Czytnik RNA M6 A YTHDF2 kontroluje odporność przeciwnowotworową i przeciwwirusową komórek NK Część 2

YTHDF2 jest wymagany do przeciwwirusowej funkcji komórek NK

Aby ustalić, czy niedobór Ythdf2 wpływa na działanie przeciwwirusowe komórek NK, wstrzyknęliśmy 2, 5 x 104 PFU MCMV myszom Ythdf2WT i myszom Ythdf2ΔNK.

Wyniki pokazały, że myszy Ythdf2ΔNK były bardziej podatne na infekcję MCMV, o czym świadczy znaczna utrata masy ciała i zwiększone miano wirusa we krwi, śledzionie i wątrobie w porównaniu z myszami Ythdf2WT (ryc. 3, A i B; oraz ryc. S2, A i B). .

Zaobserwowaliśmy także znaczące zmniejszenie odsetka i bezwzględnej liczby wszystkich komórek NK w śledzionie i krwi myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT po zakażeniu (ryc. 3, C i D; oraz ryc. S2, C i D). Dalsza analiza wykazała, że ​​komórki NK myszy Ythdf2ΔNK miały znacznie niższą ekspresję Ki67 niż myszy Ythdf2WT (ryc. 3, E – G).

Jednakże żywotność komórek NK była podobna u myszy Ythdf2WT i myszy Ythdf2ΔNK, jak pokazano za pomocą barwienia aneksyną V (ryc. S2 E). Dane te wskazują, że niedobór YTHDF2 w komórkach NK powoduje raczej defekt proliferacji komórek niż przeżycie komórek podczas infekcji wirusowej. Komórki NK hamują infekcję MCMV poprzez aktywujące receptory Ly49H i Ly49D, a proces ten charakteryzuje się odpowiedzią przeciwwirusową za pośrednictwem perforyny lub IFN (Arase i in., 2002; Lee i in., 2009; Loh i in., 2005; Orr i in., 2010; Sumaria i in., 2009).

Odkryliśmy, że myszy Ythdf2ΔNK znacząco zmniejszyły liczbę komórek NK Ly49H+ i Ly49D+ w śledzionie i krwi w porównaniu z myszami Ythdf2WT po infekcji (ryc. 3, H – J i ryc. S2, F – K).

Dalsza analiza wykazała, że ​​chociaż procentowo, tylko komórki Ly49D+Ly49H+ wykazywały różnicę u myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT, bezwzględna liczba komórek komórek NK Ly49D-Ly49H+, komórek Ly49D+Ly49H- NK i komórek NK Ly49D+Ly49H+ w śledziona i krew były znacząco zmniejszone u myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT po infekcji (ryc. S2, L – W).

Nasze dane sugerują, że w kontrolowaniu zakażenia MCMV przez YTHDF2 wydaje się, że pośredniczą głównie komórki NK Ly49D+Ly49H+. Produkcja granzymu B i IFN- przez komórki NK u myszy Ythdf2ΔNK była porównywalna z produkcją u myszy Ythdf2WT (ryc. S2, X i Y).

Stwierdziliśmy znacząco zmniejszoną produkcję perforyny u myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT zarówno w śledzionie, jak i we krwi 7 dni po zakażeniu (ryc. 3, K – M), co wskazuje, że YTHDF2 wpływa głównie na aktywność przeciwwirusową za pośrednictwem perforyny przeciwko MCMV w komórkach NK. Dane te sugerują, że YTHDF2 ma kluczowe znaczenie dla ekspansji komórek NK i funkcji efektorowej podczas zakażenia MCMV.

YTHDF2 kontroluje homeostazę komórek NK i dojrzewanie końcowe w stanie ustalonym

Powyższe ustalenia, że ​​niedobór Ythdf2 w komórkach NK zwiększa przerzuty nowotworowe i upośledza zdolność komórek NK do kontrolowania zakażenia MCMV, zachęciły nas do zbadania, czy YTHDF2 jest wymagany do utrzymania komórek NK w stanie stacjonarnym.

Jak pokazano na Fig. 4 A, częstotliwość i bezwzględna liczba komórek NK była znacząco zmniejszona we krwi obwodowej, śledzionie, wątrobie i płucach, ale nie w szpiku kostnym (BM) myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT.

Jednakże nie było znaczących zmian wśród wspólnego progenitora limfoidalnego, progenitora komórek pre-NK i udoskonalonego progenitora komórek NK (NKP) w BM (Fathman i in., 2011) pomiędzy myszami Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK (ryc. S3 A), co wskazuje, że W naszym modelu YTHDF2 może nie wpływać na wczesny rozwój komórek NK.

Aby zbadać potencjalne mechanizmy odpowiedzialne za spadek liczby komórek NK u myszy Ythdf2ΔNK, zbadaliśmy proliferację komórek, żywotność i zdolność przemieszczania się komórek NK po delecji Ythdf2 w stanie ustalonym. Odsetek proliferujących komórek NK był porównywalny między myszami Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK, o czym świadczy barwienie Ki67 (ryc. S3 B).

Żywotność komórek NK była również równoważna między myszami Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK, jak wykazano przez barwienie aneksyną V (ryc. S3 C). Aby sprawdzić, czy YTHDF2 wpływa na wyjście komórek NK z BM na obwód, myszom Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK wstrzyknięto dożylnie przeciwciało antyCD45 w celu oznaczenia komórek odpornościowych i uśmiercono po 2 minutach, a ich komórki BM analizowano.

Pozwoliło nam to określić ilościowo liczbę komórek NK w obszarach sinusoidalnych i miąższowych BM, co jest wskaźnikiem przemieszczania się komórek NK z BM do krwi obwodowej w stanie ustalonym (Leong i in., 2015). Wyniki wykazały znaczne zmniejszenie częstości występowania komórek NK CD45+ u myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT w sinusoidach (ryc. 4 B), co wskazuje, że niedobór Ythdf2 upośledza wyjście komórek NK z BM do układu krążenia in vivo .

Komórki odpornościowe ulegają proliferacji homeostatycznej podczas limfopenii wywołanej niektórymi infekcjami wirusowymi lub spowodowanej chemioterapią (Sun i in., 2011). Chociaż odkryliśmy, że YTHDF2 jest zbędny dla proliferacji komórek NK w stanie stacjonarnym, zaobserwowaliśmy znaczny spadek proliferacji komórek podczas zakażenia MCMV (ryc. 3, E – G). Dlatego zbadaliśmy rolę YTHDF2 w regulacji homeostatycznej proliferacji komórek NK w warunkach limfopenicznych in vivo.

Przenieśliśmy taką samą liczbę komórek NK śledziony z myszy CD45.2 Ythdf2ΔNK lub myszy kongenicznych CD45.1 do myszy Rag2-/-Il2rg-/- z niedoborem limfocytów. Wyniki pokazały, że 3. dnia po przeniesieniu komórek większa część komórek NK pochodziła od myszy kontrolnych CD45.1WT niż od myszy CD45.2 Ythdf2ΔNK (ryc. S3 D).

Dalsza analiza wykazała, że ​​redukcja komórek NK u myszy Ythdf2ΔNK była spowodowana upośledzoną proliferacją komórek (ryc. S3 E), ale nie apoptozą komórek (ryc. S3 F), co sugeruje, że YTHDF2 napędza homeostatyczną proliferację komórek NK in vivo w warunkach limfopenicznych.

Dalsze różnicowanie mysich komórek NK można podzielić na stadia niedojrzałe (CD11b-CD27+), średnio dojrzałe (CD11b+CD27+) i terminalnie dojrzałe (CD11b+CD27-) na podstawie poziomów CD11b i CD27 ( Chiossone i in., 2009; Geiger i Sun, 2016).

Odkryliśmy, że ekspresja Ythdf2 wzrastała wraz z dojrzewaniem i że CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− wykazywały odpowiednio najniższy, pośredni i najwyższy poziom ekspresji Ythdf2 (ryc. S3 G), wskazując, że YTHDF2 może brać udział w dojrzewaniu komórek NK. Dlatego zbadaliśmy rolę YTHDF2 w dojrzewaniu komórek NK zdefiniowanym przez markery powierzchniowe komórek CD11b i CD27.

Stwierdziliśmy, że utrata Ythdf2 w komórkach NK spowodowała znaczny spadek częstości występowania terminalnie dojrzałych komórek NK i/lub wzrost liczby niedojrzałych i średnio dojrzałych komórek NK w śledzionie, wątrobie, płucach i krwi, ale nie w BM (ryc. 4 C i Ryc. S3 H), wskazując, że YTHDF2 pozytywnie reguluje dojrzewanie końcowych komórek NK. Zgodnie z tymi danymi, poziomy KLRG1, który jest końcowym markerem dojrzewania komórek NK, były znacząco niższe u myszy Ythdf2ΔNK w śledzionie, wątrobie i płucach, ale nie w BM w porównaniu z myszy Ythdf2WT w odpowiednich narządach lub przedziałach tkanek (ryc. 4 D).

Aby określić, czy zmniejszona liczba dojrzałych komórek NK wskutek niedoboru Ythdf2 jest nieodłączna od komórek, stworzyliśmy chimery u myszy Rag2−/−Il2rg−/− poprzez wstrzyknięcie komórek BM od myszy CD45.1 WT i CD45.2 Ythdf2ΔNK, zmieszanych w proporcji 1:1 stosunek. Jak wykazała cytometria przepływowa 8 tygodni po przeszczepieniu, zmniejszony odsetek końcowych dojrzałych komórek NK pochodził z komórek BM CD45.2 Ythdf2ΔNK w porównaniu z komórkami kontrolnymi CD45.1 WT (ryc. 4 E), co sugeruje, że dojrzewanie terminali komórkowych NK jest kontrolowane przez YTHDF2 jest cechą wewnętrzną komórki.

Czynniki transkrypcyjne T-box, Eomes i Tbet, mają kluczowe znaczenie dla dojrzewania komórek NK (Daussy i in., 2014; Gordon i in., 2012). Barwienie wewnątrzkomórkowe ujawniło znaczące zmniejszenie poziomów białka Eomes w komórkach NK myszy Ythdf2ΔNK w porównaniu z myszami Ythdf2WT (ryc. S3 I). Ponadto odkryliśmy, że zmniejszenie poziomu białka i mRNA Eomesa specyficznie zachodziło w terminalnie dojrzałych (CD11b + CD27-) komórkach NK (ryc. S3, J – L).

Jednakże, w przeciwieństwie do Eomesa, ekspresja Tbet była równoważna w komórkach NK między myszami Ythdf2ΔNK i Ythdf2WT (ryc. S3, I i K), co wskazuje, że YTHDF2 prawdopodobnie reguluje dojrzewanie końcowe komórek NK poprzez celowanie w Eomes.