVELREN” B2017/BMD3751 (SL i DRP), stypendium Hiszpańskiego Towarzystwa Nefrologicznego (Fundacin Senefro 2017) dla SL i FundacionNerkowy"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) wszyscy z Hiszpanii. CBMSO otrzymuje wsparcie instytucjonalne od Fundacji „Ramn Areces”. VM był wspierany przez stypendium doktoranckie programu FPI (BES- 2013-065986) hiszpańskiego Ministerstwa Nauki.