Regulowana teaflawina kontrola kondensatów imd Drosophila Homeostaza jelitowa i starzenie

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

STRESZCZENIE

Czarna herbata jest najczęściej spożywanym napojem herbacianym na świecie i konsekwentnie odnotowuje się, że ma właściwości przeciwstarzeniowe. Jednak to, czy teaflawiny, jeden z charakterystycznych fitochemikaliów w ekstraktach z czarnej herbaty, biorą udział w regulacji starzenia i długości życia konsumentów, pozostaje w dużej mierze nieznane. W tym badaniu pokazujemy, że teaflawiny odgrywają korzystną rolę w zapobieganiu wyciekom jelitowym i dysbiozie na początku wieku, opóźniając w ten sposób starzenie się Drosophila. Mechanicznie teaflawiny regulują gromadzenie się kondensatu Imd, aby negatywnie regulować nadaktywację sygnałów Imd w jelitach muszki owocowej. Ponadto teaflawiny zapobiegają zapaleniu okrężnicy wywołanemu przez DSS u myszy, co sugeruje, że teaflawiny odgrywają rolę w modulowaniu integralności jelit. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badanie ujawnia mechanizm molekularny, za pomocą którego teaflawiny regulują homeostazę jelit, prawdopodobnie poprzez kontrolowanie koalescencji Imd.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

WPROWADZANIE

Starzenie się, charakteryzujące się pogorszeniem funkcji fizjologicznych w poszczególnych układach narządów i rosnącym ryzykiem choroby i śmierci, obejmuje akumulację uszkodzeń cząsteczek, komórek i tkanek (Alavez i wsp., 2011; Bartke i wsp., 2019; Engeet al., 2017). Identyfikacja funkcjonalnych materiałów lub chemikaliów zapobiegających degradacji biologicznej w celu opóźnienia procesu starzenia i przedłużenia żywotności jest niewątpliwie kluczowa (Bar-ardo i in., 2017; Kapahi i in., 2017). Wcześniejsze badania wykazały, że czarna herbata, najczęściej spożywana herbata na świecie, ma istotne właściwości opóźniające starzenie się (Cameron i in., 2008; Fei i in., 2017; Kumar i Rizvi, 2017; Naumovski i in., 2019 ; Peng i in., 2009; Xiao i in., 2020). Suplementacja diety ekstraktami z czarnej herbaty skutecznie przedłuża żywotność zwierząt doświadczalnych, takich jak robaki (Feet al., 2017), muszki owocowe (Peng i wsp., 2009; Site al., 2011), myszy (Site al., 2011 ; Xiao i in., 2020) oraz szczury (Kumar i Rizvi, 2017).

Powszechnie wiadomo, że ekstrakty z czarnej herbaty zawierają głównie dwa rodzaje fitochemikaliów, a mianowicie katechiny i teaflawiny (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), z których ten ostatni są wytwarzane z katechin przez endogenną oksydazę polifenolową i peroksydazę podczas procesu utleniania w produkcji czarnej herbaty (Li et al., 2013). W serii badań zidentyfikowano przeciwstarzeniową rolę katechin poprzez poprawę stresu oksydacyjnego i stanów zapalnych związanych z wiekiem oraz zmniejszenie uszkodzeń tkanek (Cameron i in., 2008; Niu i in., 2013; Peng i in., 2009; Si i in. 2011; Waaner i in., 2015). Jednak badania funkcjonalne dotyczące wkładu TF do starzenia się są znacznie opóźnione w stosunku do badań nad katechinami, ponieważ trudno jest wyekstrahować wystarczające ilości TF z liści czarnej herbaty do badań medycznych (Takemoto i Takemoto, 2018). Ostatnio opracowano kilka metod biosyntezy do masowej produkcji TF (Takemoto i Takemoto, 2018), co umożliwia zbadanie dokładnych efektów biologicznych TF i leżących u ich podstaw mechanizmów regulacyjnych.

Ostatnio coraz więcej danych wskazuje na kluczową rolę jelit w procesie starzenia się i modulacji długości życia (Guo i in., 2014; Jji i in., 2019; Maynard i Weinkove, 2018; Rothenberg i Zhang, 2019; Salazar i in. 2018). Nabłonek jelitowy, który działa jak selektywna bariera, umożliwia wchłanianie składników odżywczych, jonów i wody oraz ogranicza kontakt gospodarza ze szkodliwymi jednostkami, w tym mikroorganizmami, antygenami pokarmowymi i toksynami środowiskowymi (Capo i in., 2019; Nicholson i in. , 2012; Ryu i wsp., 2010). Jako tkanka o dużej rotacji u osobników, przewód pokarmowy zapewnia najlepsze środowisko życia dla symbiotycznych mikroorganizmów, w tym naturalne warunki beztlenowe, obfite składniki odżywcze oraz odpowiednią temperaturę i pH

Ryc. 1. Teaflawiny przedłużają żywotność Drosophila i poprawiają zdolność wspinania się

(A i B) Samice muszek owocowych hodowano ze standardowym pokarmem, który został uzupełniony teaflawinami 1 mg/ml lub 2,5 mg/ml (TF) lub bez TF jako podstawa. Muchy przenoszono do świeżych fiolek zawierających nowe pożywki co drugi dzień, a martwe muchy oceniano przez cały okres dorosłego życia, analizowano i pokazano krzywe przeżycia (A) i średnią długość życia (B) samic much.

(Cand D) Kobiety w18 były karmione standardowym pokarmem Drosophila (określanym jako Basal) lub pokarmem uzupełnionym odpowiednio 1mg/ml lub 2,5mg/ETF. Sześć niezależnych grup much we wskazanym wieku (odpowiednio 10 dni, 30 dni, 40 dni i 50 dni) poddano testom żywienia cafe(C) i fluoresceiną (D). wartości, tworząc nisze zajmowane przez określone gatunki bakterii w organizmie (Bonfini i in., 2016; Buchon i in., 2013; Nicholson i in., 2012). Tymczasem te symbiotyczne mikroorganizmy i ich metabolity również bezpośrednio lub pośrednio wpływają na przetwarzanie składników odżywczych; trawienie i wchłanianie; Balans energetyczny; funkcja odpornościowa; rozwój i dojrzewanie przewodu pokarmowego; oraz wiele innych ważnych czynności fizjologicznych (Bonfini i in., 2016; Broderick, 2016; Maynard i VVeinkove, 2018; Nicholson i in., 2012). Obustronnie korzystny związek między dwoma symbiontami może utrzymać stabilność i dynamiczną równowagę mikroekosystemu jelitowego (Bonfini et al.,2016; Brodeerick,2016; Broderick et al.,2014; Guo et.,2014; May-nard i Weinkove, 2018; Nicholson i in., 2012).

cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Szereg badań wykazało, że wrodzona odpowiedź immunologiczna ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy mikrobioty jelitowej i jest zachowana od bezkręgowców do kręgowców (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Kumar i in., 2010). U Drosophila we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej biorą udział dwa główne szlaki sygnałowe, a mianowicie szlak Toll i szlak niedoboru odporności (Imd) (Lu i wsp., 2020; Myllymakiet i wsp., 2014; Valanne i wsp., 2011). Warto zauważyć, że szlak Drosophila Toll jest podobny do ssaczego receptora interleukiny -1 (IL-1R) i zależnego od MyD88-receptora Toll-podobnego (TLR), podczas gdy szlak Imd jest podobny do szlaku receptora czynnika martwicy nowotworu (TNFR) i szlaku TLR zależnego od TRIF u ssaków (Imler, 2014; Myllymaki i wsp., 2014; Valanne i wsp., 2011). Te dwa szlaki kontrolują ekspresję peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NF-kB (Imler, 2014; Myllymaki i wsp., 2014; Valanne i wsp., 2011).bioflawonoidySzlak sygnałowy Imd jest normalnie aktywowany przez zakażenie bakteriami Gram-ujemnymi i powoduje ekspresję innego zestawu AMP, takiego jak Attacin, Cecropin i Diptericin (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki i wsp., 2014). Ekspresja tych AMP wymaga receptora białka rozpoznającego peptydoglikan (PGRP)-LC na szlaku Imd oraz zależnego od sygnału rozszczepienia i jądrowej translokacji Relish, czynnika transkrypcyjnego z rodziny NF-kB (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki i wsp., 2014). Ostatnie badania wykazały, że tworzenie amyloidu jest wymagane do aktywacji szlaku Drosophila Imd po rozpoznaniu bakteryjnych peptydoglikanów (Kleino i wsp., 2017). Jednakże, czy ten kondensat Imd jest zaangażowany w inne procesy biologiczne, takie jak utrzymanie homeostazy jelitowej i regulacja starzenia, pozostaje w dużej mierze nieznane.

W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy muszki owocowe i myszy jako modele zwierzęce do zbadania roli TF w kontrolowaniu integralności jelit i starzenia się. Wykazaliśmy, że TF opóźniają nadmierną proliferację jelitowych komórek macierzystych z wiekiem, chronią przed dysbiozą mikrobiomu jelitowego i zapobiegają aktywacji szlaku sygnałowego Imd, przedłużając w ten sposób żywotność Drosophila. Dalsze badania mechanistyczne wykazały, że TF negatywnie przyczyniają się do sygnalizacji Imd mogą być raczej poprzez blokowanie kondensacji Imd niż jej ubikwitynacji. Ponadto odkryliśmy, że TF są bardzo skuteczne w zapobieganiu zapaleniu okrężnicy wywołanemu przez DSS u myszy. Podsumowując, nasze odkrycia ujawniają potencjalną rolę TF w modulowaniu zachowania Imd, co może być kluczowym czynnikiem w ich pozytywnym wpływie na homeostazę jelitową i wydłużenie życia.

WYNIKI

Suplementacja diety teaflawinami wydłuża żywotność Drosophila

Aby zbadać, czy teaflawiny (TF) wpływają na starzenie się i długość życia Drosophila, hodowaliśmy samice muchówek w'118 ze standardową karmą hodowlaną, która została uzupełniona 1 mg/ml lub 2,5 mg/ml TF i przeprowadziliśmy testy długości życia, jak opisano wcześniej (Ji i in. .,2019). Muchy karmione dietą uzupełnioną równą objętością rozpuszczalnika TF (H2O) uznano za kontrolę. Jak pokazano na Rysunku 1A, dodanie do diety stosunkowo niskiego stężenia TF (1 mg/ml) nieznacznie przedłużyło żywotność muszki owocowej, a wysokie stężenie TF (2,5 mg/ml) miało znacząco pozytywny wpływ na wydłużenie życia. Warto zauważyć, że długoterminowe wychwytywanie wysokich stężeń TF (2,5 mg/ml) spowodowało około 8 dni wydłużenia średniej długości życia samic muszek (Figura 1B), co sugeruje korzystną rolę TFsin w regulacji długowieczności u Drosophila. Podobne wyniki uzyskano, gdy testowaliśmy potencjalny wpływ dodatkowych TF na długość życia samców much w''*'''8 (ryc. S1A i S1B).

Rycina 2. Teaflawiny zapobiegają dysbiozie jelit i dysbiozie mikroflory u Drosophila

(A i B) Utratę integralności jelit oceniano za pomocą Smurftestu w wieku 10 dni, 30 dni, 40 dni i 50 dni u dorosłych kobiet w wieku 18 lat. Przykłady nie-Smerfów i Smerfów pokazano w (A). Odsetki smerfów w różnych wskazanych grupach zostały przeanalizowane i pokazane w (B).

(C) Przeanalizowano i pokazano obfitość bakterii zachowaną przez qPCR genu 16S rRNA w plikach żeńskich w18 z różnych wskazanych grup.

(DF) Przeprowadzono sekwencjonowanie komensalnego bakteryjnego genu 16S rRNA. Przeanalizowano i przedstawiono proporcje taksonów bakteryjnych (D), mapę cieplną głównych taksonów drobnoustrojów (F) oraz względną liczebność Gammaproteobacteria (F).

Rysunek 2. Ciąg dalszy

(G i H) Jelita wypreparowano ze wskazanych samic much karmionych 2,5 mg/ml TF lub bez TF jako kontroli w wieku 10 i 40 dni. Obrazy szkiełek jelita środkowego rejestrowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej dla sygnałów GFP (G). Analiza statystyczna pokazująca odsetek komórek GFP-dodatnich jest pokazana w (H).

(I) Jelita ze wskazanych samic muszek zebrano i poddano testom immunobarwienia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko fosforylowanemu histonowi 3(pH3). Przeanalizowano i pokazano wyniki statystyczne określające ilościowo pH3-komórek dodatnich na jelito. W B, C, H i dane są analizowane za pomocą dwustronnego testu Studenta i są pokazane jako średnie ± SEM.NS, nieistotne,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

Wiadomo, że ETF-y mają gorzki smak, a gorzkiej żywności zwykle unikają zarówno konsumenci, w tym muszki owocowe, jak i ssaki (Yamazaki i in., 2014; Yang i in., 2018). Następnie staraliśmy się wyjaśnić, czy TF mogą wpływać na spożycie pokarmu przez Drosophila, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że ograniczenie diety prowadzi do wydłużenia życia zarówno kręgowców, jak i bezkręgowców (Hudry i in., 2019; Kapahi i in., 2017; Moger-Reischer i in. ., 2020). Aby to zrobić, najpierw przeprowadziliśmy test cafe, szeroko stosowane podejście do bezpośredniego i dokładnego pomiaru tempa karmienia przy użyciu podajnika kapilarnego zawierającego pożywkę płynną, jak opisano wcześniej (Ja i in., 2007). Jak pokazano na rysunkach 1C i S1C, suplementacja diety TF (odpowiednio 1 mg/ml i 2,5 mg/ml) prawie nie zmieniła spożycia pokarmu przez testowane muchy. Aby to dodatkowo potwierdzić, użyliśmy fluoresceiny jako znacznika żywności (Rera i wsp., 2012; Wang i wsp., 2005) i przeprowadziliśmy test naturalnego żywienia (Danilov i wsp., 2015). Jak pokazano na rycinach 1D i S1D, nie zaobserwowaliśmy żadnych korelacji między suplementacją TF a poziomem spożycia pokarmu. Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że korzystna rola TF w przedłużaniu życia może nie wynikać z ograniczeń dietetycznych u Drosophila.

Dodatkowe TF są zbędne, aby wpływać na homeostazę energii Drosophila

Sugerowano, że polifenole z czarnej herbaty mają pozytywny wpływ na zapobieganie otyłości poprzez hamowanie trawienia, wchłaniania i spożycia lipidów i sacharydów, a tym samym zmniejszają spożycie kalorii (Cameron i wsp., 2008). Następnie staraliśmy się wyjaśnić, czy wydłużenie życia LDrosophila regulowane przez TF jest spowodowane zmianami w absorpcji składników odżywczych i magazynowaniu energii. W tym celu najpierw zbadaliśmy poziomy triacyloglicerydów (TAG), jednego z najczęściej wykrywanych metabolitów lipidowych (Tennessen i wsp., 2014), u samic much przez całe ich życie, jak opisano wcześniej (Fan i wsp., 2017).kup cistancheJak pokazano na Figurze 1E, leczenie TF prawie nie wpłynęło na ogólną liczebność TAG w różnych punktach wiekowych. Kiedy dalej wykryliśmy zawartość glikogenu i obliczyliśmy ilościowo krążące węglowodany (glukoza i trehaloza) za pomocą zestawu Hexokinase (Li i in., 2018; Ten-nessen i in., 2014), wyniki wykazały, że nie było oczywistych zmian między próbkami z lub bez traktowania TF (rysunki 1F -1 H). Warto zauważyć, że spójne wyniki uzyskano, gdy zbadaliśmy fenotypy metaboliczne wykorzystujące samce w118 jako modele zwierzęce (rysunki S1E-S1H). Łącznie dane te sugerują, że suplementacja diety TF jest zbędna w regulacji homeostazy węglowodanów i energii przez cały okres życia Drosophila.

Dalej zbadaliśmy kinetykę naturalnego starzenia Drosophila pod wpływem dietetycznej interwencji TF, wykonując szybkie iteracyjne testy negatywnej geotaksji (RING), jak opisano wcześniej (Dilliane i in., 2017; Staats i in., 2018). Jak pokazano na rycinach 1l, 1J, S1l i S1J, pnące się wskaźniki wieku (40 dni) w1118 (zarówno kobiety, jak i mężczyźni) w grupach suplementacji TF uległy znacznej poprawie (prawie 12% wzrost u kobiet i prawie 18% wzrost u mężczyzn ) w porównaniu z grupami kontrolnymi, co sugeruje, że TF potencjalnie poprawiają wspinaczkę Drosophila i czynności ruchowe.

Teaflawiny zapobiegają wyciekom jelitowym i dysbiozie mikroflory na początku wieku

Wcześniejsze badania wykazały, że aktywność lokomotoryczna muszki owocowej i długość życia są silnie związane ze stanem zdrowia gospodarza, takim jak płeć, dieta, wiek i genotyp (Caruso i in., 2013; Heintz i Mair, 2014). Ostatnio kilka linii dowodowych dowiodło, że zachowanie homeostazy jelitowej sygnalizacji IMD poprawia integralność jelit poprzez zapobieganie nadmiernej proliferacji ISC i komórek prekursorowych oraz opóźnianie dysfunkcji nabłonka jelitowego z wiekiem, co z kolei pozytywnie wpływa na zdrowie organizmu (Clark i in. , 2015; Guo i in., 2014). U Drosophila skrócona długość życia jest ściśle związana z dysfunkcją jelitowej bariery nabłonkowej, a rozwój integralności tej bariery podczas starzenia powoduje wydłużenie życia (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Dlatego staraliśmy się ustalić, czy TF zmieniają integralność jelita, wykonując test Smurfa, metodę, która została opisana wcześniej (Clark i wsp., 2015; Rera i wsp., 2011). Jak pokazano na rycinie 2A, testowane muszki owocowe, u których niebieskie barwniki były ograniczone do przewodu pokarmowego, określano jako nie-Smerfy (lewy panel na ryc. 2A). Jeśli zaobserwowano niebieskie barwniki

Rysunek 3. Ciąg dalszy

(EG) Jelita wyizolowano z plików samic w1118 karmionych 2,5 mg/ml TF lub bez TF jako podstawowo w wieku odpowiednio 10 dni, 30 dni, 40 dni i 50 dni. Całkowity RNA wyekstrahowano i poddano analizom aRT-PCR. Analizowano i pokazano poziomy ekspresji mRNA dipterycyny (F), attacyny (F) i cekropiny A1(G). W EG dane analizuje się za pomocą dwustronnego testu t-Studenta i przedstawia jako średnie ± SEM.NS, nieistotne, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

wyciekający z jelit do jamy brzusznej żywicieli policzono jako Smerfy (prawy panel na Ryc. 2A). Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami (Clark i in.,2015), proporcje Smerfa ​​stopniowo wzrastały wraz z wiekiem (ryc. 2B). Co ciekawe, proporcje dorosłych Smerfów były znacznie zmniejszone w grupach karmionych TF w porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku u obu samic (z 8,2 do 3,7 procent, z 19,4 do 15,6% i z 35,4 do 27,1 procent dla grup). w wieku odpowiednio 30 dni, 40 dni i 50 dni, Figure2B) i dorosłych mężczyzn (od 2,7% do 0,9%, od 6,9% do 0,9% i od 8,3% do 2,7% w wieku 30 lat). dni, 40 dni i 50 dni, odpowiednio, Rysunek S2A), wskazując, że TF mogą zapobiegać dysfunkcji bariery jelitowej u starszych muszek owocowych. Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy większy spadek odsetka Smerfów u mężczyzn (zmniejszony o prawie 65,8 procent, 86,9 procent i 67,4 procent odpowiednio w wieku 30 dni, 40 dni i 50 dni) niż u osób w wieku dopasowanych samic (spadek o prawie 54,1 procent, 19,5% i 23,3 procent w wieku odpowiednio 30 dni, 40 dni i 50 dni), co sugeruje, że TF mogą odgrywać większą rolę w zmniejszaniu nieszczelności jelit u samców muszek.

Wcześniejsze badania sugerowały, że pojawiająca się wraz z wiekiem dysfunkcja bariery jelitowej jest często skorelowana z dysbiozą mikroflory jelitowej (Clark i in., 2015; Guo i in., 2014). W związku z tym zbadaliśmy skład bakterii komensalnych jelit po suplementacji TF. Najpierw zastosowaliśmy uniwersalne startery i przeprowadziliśmy ilościowe eksperymenty PCR, aby określić ilościowo poziomy bakteryjnego genu 16S rRNA. Jak pokazano na rycinie 2C, w przypadku starszych cięć, całkowita populacja bakterii z grup interwencyjnych TF wykazała uderzające zmniejszenie (prawie 45 procent -55 procent) w porównaniu z grupą kontrolną, co sugeruje, że suplementacja TF prawdopodobnie zapobiega ekspansji mikroflory podczas starzenia . Następnie przeprowadziliśmy metagenomikę, aby szczegółowo zbadać zmiany w społeczności drobnoustrojów jelitowych spowodowane suplementacją diety TF. Jak pokazano na rysunkach 2D-2F, proporcja Gammaproteobacteria, których ekspansja okazała się ściśle związana z niewydolnością bariery jelitowej (Clark i wsp., 2015), została oczywiście zmniejszona przez suplementację TF w starzejących się jelitach ( prawie 7-procentowe zmniejszenie), co oznacza, że ​​TF pozytywnie przyczyniają się do homeostazy mikrobioty jelitowej podczas starzenia się Drosophila.

Teaflawiny poprawiają homeostazę proliferacyjną jelit u Drosophila

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), w którym jelitowe komórki macierzyste (ISC) i komórki progenitorowe znakowano GFP. Jak pokazano na Figurach 2G i 2H, liczba komórek GFP-dodatnich w grupach interwencyjnych TF w wieku 40 dni (zliczono 20 wnętrzności) była znacznie mniejsza (prawie 29,7 procent) niż w grupie kontrolnej dobranej wiekowo (prawie 47,6 procent i Zliczono 19 wnętrzności), co sugeruje, że TF mogą hamować nadmierną proliferację ISC. Ponadto przeprowadziliśmy eksperymenty immunobarwienia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko Phospho-Histone 3(pH3), specyficznemu markerowi komórek mitotycznych w tkankach jelitowych. Zaobserwowaliśmy mniej komórek dodatnich pod względem pH3-w jelitach starszych dorosłych suplementowanych TF (średnia liczba wynosiła 20,6) niż u tych z kontroli (średnia liczba wynosiła 39,5, Ryc. 2). Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że suplementacja diety TF poprawia homeostazę proliferacyjną jelit i zapobiega dysplazji mikrobioty na początku wieku, opóźniając w ten sposób starzenie się Drosophila.

Teaflawiny negatywnie modulują sygnały jelitowe IMD

Aby zbadać leżące u podstaw mechanizmy molekularne, dzięki którym TF pozytywnie przyczyniają się do homeostazy jelit Drosophila, przeprowadziliśmy analizę sekwencji RNA z wykorzystaniem dopasowanych wiekowo próbek jelit od dorosłych samic w1118 leczonych z lub bez TF. Analizy fragmentów na kilozasadę na milion (FPKM) sugerowały, że ogólne wzorce ekspresji genów były podobne w obu grupach eksperymentalnych (Figura 3A). Jednak dalsza analiza różnicowej ekspresji zidentyfikowała w sumie 229 genów o zróżnicowanej ekspresji, z których 99 uległo regulacji w górę, a 126 w dół (Figura 3B). Co ciekawe, analiza ontologii genów tych genów wykazała, że ​​szlak odpowiedzi immunologicznej został silnie zmieniony przez suplementację diety TF (ryc. 3C).

U Drosophila wykazano, że wrodzone szlaki sygnalizacji immunologicznej odgrywają dominującą rolę w regulacji homeostazy jelit i długowieczności (Clark i in., 2015; Guo i in., 2014). Następnie skupiliśmy się na badaniu wzorców ekspresji peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) w dół od wrodzonych sygnałów immunologicznych. Jak pokazano

Rysunek 4. Ciąg dalszy

(D) Oczyszczone białka Imd inkubowano z różnymi stężeniami TF (odpowiednio 50 μM, 100 μM i 200 μM) w temperaturze pokojowej przez 5 min. Próbki poddano następnie analizie widma emisji fluorescencji przy wskazanych długościach fal (wzbudzenie przy 430 nm, emisja od 450 nm do 550 nm przy szerokości szczeliny 5 nm). Jako kontrolę wyjściową zastosowano próbkę bez TF.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Muchy Myc-Imd przygotowano i inkubowano z TFs（100μM） w temperaturze pokojowej przez 30 min. Testy SDD-AGE (górny panel w E) i SDS-PAGE (dolny panel w E) przeprowadzono w celu analizy agregatów białek Imd. Jako kontrolę obciążenia zastosowano tubulinę.cistanchPrzeprowadzono analizę densytometryczną w celu ilościowego określenia kondensatów Imd w różnych próbkach, a wyniki przedstawiono w (F). (G) Reprezentatywny chromatogram próbki TF.

Oczyszczone białka Flag-Imd （H i I） inkubowano z TF, TF1, TF2a, TF2b lub TF3（100 μM dla każdej próbki）lub z równą objętością buforu（kontroli）w temperaturze pokojowej przez 30 minut, jak wskazano. Próbki poddano następnie testom SDD-AGE (górny panel w H) i SDS-PAGE (dolny panel w H) w celu określenia wzorców agregacji Imd. Przeprowadzono analizę densytometryczną w celu ilościowego określenia kondensatów Imd w różnych próbkach i pokazano ją w (). W C, F i I dane analizuje się za pomocą dwustronnego testu Studenta i przedstawia jako średnie ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

na rycinie 3D, geny AMP zarządzane przez szlak niedoboru odporności (Imd), w tym dipterycyna A (DptA), dip-terycyna B (DptB), attacyna A (AttA), cekropina A1 (CecA1), cekropina A2 (CecA2) i cekropiny C (Cece) uległy znacznemu zmniejszeniu (odpowiednio o 39,4 procent, 72,3 procent, 10,5%,860,5 procent, 99,8 procent i 36,1 procent) w grupach leczonych TF w porównaniu z grupami kontrolnymi. Aby dodatkowo potwierdzić wyniki uzyskane z analizy sekwencji RNA, przeprowadziliśmy ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (gRT-PCR) w celu ilościowego określenia względnych poziomów ekspresji genów AMP związanych z Imd w próbkach jelita Drosophila uzyskanych w czterech różnych punktach wiekowych w tym 10 dni, 30 dni, 40 dni i 50 dni. Jak pokazano na rycinach 3E-3G, poziomy ekspresji mRNA niektórych genów, w tym dipterycyny, attacyny i cekropiny A1, uległy znacznemu obniżeniu (o prawie 35,9% -66,6%) w traktowanych TF starzejące się wnętrzności. Łącznie nasze dane ujawniły, że TF potencjalnie antagonizowały aktywację szlaku sygnałowego Imd w komórkach jelit Drosophila podczas starzenia.

Teaflawiny są zbędne do regulacji transkrypcji szlaku Imd lub ubikwitynacji Imd

Staraliśmy się zbadać związek między TF i Imd i przeprowadziliśmy test powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), jak opisano wcześniej (Lan i in., 2020). Jak pokazano na rysunku 4A. TF wykazywały umiarkowane powinowactwo wiązania z oczyszczonym białkiem Imd przy szacowanej stałej Kp wynoszącej 8,078 uM. Następnie dążymy do określenia, w jaki sposób TF kontrolują jelitowy szlak sygnalizacyjny Imd. Na podstawie wyników analizy transkryptomu z danych sekwencji RNA stwierdziliśmy, że poziomy ekspresji kluczowych czynników regulatorowych w ścieżce sygnalizacyjnej Imd, takich jak PGRP-LC, Imd i Relish, prawie nie uległy zmianie przez traktowanie TF (ryc. S3A ). Następnie pobraliśmy próbki jelit od much, które w różnym wieku poddano suplementacji diety z lub bez TF, i przeprowadziliśmy eksperymenty qRT-PCR, aby specyficznie wykryć wzorce ekspresji tych genów. Jak pokazano na rysunku S3B, poziomy mRNA niektórych genów, w tym effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny i diap2, były podobne w grupach kontrolnych i grupy interwencyjne TF, co sugeruje, że TF nie są zaangażowane w regulację sygnałów Imd na poziomie transkrypcyjnym.

Następnie zbadaliśmy profile ubikwitynacji Imd, ponieważ poprzednie badania sugerowały, że ubiguitynacja Imd jest niezbędna dla przekazywania sygnału w dół szlaku Imd (Myllymaki i in., 2014; Zhou i in., 2005). Najpierw przeprowadziliśmy test przesunięcia E1 in vitro i stwierdziliśmy, że traktowanie TF nie ma widocznego wpływu na reakcje enzymatyczne E1 i ubikwityny z wytworzeniem sprzężonego E1/Ub (Figura S4A). Ponadto transfekowaliśmy komórki Drosophila S2 plazmidami wyrażającymi znakowany Flag Imd razem z Ub znakowanym HA, a następnie traktowaliśmy komórki z lub bez TF. Dalsze testy ubikwitynacji sugerowały, że suplementacja TF ledwo wpływała na poziomy ubikwitynowanej Imd w hodowanych komórkach (Figury S4B i S4C). Aby określić związki między TF a ubikwitynacją Imd in vivo, wykorzystaliśmy transgeniczną muchę P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (określaną jako NP1* s > Myc-Imd), w którym znakowane Myc białko Imd było silnie wyrażane w komórkach jelitowych (Figura S4D). Nasze eksperymenty z ubikwitynacją wykazały, że suplementacja dietą TF była niezbędna do modulowania ubikwitynacji Imd w tkankach jelitowych (ryc. S4D i S4E). Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że TF negatywnie rządzą sygnałami Drosophila Imd, nie wpływając na wzór ubikwitynacji Imd.

Teaflawiny zapobiegają gromadzeniu się kondensatu Imd

Ostatnie badania sugerują, że agregacja Imd jest niezbędna do aktywacji genów w dół szlaku Imd (Kleino i wsp., 2017). Następnie staraliśmy się zbadać, czy TF regulują proces

Rysunek 5. Ciąg dalszy

(F i G) Samice w18 (określane jako imd plus / plus ), imd' heterozygotyczne i homozygotyczne mutanty (określane odpowiednio jako imd plus /- i imd-/-) były hodowane standardowymi pokarmami Drosophila (określanymi jako Basal) lub suplementacja diety 2,5 mg/ml (określane jako TF), a następnie poddano je testowi długości życia Krzywa przeżycia (F) i średnia długość życia (G) zostały przeanalizowane i pokazane.

W i F do analizy statystycznej zastosowano test Log Rank. W BE i, do analizy statystycznej zastosowano dwustronny test t-Studenta, a dane są sh jako średnie ± SEM. NS, nieistotne, *p<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Tworzenie agregatów IMD. Najpierw oczyściliśmy białka Imd znakowane Myc z hodowanych komórek S2 i inkubowaliśmy białka z różnymi stężeniami TF (Figura 4B). Co ciekawe, odkryliśmy, że TF znacznie zapobiegały agregacji Imd (zmniejszone o 81,7% -89,7%, Figury 4B i 4C), jak sugerują nasze testy elektroforezy na żelu agarozowym z półdenaturującym detergentem (SDD-AGE). Aby potwierdzić to odkrycie, przeprowadziliśmy dalej testy wiązania tioflawiny-T i uzyskaliśmy spójne wyniki (Figura 4D). Na koniec wyhodowaliśmy transgeniczne muchy NP1ts > Myc-Imd, które poddano suplementacji diety z lub bez TF, i pobraliśmy próbki jelit od starszych dorosłych osób. Eksperymenty SDD-AGE sugerowały, że agregacja Imd była znacznie obniżona przez TF w komórkach jelitowych (spadek o 16,7% -22 procent, Figury 4E i 4F).

Aby określić, w jaki sposób TF przyczyniają się do kontrolowania gromadzenia się kondensatu Imd, poddaliśmy TF analizie HPLC i stwierdziliśmy, że zawierają głównie cztery rodzaje monomerów (Rysunek 4G), a mianowicie teaflawinę (TF1), 3-O-galusan teaflawiny ( TF2a), 3'-O-galusan teaflawiny (TF2b) i 3,3'-di-O-galusan teaflawiny (TF3), które były zgodne z wcześniejszymi doniesieniami (Li i in., 2013; Takemoto i Takemoto, 2018) . Następnie inkubowaliśmy każdą z tych substancji chemicznych z oczyszczonym białkiem Imd i przeprowadziliśmy eksperymenty SDD-AGE. Jak pokazano na rysunkach 4H i 4l, traktowanie wszystkich tych monomerów TF spowodowało znaczną redukcję (odpowiednio o 59,5%, 60,9%, 58,4%, 58,2% i 55,8% dla TF, TF1, TF2a, TF2b i TF3) w poziomy zagregowane Imd. Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że TF negatywnie regulują szlak sygnalizacyjny Imd Drosophila prawdopodobnie poprzez kontrolowanie zachowania kondensatów Imd.

Teaflawiny wydłużają życie Drosophila w sposób zależny od Imd

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>plus) muchy. ponieważ Relish jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym odpowiedzialnym za ekspresję genów AMP Imd-downstream (Myllymaki i wsp., 2014). Jak pokazano w Fiqures S5C i S5D. dodatek dietetyczny TF znacznie przedłużył żywotność much kontrolnych, a temu wydłużeniu życia znacznie zapobiegano u much Relish RNAi. Łącznie nasze dane wskazują, że suplementacja diety TF pozytywnie wpływa na długość życia Drosophila, prawdopodobnie w zależności od sygnałów jelitowych Imd.

Aby sprawdzić, czy przedłużenie życia przez TF nadal występuje na tle aksenicznym, przeprowadziliśmy testy długości życia na kobietach w1118 w warunkach aksenicznych. Jak pokazano na rysunkach S5E i S5F, dodanie różnych stężeń TF (1 mg/ml i 2,5 mg/ml) prawie nie wpłynęło na wskaźniki śmiertelności i średniej długości życia dorosłych w 18. roku życia. Ponieważ aksenowe warunki hodowlane mogą w dużej mierze zapobiegać obfitej florze bakteryjnej, ograniczając w ten sposób sygnały Imd w cięciach (Clarke al., 2015), nasze dane sugerują, że TF przedłużają żywotność Drosophila mogą być poprzez modulację wrodzonych sygnałów odpornościowych regulowanych przez mikrobiotę jelitową.

Rycina 6. Teaflawiny łagodzą wywołane DSS zapalenie okrężnicy u myszy CD-1

(A) Traktowanie TF nie miało wpływu na spożycie wody w różnych grupach myszy CD-1.

(BD) Podawanie przez zgłębnik różnych stężeń TF (odpowiednio 1 mg/ml, 2,5 mg/ml i 5 mg/ml) złagodziło skrócenie okrężnicy i powiększenie śledziony spowodowane przez DSS u myszy CD-1. Przedstawiono reprezentatywne obrazy (B) i analizy statystyczne okrężnicy (C) i śledziony (D). (E) Podawanie różnych stężeń TF (odpowiednio 1 mg/ml, 2,5 mg/ml i 5 mg/ml) zapobiegało wyciekowi jelitowemu indukowanemu przez DSS u myszy CD-1. (F i G) Okrężnice pobrano ze wskazanych grup myszy. Całkowity RNA wyekstrahowano i poddano testom qRT-PCR w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA TNFα(F) i IL-6 (G).

(HL) Okrężnice z różnych grup myszy zebrano wzdłużnie i poddano testom barwienia HE. Próbki zbadano pod mikroskopem i otrzymano i pokazano reprezentatywne obrazy wskazanych próbek （HL）. Skala, 40 μm. (M-Q') Obrazy SEM przedstawiające mikrotrichomy okrężnicy z różnych wskazanych próbek. Słupki skali, 50 um (MQ) i 4 um (M'-Q').

W CG dane analizuje się dwustronnym testem Studenta i przedstawia jako średnie ± SEM.NS, nieistotne, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Teaflawiny łagodzą zapalenie okrężnicy wywołane DSS u myszy CD-1

W celu dalszego zbadania potencjalnej roli TF w utrzymaniu homeostazy jelitowej u ssaków wykorzystano myszy CD-1 do wywołania zapalenia okrężnicy przez siarczan sodu dekstranu (DSS). Myszom podawano dożołądkowo różne stężenia TF (1 g/l, 2,5 g/l lub 5 a/l) lub wodę jako kontrolę przez cztery tygodnie, a następnie traktowano 2% DSS w wodzie pitnej przez 7 dni. Aby zobaczyć, czy TF wpływają na ilość picia DSSa w różnych grupach myszy, codziennie monitorowaliśmy picie myszy. Jak pokazano na Fiqure6A, leczenie TF jest zbędne w celu wpływania na spożycie napojów u myszy z zapaleniem okrężnicy wywołanym DSS, myszy leczone DSS wykazywały zespół zapalenia okrężnicy z biegunką i/lub hematochezą, którym zapobiegało zależne od dawki leczenie TF (Figury S6A-S6E).cistanche AustraliaCo więcej, interwencja TF uratowała zmniejszenie długości okrężnicy spowodowane przez DSS i złagodziło powiększenie śledziony (ryc. 6B-6D).

Następnie użyliśmy dekstranu-4000-FITC (FITC-DX) do zbadania funkcji bariery jelitowej tych myszy. Jak pokazano na Rysunku 6E, myszy z grup leczonych DSS wykazywały wysokie stężenie FITC-DX w próbkach krwi, co wskazuje na wyciek z jelit u tych zwierząt. Jednak interwencja z użyciem TF znacząco zapobiegała transportowi FITC-DX z narządów trawiennych do układ krążenia (zmniejszony o 56,1 procent -77,5 procent , Rysunek 6E). Warto zauważyć, że podawanie TF nie zmieniło przepuszczalności jelit myszy w normalnych warunkach (Figura S6F). Ponieważ stan zapalny odgrywa kluczową rolę w rozwoju zapalenia okrężnicy w mysim modelu, przeprowadziliśmy dalej eksperymenty qRT-PCR, pokazując, że leczenie TF istotnie obniżyło ekspresję IL-6 i TNF w jelitach myszy leczonych DSS (Figury 6F i 6G).

W celu dalszej analizy zmian patologicznych w okrężnicy wykonaliśmy testy barwienia hematoksyliną-eozyną (HE). Jak pokazano na Figurach 6H-6L i S6G-S6J, wywołane DSS poważne uszkodzenie nabłonka zostało znacznie złagodzone przez leczenie TF w sposób zależny od dawki. Obrazowanie tych próbek jelit za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej dalej dostarczyło spójnych wyników (Figury 6M-6Q' i S6K-S6N'). Podsumowując, nasze odkrycia wskazują, że TF odgrywają korzystną rolę w ochronie funkcji bariery jelitowej zarówno u owadów, jak i ssaków.

DYSKUSJA

W tym badaniu zbadaliśmy fizjologiczne funkcje TF w modulowaniu homeostazy jelitowej i długowieczności oraz leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Wykazaliśmy, że suplementacja diety TF pozytywnie przyczynia się do zapobiegania dysbiozie flory jelitowej na początku wieku i opóźnienia dysfunkcji nabłonka jelit, przedłużając w ten sposób żywotność Drosophila. Nasze badania mechanistyczne in vitro i in vivo wykazały, że TF prawdopodobnie odgrywają negatywną rolę w kontrolowaniu szlaku sygnałowego Imd poprzez blokowanie koalescencji Imd. Co więcej, odkryliśmy, że zapalenie okrężnicy wywołane DSS może być skutecznie złagodzone przez suplementację TF u myszy CD-1. Nasze wyniki potwierdzają pogląd, że TF korzystnie przyczyniają się do homeostazy jelitowej zarówno u bezkręgowców, jak i kręgowców.

Suplementacja diety teaflawinami przedłuża żywotność Drosophila

Spożywanie herbaty jest popularne na całym świecie i ustępuje tylko spożyciu wody (Rothenberg i Zhang, 2019). Liczne badania koncentrowały się na funkcjach fizjologicznych, często poprzez podejścia eksperymentalne i kliniczne (Cameron i in., 2008; Niu i in., 2013; Peng i in., 2009; Rothenberg i Zhang. 2019; Spindleret i in., 2013; Takemoto i Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Szeroko wykazano, że herbata korzystnie wpływa na zdrowie poprzez obniżanie poziomu lipidów i działanie przeciw otyłości, a głównymi funkcjonalnymi związkami w herbacie są katechiny, zwłaszcza Galusan epigallokatechiny (EGCG) (Abbas i Wink, 2009; Modernelli i wsp., 2015; Niu i wsp., 2013; Wagner i wsp., 2015; Xiong i wsp., 2018). czarna herbata może wydłużyć żywotność i żywotność muszek owocowych (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), robaków (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) i szczurów (Imran et al., .,2018; Niu i wsp. 2013), a głównym mechanizmem regulacyjnym jest skuteczne zapobieganie stresowi oksydacyjnemu przez EGCG poprzez modulację sygnałów ROS.korzyści cistanche,Jednak to, czy TF, jako charakterystyczne „złote” związki w czarnej herbacie, odgrywają rolę w regulowaniu starzenia i długości życia, pozostaje w dużej mierze nieznane. Badanie to dostarcza przekonujących dowodów wskazujących, że interwencja TF jest zbędna, jeśli chodzi o wpływ na spożycie pokarmu, a długoterminowe wchłanianie TF poprzez dietę znacznie wydłuża żywotność zarówno samców, jak i samic muszek owocówek. Odkrycia te dostarczają wskazówek do dalszych badań nad funkcjami TF w długowieczności ssaków.

Teaflawiny poprawiają dysbiozę flory bakteryjnej na początku wieku i promują homeostazę jelit Postępujący brak równowagi homeostazy proliferacyjnej i zdolności do regeneracji jest cechą charakterystyczną starzenia się i chorób wieku starczego (Clark i in., 2015; Heintz i Mair, 2014; Maynard i Weinkove, 2018; Rera i wsp. 2012). Przewlekły stan zapalny wiąże się z utratą homeostazy i zwiększoną zachorowalnością na raka w starzejących się organizmach (Bartke i wsp., 2019; Kapahi i wsp., 2017; Xiao i wsp., 2020). Jest to szczególnie istotne w przypadku nabłonka barierowego, takiego jak nabłonek jelitowy (Guo i wsp., 2014; Maynard i Weinkove, 2018). Dzięki modelowi rozwoju dysplazji związanej z wiekiem w starzejącym się jelicie wykazaliśmy, że poprawa interakcji gospodarz-komensal w starzejącym się nabłonku barierowym może promować zdrowie i długość życia. Zastosowaliśmy szereg nieinwazyjnych podejść do oceny funkcji jelit i dynamiki mikroflory podczas starzenia. Po pierwsze, test Smurfa wykazał pozytywną rolę TF w regulowaniu dysfunkcji bariery nabłonkowej podczas starzenia. Następnie test barwienia immunologicznego z użyciem kilku transgenicznych muszek ujawnił, że TF opóźniają nadmierną proliferację ISC i rotację zróżnicowanych komórek. Wreszcie, sekwencjonowanie mikrobiomu sugerowało, że TF regulują w dół ekspansję mikroflory komensalnej jelit, która pojawia się wraz z wiekiem. Wyniki te wyraźnie wskazują, że TF odgrywają kluczową rolę w opóźnianiu procesu starzenia gospodarza poprzez utrzymywanie homeostazy jelit.

Teaflawiny łagodzą nadmierną odpowiedź immunologiczną w jelitach poprzez negatywną regulację sygnalizacji IMD

Zasugerowano, że delikatna równowaga między funkcją odpornościową jelit a mikrobiotą musi być zachowana, aby zapewnić długoterminową homeostazę nabłonka barierowego (Guo i wsp., 2014; Maynard i Weinkove, 2018). Wcześniejsze badania wykazały również, że przewlekłe nadmierne zapalenie jelit jest związane z dysfunkcją związaną z wiekiem w nabłonku barierowym i jest cechą charakterystyczną starzenia (Clark i wsp., 2015; Guo i wsp., 2014; Ji i wsp., 2019). . Zatem utrzymanie zdrowej populacji komensalnej poprzez zachowanie wrodzonej homeostazy immunologicznej w takim nabłonku jest obiecującym podejściem do promowania zdrowia i długowieczności (Bonfini i in., 2016; Broderick, 2016; Clark i in., 2015). które TF opóźniają starzenie, przeprowadziliśmy analizę sekwencji RNA przy użyciu wyciętych jelit z lub bez leczenia TF. Nasze dane sugerują, że grupa genów o wysokiej ekspresji w jelitach kontrolnych muszek owocowych w porównaniu z grupą zwierząt traktowanych TF została wzbogacona o geny sklasyfikowane jako geny „odpowiedzi immunologicznej”. Dalsze analizy bioinformatyczne i testy get-PCR ujawniły, że ekspresja genów AMP związanych z Imd została dramatycznie zahamowana przez dodanie do diety TF. Wyniki eksperymentów na myszach CD-1 wykorzystujących DSS do indukowania nieprawidłowych odpowiedzi immunologicznych w jelitach dodatkowo potwierdziły pogląd, że TF działają jako protektory przed zapaleniem jelit.

Teaflawiny tłumią sygnały, określając zespół amyloidowy Imd

W jaki sposób TF negatywnie regulują szlak sygnałowy Imd? Na podstawie wyników analizy transkryptomu stwierdziliśmy, że TF są zbędne w regulacji transkrypcji kluczowych czynników szlaku sygnałowego Imd. Interesujące, zaobserwowaliśmy widoczne powinowactwo wiązania TF z oczyszczonym białkiem Imd w teście SPR, co sugerowało prawdopodobieństwo, że TF mogą odgrywać rolę w kontrolowaniu zachowania białka Imd lub jego potranslacyjnego procesu modyfikacji. Wcześniejsze badania podkreślały kluczową rolę ubikwitynacji w przekazywaniu sygnału imd (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki i wsp., 2014), a zapobieganie ubikwitynacji imd prowadzi do głębokiego wyłączenia sygnalizacji imd (Myllymaki i wsp., 2014; Thevenon i in., 2009). Jednak nasze testy ubikwitynacji in vitro i in vivo wykazały, że TF prawie nie wpływają na wzór ubikwitynacji Imd. Ostatnie badania wykazały, że tworzenie amyloidu jest wymagane do aktywacji szlaku Drosophila Imd po rozpoznaniu bakteryjnych peptydoglikanów (Kleino i wsp., 2017). Co ciekawe, nasze testy SDD-AGE i wiązania ThT sugerowały, że TF zapobiegają koalescencji Imd. Zapobieganie agregacji Imd przez wybicie lub mutację Imd w komórkach jelitowych najwyraźniej odwróciło korzystny wpływ TF na wydłużenie życia. Aby dodatkowo potwierdzić nasze odkrycie, byłoby interesujące zbadanie, czy TF nie są bardziej funkcjonalne w przedłużaniu życia ulotek owocowych, gdy konserwatywny, zaszyfrowany motyw RHIM (cRHIM, aminokwasy od 118 do 121h) motywu Imd jest specyficznie znokautowany, zniszczony, w oparciu o odkrycie, że przestępstwo w imd ma zasadnicze znaczenie dla jego agregacji i tworzenia amyloidu (Kleino i in., 2017). Niemniej jednak nasze badanie podkreśla kluczową rolę TF w kontrolowaniu homeostazy jelitowej i procesu starzenia, być może poprzez modulowanie koalescencji Imd. Przyszłe badania powinny koncentrować się na zbadaniu, które pozostałości lub regiony Imd są wiązane przez TF i jak to wiązanie skutkuje zapobieganiem kondensacji Imd. Co więcej, nasze odkrycia dotyczące układu ssaków wskazują, że TF mogą skutecznie chronić okrężnicę przed zapaleniem wywołanym przez egzogenną trującą substancję chemiczną DSS, co sugeruje zachowaną regulacyjną rolę TF w utrzymywaniu homeostazy jelitowej. Warto zbadać, czy TF odgrywają rolę w zarządzaniu składaniem białek w tkankach ssaków.

Ten artykuł pochodzi z zhongwenxie@ahau.edu.cn