Ochronny wpływ Herba Cistanches na miotoksyczność indukowaną przez statyny in vitro
Mar 24, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
Instytut Medycyny Chińskiej, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong
b Państwowe Kluczowe Laboratorium Fitochemii i Zasobów Roślinnych w Zachodnich Chinach, Chiński Uniwersytet w Hongkongu, Shatin, Nowe Terytoria, Hongkong
c Wydział Farmakologii Klinicznej, Wydział Medycyny i Terapeutyki, Chiński Uniwersytet w Hongkongu, Shatin, Nowe Terytoria, Hongkong
Abstrakcyjny:
Znaczenie etnofarmakologiczne: HerbaCistanches(HC,Cistanchedeserticola, lubCistanchetubulosa) to chińskie zioło tradycyjnie używane na problemy z mięśniami. Wcześniejsze badania wykazały, że ekstrakt HC może zmniejszyć uszkodzenia mięśni i poprawić magazynowanie ATP u szczurów po treningu. Jednak jego wpływ na toksyczność mięśni wywołaną przez statyny nigdy nie był badany.
Cel:Celem tego badania było ustalenie, czy wodny ekstrakt HC (HCE) może zapobiegać toksyczności wywołanej symwastatyną w komórkach mięśni szkieletowych szczura L6 i czy werbaskozyd jest głównym składnikiem bioaktywnym, który przyczynia się do efektów
Materiały i metody:Przeprowadzono MTT w celu określenia wpływu HCE ({{0}}–2000 mg/ml) lub werbaskozydu (0–160 mM) na komórki L6 traktowane simwastatyną (10 mM). Przeprowadzono test apoptozy aneksyny V-FITC/PI i test kaspazy 3 w celu określenia ochronnej roli HCE na śmierć komórek indukowaną simwastatyną oraz w celu oceny, czy HCE wywiera działanie ochronne poprzez szlak kaspaz. Mierzono produkcję ATP w celu zbadania, czy HCE może zapobiegać indukowanemu przez symwastatynę zmniejszeniu produkcji ATP in vitro.
Wyniki:Symwastatyna znacząco zwiększyła apoptotyczną śmierć komórek w komórkach L6. HCE istotnie wywarł zależną od dawki redukcję komórek apoptotycznych indukowanych symwastatyną, prawdopodobnie poprzez szlak kaspazy-3. Symwastatyna zmniejszyła wytwarzanie ATP w komórkach L6, czemu w zależności od dawki zapobiegał HCE. Wystąpił jedynie trend, ale nieistotny wpływ (z wyjątkiem wysokich dawek) werbaskozydu na ochronę przed toksycznością mięśniową wywołaną symwastatyną.
Wnioski:Podsumowując, wykazaliśmy po raz pierwszy, że HCE może wywierać zależne od dawki działanie ochronne na toksyczność indukowaną symwastatyną in vitro, co było mało prawdopodobne ze względu na obecność werbaskozydu. Nasze badanie sugerowało potencjalne zastosowanie HC w sytuacji toksyczności mięśniowej wywołanej simwastatyną.
Słowa kluczowe:HerbaCistanches, statynacholesterol, hiperlipidemia, toksyczność mięśni, werbaskozyd, kaspaza-3
1. Wstęp
Inhibitory reduktazy HMG-CoA (statyny), będące najlepiej sprzedającą się w historii klasą leków na receptę na świecie, są dobrze udokumentowane jako korzystne dla pacjentów obu płci w różnym wieku z umiarkowanym i wysokim ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych (CVD) (Golomb i Evansa, 2008). Następnie opracowano i zatwierdzono klinicznie różne statyny, w tym prawastatynę, atorwastatynę, fluwastatynę, lowastatynę, pitawastatynę, rosuwastatynę i simwastatynę. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie statyny działają poprzez hamowanie redukcji HMG-CoA do kwasu mewalonowego na wczesnym etapie szlaku mewalonianu, zmniejszając produkcję cholesterolu (Kromer i Moosmann, 2009; Thompson i wsp., 2003). Chociaż statyny są zwykle dobrze tolerowane, jednym z najważniejszych i najbardziej znanych klinicznych działań niepożądanych jest toksyczność dla mięśni szkieletowych (rabdomioliza) (Kobayashi i wsp., 2008). Nieprawidłowości mięśni szkieletowych mogą wahać się od łagodnej mialgii do ciężkiej miopatii. Chociaż proponuje się mieszankę mechanizmów, które mogą być odpowiedzialne za działania niepożądane statyn na mięśnie, uważa się, że ważną rolę odgrywają mechanizmy mitochondrialne (Golomb i Evans, 2008). Mewalonian jest nie tylko prekursorem cholesterolu, ale także innych związków, w tym selenoprotein, dolicholu i ubichinonu (Kaufmann i wsp., 2006; Vaklavas i wsp., 2009). Zdolność statyn do hamowania mewalonianu hamowałaby zatem również produkcję selenoprotein, takich jak peroksydaza glutationowa (GPx), które są ważnymi enzymami w utrzymaniu mechanizmu obrony antyoksydacyjnej (Kromer i Moosmann, 2009). Statyny mogą również prowadzić do zubożenia ubichinonu, powodując zmniejszenie zużycia tlenu i syntezy ATP (Beltowski et al., 2009). Co więcej, coraz więcej badań in vitro i in vivo wykazało, że statyny mogą również oddziaływać bezpośrednio na mitochondria tkanek, indukując zależne od Ca2þ przejście przez błonę (MPT) w sposób zależny od dawki (Beltowski i wsp., 2009; Velho i wsp., 2006 ). Wiąże się również ze wzrostem reaktywnych form tlenu (ROS) i mitochondrialnym stresem oksydacyjnym, co prowadzi do śmierci komórek, a tym samym przyczynia się do uszkodzenia wątroby i mięśni (Beltowski i in., 2009; Velho i in., 2006).
HerbaCistanches, cała wysuszona roślina Cistanche deserticola YC Ma lub Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (rodzina Orobanchaceae) to rośliny pasożytnicze, które rosną głównie na pustynnych obszarach północnych i północno-wschodnich Chin (Siu i Ko, 2010).HerbaCistanchesto chińskie zioło wzmacniające Yang, które jest stosowane głównie w leczeniu niewydolności nerek z objawami takimi jak impotencja, niepłodność, przedwczesny wytrysk. Ciężki i mdły charakter zioła nawilża również jelita i pomaga łagodzić zaparcia. Jest to również chińskie zioło, które jest tradycyjnie przepisywane pacjentom na bóle lędźwi i kolan i jest powszechnie stosowane w chińskich preparatach do leczenia problemów z mięśniami (Siu i Ko, 2010; Xiong i wsp., 1998). Co ciekawe, jest to również zgodne z nowoczesnymi badaniami naukowymi, które wykazały działanie przeciwzmęczeniowe bogatego w polisacharydy i fenyloetanoidy ekstraktu zHerbaCistanchesu szczurów po wysiłku poprzez zmniejszenie uszkodzeń mięśni i poprawę magazynowania ATP (Cai i wsp., 2010). Ostatnie prace wykazały, że metanolowy ekstrakt z Herba Cistanches może zwiększyć mitochondrialne wytwarzanie ATP (Leung i Ko, 2008). Siu i Ko (2010) wykazali, żeHerbaCistanchesmoże również poprawić mitochondrialny stan glutationu poprzez pośredniczenie w poziomach syntezy glutationu i GPx, chroniąc w ten sposób tkanki przed stresem oksydacyjnym w sercach szczurów. Siu i Ko (2010) również pokazali, żeHerbaCistanchesmoże zmniejszyć zawartość Ca2þ w mitochondriach, zmniejszając w ten sposób MPT zależne od Ca2þ. Ponadto,HerbaCistanchesudowodniono również, że jest silnym przeciwutleniaczem i wymiataczem wolnych rodników w różnych narządach, zmniejszając stres oksydacyjny i aktywność ROS in vivo (Lu i wsp., 1995; Sui i wsp., 2011). Co ciekawsze, próbując określić frakcję aktywną, która przyczynia się do działania przeciwzmęczeniowegoHerbaCistanches, stwierdzono, że werbaskozyd był głównym składnikiem aktywnej frakcji (Cai et al., 2010). Wykazano również, że werbaskozyd zmniejsza zmęczenie mięśni u ropuch, prawdopodobnie ze względu na jego działanie antyoksydacyjne (Liao i wsp., 1999), co sugeruje, że werbaskozyd może być bioaktywnym składnikiem przyczyniającym się do korzystnych efektów Herba Cistanches.
Celem tego badania było ustalenie, czy stosowanie ziołowego wyciągu wodnego Cistanches (HCE) może zmniejszyć toksyczność mięśniową wywołaną przez simwastatynę in vitro. Postawiono hipotezę, że stosowanie HCE może skorygować skutki uboczne toksyczności mięśni wywołanej przez simwastatynę. Podjęto również próbę ustalenia, czy korzystne efektyHerbaCistanchesprzypisuje się obecności werbaskozydu.
2. Materiały i metody
2.1. Uwierzytelnianie i przygotowanie materiałów ziołowych
Surowy materiał ziołowy zHerbaCistancheszostał zakupiony od renomowanego dostawcy w Guangzhou w Chinach.HerbaCistancheszostał chemicznie uwierzytelniony za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) zgodnie z Chińską Farmakopeą (CP), 2010, z werbaskozydem i echinakozydem jako markerami chemicznymi (dane nie pokazane). Po uwierzytelnieniu chemicznym wzór kuponu zielnikowegoHerbaCistancheszostał zdeponowany w Muzeum Instytutu Medycyny Chińskiej na Chińskim Uniwersytecie w Hongkongu (CUHK), z numerem wzoru kuponu 2014-3434.
W skrócie, 1 kg surowego zioła moczono przez 1 godzinę, a następnie dwukrotnie ekstrahowano przez ogrzewanie przez 1 godzinę w temperaturze wrzenia w temperaturze 100°C przy użyciu 10 wody destylowanej na każdą ekstrakcję. Ekstrakty wodne (HCE) połączono i przesączono. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60 stopni . Zatężony ekstrakt liofilizowano do sucha. Procent wydajności wynosił 50,1 procent wag. Niewielką ilość użyto do określenia ilości werbaskozydu i echinakozydu za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). Cały wyekstrahowany proszek zapakowano próżniowo i przechowywano aż do użycia.
2.2. Analiza UPLC ekstraktu wodnego
Analizy UPLC przeprowadzono przy użyciu systemu Waters Acquity Ultra Performance LC System (Waters, USA). Wszystkie rozpuszczalniki wymagane do analiz UPLC zakupiono z Wydziału Chemii Chińskiego Uniwersytetu w Hongkongu. Werbaskozyd i echinakozyd zakupiono w Chińskim Narodowym Instytucie Kontroli Produktów Farmaceutycznych i Biologicznych. Roztwór próbki wstrzyknięto do kolumny Waters Acquity UPLC BEH C18 (10{{20}} wewn. 2,1 mm2, wielkość cząstek 1,7 mm) z kolumną wstępną Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard ( 5-2,1 mm2, wielkość cząstek 1,7 mm). Wszystkie rozpuszczalniki wstępnie przefiltrowano przez 0.45 mm dysk filtracyjny Millipore (Millipore) i odgazowano. Elucję gradientową prowadzono stosując następujące układy rozpuszczalników: faza ruchoma A – acetonitryl; faza ruchoma B – woda podwójnie destylowana/kwas mrówkowy (99,9/ 0,1; v/v). Elucję przeprowadzono zgodnie z procedurą gradientową w następujący sposób: 0-5 min, 88 procent B; 5-10 min, od 88 procent B do 83 procent B. Zastosowana prędkość przepływu wynosiła 0,4 ml/min, a detekcję prowadzono przy 331 nm zgodnie z CP (2010). Każdą próbkę (5 μl) wstrzyknięto do kolumny po filtracji przez 0,2 mm krążek filtracyjny. Identyfikację markerów chemicznych przeprowadzono porównując czasy retencji i absorbancję UV nieznanych pików z pikami wzorców. Krzywą kalibracyjną wykreślono dla serii stężeń werbaskozydu i echinakozydu (40, 20, 10, 5, 2,5 i 1,25 mg/ml) w celu oznaczenia ilościowego. Oznaczenie ilościowe werbaskozydu i echinakozydu w ekstrakcie ziołowym przeprowadzono w trzech powtórzeniach. System był monitorowany przez komputer wyposażony w oprogramowanie Waters MassLynx do gromadzenia, integracji i analizy danych.
2.3. Hodowlę komórkową
Linię komórkową szczurzych mięśni szkieletowych L6 zakupiono z American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA). Komórki utrzymywano w gęstości subkonfluencji w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, ATCC, Manassas, VA, USA) uzupełnionej 10% v/v płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (P/S) oraz inkubowany w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95% powietrza.
W celu określenia wpływu HCE na indukowaną przez statyny toksyczność mięśniową, komórki L6 traktowano simwastatyną w stężeniu 10 μM przez 48 godzin w celu wywołania toksyczności. W celu określenia, czy ekstrakt ziołowy może zapobiegać toksyczności wywołanej przez statyny w komórkach mięśni szkieletowych, a werbaskozyd może wywierać podobne działanie ochronne jak ziołowy ekstrakt wodny.
Ochronny wpływ ekstraktu Herba Cistanche na toksyczność indukowaną symwastatyną in vitro
2.4. Cytotoksyczność in vitro
Ogniwa L6 (1x105/studzienkę) wysiewano w {{0}}studzienkowych płytkach hodowlanych o płaskim dnie (Iwaki, Japonia) przez noc, a następnie traktowano 10 μM simwastatyny, razem z różnymi dawkami HCE lub bez ( 0–2000 ug/ml) lub werbaskozyd (0–160 μM), przez 48 godzin. Do studzienek kontrolnych dodano zwykłą pożywkę (DMEM). Ekstrakt ziołowy i związek rozpuszczono w DMEM.
Po 48-godzinnym traktowaniu pożywkę ze wszystkich komórek odrzucono i 30 ul 5 mg/ml 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilu)-2,{{ 8}}bromek difenylotetrazoliowy (MTT; Sigma, USA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) dodano do każdego dołka i płytki dalej inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37 stopni. Supernatant następnie usunięto i do każdego dołka dodano 100 ul DMSO w celu rozpuszczenia fioletowych kryształów formazanu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Absorbancję każdej próbki odczytano przy 540 nm przy użyciu czytnika mikropłytek (Biotek μ-Quant, USA). Wyniki wyrażono jako procent absorbancji MTT w odniesieniu do komórek kontrolnych.
2.5. Test barwienia aneksyny-V FITC/PI
Komórki L6 (3 x105/dobrze) leczono simwastatyną, razem z różnymi dawkami HCE lub werbaskozydu lub bez nich. Następnie komórki zebrano, przemyto i wybarwiono zestawem aneksyna-V FITC zgodnie z protokołem producenta (Trevigen, MD, USA). W skrócie, komórki przemywano dwukrotnie 1 x buforem wiążącym i kubowano w 100 ul roztworu do znakowania zawierającego 1 ul aneksyna-V koniugatu FITC i 10 ul PI w ciemności przez 15 min w temperaturze pokojowej. Fluorescencję próbek wykrywano metodą cytometrii przepływowej (Becton Dickinson FACSCanto II, USA).
2.6. Test aktywności kaspazy 3
Aktywność kaspazy 3 oznaczano za pomocą fluorometrycznego, immunosorpcyjnego testu enzymatycznego (Sigma) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki L6 (3 105/studzienkę) traktowane simwastatyną, razem z różnymi dawkami werbaskozydu HCE lub bez, poddano lizie przy użyciu buforu do lizy. Wolna 7-amino-4-metylokumaryna (AMC) wytworzona przez proteolityczne rozszczepienie substratu przez kaspazę 3 została zmierzona i oznaczona fluorometrycznie przy długości fali wzbudzenia przy 360 nm i długości fali emisji przy 460 nm za pomocą BMG FLUOstarOptimamicroplate czytelnik (BMG LABTECH GmbH, Niemcy).
2.7. Test komórkowy ATP
Ogniwa L6 (3x105/dobrze) leczono simwastatyną, razem z różnymi dawkami HCE lub werbaskozydu lub bez nich. Po obróbce zebrano komórki i zmierzono zawartość ATP przy użyciu dostępnego w handlu zestawu kolorymetrycznego (Abcam, Wielka Brytania) poprzez pomiar zawartości fosforanu glicerolu w zlizowanych komórkach i odczyt przy 570 nm przy użyciu czytnika mikropłytek (Biotek μ-Quant, USA ). Pomiar produkcji ATP wyrażono jako procent w stosunku do grupy kontrolnej.
2.8. Analiza statystyczna
Dane przedstawiono jako średnie 7SD, Prism 5 for Window (wersja 5.0c, GraphPad Software, Inc., USA) zastosowano do analizy statystycznej. Istotne różnice między wszystkimi grupami oceniano jednokierunkową ANOVA, a następnie testem wielokrotnych porównań Bonferroniego. Za statystycznie istotne uznano prawdopodobieństwo po0.05.
3. Wyniki
3.1. Analiza UPLC wodnego ekstraktu Herba Cistanches
Fig. S1A przedstawia profil UPLC standardowej mieszaniny zawierającej echinakozyd i werbaskozyd. Punkty czasu retencji każdego z tych markerów porównano z profilem UPLCHerbaCistanchesekstrakt wodny (ryc. S1B). Ilość echinakozydu i werbaskozydu w obrębieHerbaCistanchesStwierdzono, że ekstrakt wodny wynosi odpowiednio {{0}},45 procent w/w i 0,085% w/w.
3.2. Wpływ HCE i werbaskozydu na cytotoksyczność in vitro symwastatyny w komórkach mięśni szkieletowych L6
Jak pokazano na Fig. 1A, simwastatyna powodowała znaczną cytotoksyczność wobec komórek L6, co odzwierciedla znaczące zmniejszenie żywotności komórek L6 przy 10 mM simwastatyny. Leczenie HCE zależnie od dawki i znacząco zapobiegało cytotoksyczności wywołanej symwastatyną przy 500, 1000 i 2000 mg/ml. Werbaskozyd wywarł tendencję do poprawy żywotności komórek L6 leczonych jednocześnie simwastatyną. Jednak żadne ze stężeń nie osiągnęło istotności statystycznej (ryc. 1B).
Rys. 1. Ochronne działanie (a) HCE; oraz (b) werbaskozyd na cytotoksyczność indukowaną symwastatyną w komórkach L6. Wartości reprezentują średnie7SD (n=3). Istotna różnica między leczeniem samą simwastatyną a grupą kontrolną przy użyciu testu t-Studenta: ### po0.{{10}}01. Istotna różnica między wszystkimi grupami leczonymi symwastatyną z lub bez jednoczesnego leczenia werbaskozydem HCE przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA: ** po0,01,*** po0,001.
3.3. Wpływ HCE i werbaskozydu na indukowaną symwastatyną śmierć komórek w komórkach mięśni szkieletowych L6
Aby zbadać tryb śmierci komórkowej wywołanej przez simwastatynę i określić ochronną rolę HCE lub werbaskozydu na śmierć komórkową wywołaną przez simwastatynę, wykryto odsetek komórek apoptotycznych przez barwienie jodkiem propidyny (PI). Wyniki pokazały, że symwastatyna indukowała znaczny wzrost odsetka komórek wcześnie apoptotycznych (Aneksin V-FITC dodatnich i PI ujemnych, Q4–2) oraz późnych apoptotycznych/martwych (Aneksin V-FITC dodatnich i PI-dodatnich, Q2– 2) w porównaniu z grupą kontrolną. Jednoczesne leczenie z HCE zmniejszyło odsetek komórek wcześnie apoptotycznych i późno apoptotycznych/martwych w sposób zależny od dawki do 1000 mg/ml (ryc. 2A). Ten efekt ochronny zaobserwowano również w grupach współleczonych z werbaskozydem. Jednak żadne z badanych stężeń nie osiągnęło istotności statystycznej (ryc. 2B).
Ryc. 2. Wpływ simwastatyny z lub bez jednoczesnego leczenia HCE lub werbaskozydem na eksternalizację fosfatydyloseryny w komórkach L6. Komórki wybarwiono aneksyną-V FITC i I i wykryto za pomocą cytometrii przepływowej
3.4. Wpływ HCE i werbaskozydu na aktywność kaspazy 3 w komórkach mięśni szkieletowych L6 leczonych simwastatyną
Jak pokazano na Fig. 3A, 10 mM simwastatyna znacząco indukowała aktywność kaspazy 3 w komórkach L6, co sugeruje, że simwastatyna indukowała apoptozę komórek L6 poprzez kaskadę kaspazy. Jednak w komórkach L6 jednocześnie traktowanych simwastatyną i HCE, HCE zależnie od dawki i znacząco zmniejszał aktywność kaspazy 3, co sugeruje zdolność HCE do zapobiegania apoptozie indukowanej simwastatyną poprzez kaskadę kaspazy. Z drugiej strony, chociaż werbaskozyd również wykazywał tendencję do zmniejszania indukowanego przez simwastatynę wzrostu aktywności enzymu kaspazy 3, jedynie stężenie przy 160 mM osiągnęło istotność statystyczną (ryc. 3B).
Rys. 3. Ochronne działanie (a) HCE; oraz (b) werbaskozyd na aktywność enzymatyczną kaspazy 3 indukowaną simwastatyną w komórkach L6. Wartości reprezentują średnie 7SD (n=3–5). Istotna różnica między grupą leczoną samą simwastatyną a grupą kontrolną przy użyciu testu t-Studenta: ###po0.001. Istotna różnica między wszystkimi grupami leczonymi symwastatyną z lub bez jednoczesnego leczenia HCE lub werbasozydem przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA: *po00,05, **p00,01, ***po0,001.
3.5. Wpływ HCE na indukowane symwastatyną zmniejszenie wytwarzania ATP w komórkach mięśni szkieletowych L6
Simwastatyna (10 mM) znacząco zmniejszyła wytwarzanie ATP w komórkach L6 o około 60 procent w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 4A). Jednoczesne leczenie HCE w zależności od dawki osłabiało zmniejszenie wytwarzania ATP w komórkach traktowanych simwastatyną, z których tylko stężenia przy 500, 1000 i 2000 mg/ml osiągnęły istotność statystyczną. Z drugiej strony, chociaż werbaskozyd wykazywał tendencję do przywracania produkcji ATP przy 50 mg/ml, nie osiągnął on istotności statystycznej (ryc. 4B).
Ryc. 4. Ochronny wpływ (a) HCE i (b) werbaskozydu na indukowane przez simwastatynę zmniejszenie produkcji ATP w komórkach L6. Wartości reprezentują średnie 7SD (n=3–5). Istotna różnica między grupą leczoną samą simwastatyną a grupą kontrolną przy użyciu testu t-Studenta: ###po0.001. Istotna różnica między wszystkimi grupami leczonymi symwastatyną z lub bez jednoczesnego leczenia HCE lub werbaskozydem przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA: *po0,05, **po0,01.
4. Dyskusja
Wraz ze wzrostem częstości występowania chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i pacjentów z rozpoznaną hipercholesterolemią na całym świecie, stosowanie statyn stało się bardziej powszechne. Chociaż statyny są na ogół bardzo dobrze tolerowane, uszkodzenie mięśni jest często zgłaszanym działaniem niepożądanym związanym ze stosowaniem statyn, które może wystąpić dotkliwie w ciągu tygodni lub miesięcy po rozpoczęciu przyjmowania leku (Fine, 2003). Objawy mięśni mogą się różnić od łagodnych problemów, na przykład bólu, tkliwości lub osłabienia z podwyższeniem lub bez podwyższenia poziomu kinazy kreatynowej (CK), do najcięższego stanu rabdomiolizy (Armitage, 2007; Hu i wsp., 2012). Ze względu na występowanie tych działań niepożądanych oraz brak skutecznego leczenia zatrucia mięśniowego wywołanego przez statyny, statyny pozostają niedostatecznie stosowane. W szeroko zakrojonej ankiecie przeprowadzonej na 10 409 francuskich osobach, przeprowadzonej za pomocą wywiadu telefonicznego, 10 procent pacjentów otrzymujących leczenie statynami zgłaszało objawy mięśniowe, z czego 30 procent tych objawowych pacjentów zakończyło się przerwaniem leczenia (Rosenbaum i wsp., 2013).
Po raz pierwszy wykazaliśmy, że ekstrakt wodny zHerbaCistanches, powszechnie stosowane tradycyjne chińskie zioło, może wywierać działanie ochronne przeciwko toksyczności indukowanej symwastatyną in vitro w komórkach mięśni szkieletowych L6, co sugeruje potencjałHerbaCistanchesekstrakt wodny (HCE) ze względu na jego ochronną rolę toksyczność mięśniową wywołaną przez statyny, co jest uznanym częstym działaniem niepożądanym u pacjentów przyjmujących statyny. Silna zdolność HCE do ochrony przed toksycznością mięśniową wywołaną przez statyny miałaby zatem wielki potencjał.
Zgodnie z tradycyjną teorią TCM, Yang jest związany z mitochondrialnym metabolizmem energii w organizmie, a recepta na zioła ożywiające Yang zwiększa generację mitochondrialnego ATP (Ko i Leung, 2007). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy zmniejszenie produkcji ATP w komórkach mięśni szkieletowych L6 traktowanych simwastatyną, a to zmniejszenie produkcji ATP zostało znacznie ulepszone przy jednoczesnym leczeniu HCE. W naszym badaniu, wykorzystując komórki mięśni szkieletowych szczura L6, wykazaliśmy zmniejszenie żywotności komórek spowodowane przez simwastatynę. To zmniejszenie żywotności komórek zostało znacznie ulepszone dzięki współleczeniuHerbaCistanchesw sposób zależny od dawki. Chociaż dokładny mechanizm wywołanej przez statyny toksyczności mięśniowej nie został w pełni wyjaśniony, sugerowano, że wywołana przez statyny apoptoza zdrowych miocytów szkieletowych jest czynnikiem przyczyniającym się do miopatii, najczęstszego efektu ubocznego doświadczanego przez użytkowników statyn (Dirks i Jones, 2006). . W naszym badaniu zaobserwowaliśmy znaczny wzrost komórek apoptotycznych indukowany przez simwastatynę, co wiązało się ze znacznie podwyższoną aktywnością kaspazy 3. Dane te są również zgodne z wcześniejszymi badaniami, które wykazały, że różne statyny mogą indukować apoptozę w mioblastach szkieletowych, miotubulach i zróżnicowanych pierwotnych ludzkich komórkach mięśni szkieletowych poprzez aktywację aktywności kaspazy-9 i kaspazy-3 (Dirks i Jones, 2006). Nasz HCE był w stanie zapobiec indukowanemu przez simwastatynę wzrostowi apoptozy aktywowanej kaspazą-3 w sposób zależny od dawki.
HerbaCistanches
Poza tym wcześniejsza literatura sugerowała, że werbaskozyd jest jednym z głównych aktywnych składników w obrębieHerbaCistanches. Werbaskozyd, znany również jako akteozyd, należy do glikozydów fenyloetanoidowych, naturalnie występującej grupy związków polifenolowych, które są rozpuszczalne w wodzie (Liao i wsp., 1999). Wcześniej wykazano, że werbaskozyd jest silnym przeciwutleniaczem, który może wykazywać silne działanie wychwytujące ROS i antyoksydacyjne (Liao i wsp., 1999). W naszym badaniu, aby ustalić, czy werbaskozyd jest głównym składnikiem naszego HCE, który przyczynia się do obserwowanych korzystnych efektów, przetestowaliśmy działanie werbaskozydu w stężeniach 0-160 mM. Ponieważ wykazaliśmy, że nasz HCE jest aktywny w zakresie stężeń 250–2000 mg/ml, na podstawie naszych wyników HPLC, które sugerowały, że nasz HCE zawierał werbaskozyd w stężeniu 0,085% wag. /wagowo, aktywne stężenie werbaskozydu powinno mieścić się w zakresie 0,2125-1,7 mg/ml (tj. 0,34-2,72 mM), czy werbaskozyd powinien być składnikiem czynnym? Niemniej jednak nie zaobserwowaliśmy znaczącego korzystnego wpływu werbaskozydu w badanym zakresie stężeń, chociaż zaobserwowaliśmy zależny od dawki trend korzystnego wpływu werbaskozydu na komórki mięśni szkieletowych L6. Dane te sugerują, że korzystny wpływ naszego HCE obserwowany w komórkach szkieletowych L6 jest mało prawdopodobny przypisywany działaniu samego werbaskozydu, co sugeruje, że za obserwowane korzystne efekty mogą być odpowiedzialne składniki inne niż werbaskozyd. Możliwe jest również, że werbaskozyd może wchodzić w interakcje z innymi związkami bioaktywnymi zawartymi w ekstrakcie, przyczyniając się do korzystnych efektów. Dodatkowe eksperymenty z zastosowaniem frakcjonowania sterowanego testami biologicznymi będą przydatne w dostarczaniu dalszych informacji na temat odkrywania składników bioaktywnych odpowiedzialnych za udział w obserwowanym działaniu ochronnym HCE na toksyczność mięśni wywołaną symwastatyną.
Podsumowując, niniejsze badanie wskazuje, że HCE może wywierać silne działanie ochronne na indukowane przez simwastatynę zmniejszenie żywotności komórek mięśniowych in vitro. Wyniki te dostarczają wstępnych dowodów sugerujących, że nasz wodny ekstrakt HC może mieć wartość terapeutyczną jako żywność funkcjonalna lub nutraceutyka dla pacjentów z hiperlipidemią, którzy muszą wycofać się z leczenia statynami z powodu wywołanej przez statyny miotoksyczności.
Podziękowanie Badanie było finansowane przez Biuro ds. Żywności i Zdrowia HKSAR, Fundusz Badań Medycznych i Zdrowia nr. 11120831.
Bibliografia
Armitage, J., 2007. Bezpieczeństwo statyn w praktyce klinicznej. Lancet 370, 1781-1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wiśniewska, A., 2009. Niekorzystne działanie statyn – mechanizmy i konsekwencje. Aktualn. Bezpieczeństwo narkotyków. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. Przeciwzmęczeniowe działanie bogatego w fenyloetanoidy ekstraktu z Cistanche deserticola. Fitoter. Res. 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. Apoptoza indukowana przez statyny i miopatia szkieletowa. Jestem. J. Physiol. Fizjol komórkowy. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. Toksyczność mięśni związana ze statynami. Clin. Pharmacol. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. Działania niepożądane statyn: przegląd literatury i dowodów na mechanizm mitochondrialny. Jestem. J. Cardiovasc. Narkotyki 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. Bezpieczeństwo statyn: aktualizacja. Tam. Przysł. Bezpieczeństwo narkotyków. 3, 133–144.
Kaufmann P., Torok M., Zahno A., Waldhauser KM, Brecht K., Krahenbuhl S. 2006. Toksyczność statyn na mitochondria mięśni szkieletowych szczura. Komórka. Mol. Życie Sci. 63, 2415-2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. Zwiększenie zdolności wytwarzania ATP, aktywności antyoksydacyjnej i immunomodulacyjnej przez chińskie zioła tonizujące Yang i Yin. Podbródek. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Suplementacja wodorowęglanami jako sposób zapobiegawczy w uszkodzeniu mięśni wywołanym przez statyny. J. Pharm. Farmacja Nauka. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Uszkodzenie wątroby wywołane statyną obejmuje wzajemne oddziaływanie między szlakami biosyntezy cholesterolu i selenoprotein. Mol. Farmacja 75, 1421-1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. Ekstrakt Herba Cistanche zwiększa mitochondrialne wytwarzanie ATP w sercach szczurów i komórkach H9C2. Farmacja Biol. 46, 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. Opóźnienie zmęczenia mięśni szkieletowych przez dwa glikozydy fenylopropanoidowe: werbaskozyd i martenzyt z Pedicularis plicata Maxim. Fitoter. Res. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. Badanie nad składnikami chemicznymi Cistanche deserticola Ma. i Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Podbródek. Tradycja. Ziele. Narkotyki 26, 143.
Komisja Farmakopei, 2010. Farmakopea Chińskiej Republiki Ludowej. Prasa Przemysłu Chemicznego, Pekin.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Przerwanie terapii statynami z powodu skutków ubocznych mięśni: ankieta w prawdziwym życiu. Nutr. Metab. Kardiovasc. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. Ekstrakt Herba Cistanche poprawia stan mitochondrialnego glutationu i oddychanie w sercach szczurów, z możliwą indukcją białek rozprzęgających. Farmacja Biol. 48, 512-517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. Rozpuszczalny w wodzie związek węglowodanowy z organizmuHerbaCistanches: izolacja i jej wymiatający wpływ na wolne rodniki w skórze. Węglowodan. Polim. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. Miopatia związana ze statynami. JAMA 289, 1681-1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, YS, Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, GD, 2009. Molekularne podstawy miopatii związanej ze statynami. Miażdżyca 202, 18–28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. Statyny indukują zależne od wapnia przejście przepuszczalności mitochondrialnej. Toksykologia 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. Hepatoprotekcyjne działanie fenyloetanoidów z Cistanche deserticola. Planta Med. 64, 120-125.
