Całkowite glikozydy Cistanche Deserticola wspomagają regenerację funkcji neurologicznych poprzez wywoływanie regeneracji układu nerwowego poprzez szlak Nrf- 2/Keap-1 u szczurów MCAO/R

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang , Ruiyan Li , Pengfei Tu , Jianping Chen , Kewu Zeng i Yong Jiang

Tło:Istnieją doniesienia, że ​​tradycyjna medycyna chińska Cistanche deserticola jest skuteczna w przypadku chorób układu krążenia i naczyń mózgowych. Jednak jego aktywne składniki chroniące przed udarem niedokrwiennym nie są jasne. Naszym celem było zbadanie aktywnych składnikówC. deserticolaudarem niedokrwiennym oraz jego potencjalnymi mechanizmami.Metody:Zbadaliśmy działanie ochronne na mózg ekstraktów z:C. deserticola, całkowite glikozydy (TG), polisacharydy (PS) i oligosacharydy (OS) w szczurzym modelu zamknięcia-reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R). Do oceny objętości zawału mózgu zastosowano barwienie chlorkiem trifenylotetrazoliowym (TTC), a do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB) ​​zastosowano błękit Evansa. Następnie wyrażenia CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, okludyna, Keap-1 i Nrf{{ 12}} analizowano metodą western blotting lub immunofluorescencję, a aktywności MDA, SOD, CAT i GSH-Px analizowano za pomocą zestawów.Wyniki:Leczenie TG znacząco zmniejszyło wyniki deficytów neurologicznych i objętość zawału, promowało angiogenezę i przebudowę neuronalną oraz skutecznie utrzymywało integralność bariery krew-mózg w porównaniu z grupą modelową. Co więcej, TG znacznie zmniejszyły poziomy MDA i zwiększyły aktywność antyoksydacyjną (SOD, CAT i GSH-Px) w mózgu. Tymczasem TG znacząco obniżyły ekspresję Keap-1 i ułatwiły translokację jądrową Nrf-2. Przeciwnie, nie zaobserwowano efektów ochronnych dla grup PS i OS.Wniosek:TG są głównymi aktywnymi składnikamiC. deserticolaprzed uszkodzeniem mózgu wywołanym przez MCAO/R, a ochrona odbywa się głównie za pośrednictwem szlaku Nrf-2/Keap-1.

Słowa kluczowe: Cistanche deserticola, uszkodzenie mózgu, glikozydy całkowite, polisacharydy, oligosacharydy, szlak Nrf-2/Keap- 1

WPROWADZANIE

Udary są uważane za główną przyczynę zgonów i niepełnosprawności na świecie (Donnan i in., 2008). Prawie 87 procent wszystkich przypadków udarów jest wywoływanych przez udar niedokrwienny (Ovbiagele i Nguyen-Huynh, 2011). Obecnie najskuteczniejszym środkiem i jedynym zatwierdzonym przez FDA lekiem stosowanym w leczeniu udaru niedokrwiennego mózgu jest rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu. Jednak duża liczba pacjentów po udarze nie reaguje na ten lek ze względu na jego wąskie okno czasowe terapeutyczne i poważne ryzyko powikłań krwotocznych (Lee i wsp., 2012; Schellinger i Kohrmann, 2014). Głównym wyzwaniem leczenia trombolitycznego jest uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R), które jest uważane za główną przyczynę uszkodzenia mózgu i destrukcji funkcji. Reperfuzja po niedokrwieniu mózgu zwiększa ryzyko krwotoku mózgowego, prowadząc do uszkodzenia układu nerwowo-naczyniowego i wytwarzania nadmiernych reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają barierę krew-mózg (Alluri et al., 2015). Kilka badań potwierdziło, że zaburzenie BBB jest główną przyczyną patogenezy udaru niedokrwiennego (Cao i wsp., 2016b).

BBB składa się głównie z komórek śródbłonka, perycytów, astrocytów, neuronów i błon podstawnych. Głównymi składnikami BBB są komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, które są połączone ścisłymi połączeniami, ograniczając w ten sposób egzogenne cząsteczki do mózgu. Zmiany patologiczne ścisłych połączeń — zwłaszcza okludyny, klaudyny-5 i zonula okludens-1 (ZO-1) — istotnie wpływają na funkcję BBB podczas udaru niedokrwiennego, zwłaszcza na przepuszczalność bariery (Liu et al. in., 2014; Hu i in., 2018; Liu i in., 2019). W okresach I/R nadmierne ROS jest jednym z głównych czynników prowadzących do bezpośredniego uszkodzenia neuronów mózgu (Ding et al., 2014). Nadprodukcja ROS prowadzi do degradacji niektórych połączeń i przerwania BBB, co powoduje przedostawanie się egzogennych cząsteczek do mózgu przez BBB, co prowadzi do pogorszenia uszkodzenia mózgu (Cheon i in., 2016; Zhang QY i in., 2017). Dlatego też ochrona BBB przez przeciwutleniacze została uznana za potencjalny sposób zapobiegania uszkodzeniom reperfuzyjnym.

Poza rozpadem BBB, I/R może skutkować uszkodzeniem nerwowo-naczyniowym i śmiercią neuronów (Jung et al., 2010). Podczas udaru zwiększona śmierć komórek neuronalnych może wynikać ze stresu oksydacyjnego (Chi i wsp., 2018), a liczne badania wykazały, że ROS nasila ciężkość udaru i uszkodzenia neurologiczne (Kondo i wsp., 1997; Crack i wsp., 2001; Crack i wsp., 2006). Chociaż badania kliniczne nie przyniosły zadowalających wyników, neuroprotekcja jest nadal obiecującą strategią leczenia ostrego udaru niedokrwiennego (Moretti i wsp., 2015). Zatem znalezienie skutecznych leków neuroprotekcyjnych do leczenia udarów jest korzystne dla pacjentów z udarem.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) podejmuje środki, aby interweniować przeciwko wewnętrznej nierównowadze organizmu (Gaire, 2018). Ze względu na złożoną patogenezę udarów niedokrwiennych, wieloczynnikowe działanie TCM i jego aktywnych składników odgrywa kluczową rolę w leczeniu udarów. Cistanche deserticola YC Ma, szeroko rozpowszechniony na suchych lub półpustynnych obszarach Mongolii i północno-zachodnich Chin, jest powszechnie stosowanym ziołem TCM w leczeniu różnych chorób, takich jak zapominanie i depresja, od ponad 1,000 roku w Chinach. . Nowoczesnybadania farmakologiczne wykazały, że surowe ekstrakty zC. deserticolawykazał wiele działań farmakologicznych, takich jak poprawa funkcji uczenia się i pamięci, neuroprotekcja, wzmocnienie odporności, działanie przeciwutleniające, przeciwstarzeniowe i przeciwzmęczeniowe (Ko i Leung, 2007; Wang i wsp., 2012; Li i wsp., 2015). Analiza chemiczna C. deserticola wykazała, że ​​jej głównymi składnikami są glikozydy fenyloetanoidowe, glikozydy irydoidalne, polisacharydy i oligosacharydy (Jiang i Tu, 2009). Jednak aktywne składniki C. deserticola dla ochrony mózgu nie są bardzo jasne.Właściwości neuroprotekcyjne C. deserticola implikują jej potencjał terapeutyczny w chorobach poznawczych, takich jak udar i depresja, a także choroba Alzheimera (Wang i in., 2017). Jednak badania nad wpływemC. deserticolana udary, w tym jego aktywnych składników i mechanizmów działania, jest bardzo ograniczona. W obecnej pracy badaliśmy ochronny wpływ trzech ekstraktów z C. deserticola, całkowitych glikozydów (TG, glikozydy fenyloetanoidowe i inne glikozydy), polisacharydów (PS) i oligosacharydów (OS) na uszkodzenia mózgu I/R. Nasze odkrycia mogą przyczynić się do dokładnego klinicznego zastosowaniaC. deserticolai dostarczyć kandydata na czynnik do terapii udaru niedokrwiennego.

MATERIAŁY I METODY

Chemikalia i odczynniki

Łodygi Cistanche deserticola zostały zakupione z Alashan w Mongolii Wewnętrznej i zidentyfikowane przez jednego z autorów (P.-F. Tu). TG, PS i OS przygotowano zgodnie z naszą wcześniej opisaną metodą (Gao i wsp., 2015). Analizę ilościową TG przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), jak opisano wcześniej (Li et al, 2019), a jej chromatogram przedstawiono na rysunku 1. Głównymi składnikami TG są echinakozyd, tubulozyd A, akteozyd, izo- akteozyd i 2'-acetyloakteozyd; ich zawartość wynosi odpowiednio 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g i 12,045 mg/g. Zawartość PSs i OSs wynosi odpowiednio 69,42 procent i 65,24 procent , co oznaczono odpowiednio metodą HPLC i analizy fenolowo-siarkowej (Zhang A. i wsp., 2018; Shi i wsp., 2019).

Standardowe odniesienia do echinakozydu (A0282), tubulozydu A (A0942), akteozydu (A0280), izo-akteozydu (A0281) i 2'-acetyloakteozydu (A0943) zakupiono z Chengdu Must Biotechnology (Syczuan, Chiny). Czystość wszystkich standardów wynosi ponad 98 procent. Zestawy do barwienia Nissl H&E zostały zakupione w firmie Boster (Wuhan, Chiny). Edaravone (T0407-1) został kupiony od Target Mol (Szanghaj, Chiny). Zakupiono królicze przeciwciało przeciw szczurzym MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) i mysie przeciwciało przeciw szczurzemu CD31 (ab24590) z Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Królicze anty-szczurze Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) i Occludin (BS72035) zakupiono z Bioworld Technology (Nanjing, Chiny). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) była źródłem króliczej przeciw szczurzej synapsynie -1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-aktyny mięśni gładkich (a-SMA, 19245T). GAPDH (HRP-60004) zakupiono od Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Przeciwciała drugorzędowe dostarczyła firma Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pekin, Chiny). Hoechst 33258 otrzymano z Beyotime (Jiangsu, Chiny).

Zwierząt

Szczury Sprague-Dawley (samce, ważące 250-300g) otrzymano z Vital River Laboratory Animal Technology (Pekin, Chiny) i trzymano w klimatyzowanym pomieszczeniu utrzymywanym w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE dotyczącymi badań na zwierzętach (Kilkenny i in., 2010; McGrath i in., 2010) i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Beijing University Health Science Center (LA2019123).

Protokoły eksperymentalne na zwierzętach

Szczury poddano MCAO/R, jak opisano wcześniej (Wang i wsp., 2018). W skrócie, odsłonięto lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA), a z ECA do ICA wprowadzono szew nylonowy 3-0 monofilamentowy aż do tętnica mózgowa (MCA). Po 1,5 godz. okluzji MCA symulowano reperfuzję przez usunięcie włókna. Podczas zabiegu chirurgicznego temperaturę ciała wszystkich szczurów utrzymywano na poziomie 37,0°C.

Administracja Leków

Szczury podzielono losowo na sześć grup przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0 zgodnie z opisem (Jiang i in., 2014): grupa normalna (NOR); grupa modelowa (MOD); grupa edarawonowa (lek dodatni, 6 ml/kg, EDI); grupa TG (280 mg/kg, TG); Grupa PSs (280 mg/kg, PSs) i grupa OSs (280 mg/kg, OS). TG, PS i OS podawano raz dziennie po MCAO/R przez 14 dni. Grupy NOR i MOD były leczone normalną solą fizjologiczną. Liczby zwierząt przedstawiono w Tabeli 1.

Pomiar masy ciała i zmodyfikowanej skali deficytu neurologicznego (mNSS)

Masę ciała monitorowano 14 dnia za pomocą cyfrowej wagi ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, USA). mNSS oceniano zgodnie z metodą opisaną przez FJ Wanga (Wang i in., 2018), z niewielkimi zmianami.

2, 3, 5-barwienie chlorkiem trifenylotetrazoliowym (TTC)

Objętość zawału mierzono jak opisano wcześniej (Wang i in., 2015). W skrócie, mózgi podzielono na siedem równo rozmieszczonych bloków wieńcowych (2 mm). Skrawki te barwiono 2% TTC (Coolaber, Pekin, Chiny) w 37°C przez 15 min. Objętość zawału ( procent )=(objętość ipsilateralnej półkuli niedokrwiennej − objętość przeciwległej półkuli niedokrwiennej)/objętość przeciwległej półkuli niedokrwiennej × 100.

Barwienie Nissla i H&E

Szczury głęboko znieczulono, po czym cały mózg szybko usunięto z czaszki i utrwalono 4% paraformaldehydem, zatopiono w wosku parafinowym i pocięto na plasterki o grubości 7 µm. Skrawki wybarwiono Nissl i H&E. W tym badaniu sześć losowych pól 200 × 200 µm zostało uchwyconych w każdej próbce tkanki za pomocą mikroskopu świetlnego. Liczbę ciał Nissla policzono za pomocą oprogramowania IPP w wersji 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Niebieski test Evansa

Szczurom wstrzyknięto 2% EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) po MCAO/R. Dwie godziny później szczury uśpiono, a następnie cały mózg szybko usunięto i homogenizowano w acetonie. Supernatanty analizowano przy 620 nm za pomocą czytnika absorbancji 800 TS (BioTek, USA).

Pomiar aktywności katalazy (CAT), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), dialdehydu malonowego (MDA) i peroksydazy glutationowej (GSH-Px)

Wszystkie próbki surowicy wirowano przy 4,000 x rpm przez 15 min w 4 stopniach, a następnie analizowano w celu wykrycia aktywności MDA, CAT, SOD i GSH-Px zgodnie z instrukcjami producenta (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Chiny).

Analiza Western blot

Tkanki mózgowe (100 mg) zebrane od każdego szczura homogenizowano i lizowano w buforze do lizy RIPA, a następnie analizowano w celu wykrycia stężenia białka przy użyciu zestawu BCA (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Całkowite białka tkankowe załadowano na 10% żele SDS-PAGE i przeniesiono na błonę nitrocelulozową. Membranę zablokowano przy użyciu 5% odtłuszczonego mleka, a następnie inkubowano przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 4 stopniach. Membranę następnie inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym. Analizę Western blot analizowano przy użyciu Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Chiny).

Analiza immunofluorescencyjna

Przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne dla CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludyny, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 i Keap-1. Pierwotne przeciwciała przeciwko Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludynie, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 i Keap-1 rozcieńczono do Odpowiednio 1:200 i 1:100. Drugorzędowe przeciwciało Alexa Flur 488 mysiego antykróliczego IgG i koziego antykróliczego IgG rodaminy (TRITC) rozcieńczono do 1:200. Jądra wybarwiono Hoechst 33258. Obrazy zarejestrowano przy użyciu automatycznego systemu obrazowania ilościowego patologii Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, USA). Ekspresję białka analizowano przy użyciu oprogramowania IPP w wersji 6.0.

Analiza statystyczna

Wszystkie dane zostały opisane jako średnia ± SD. Do analizy statystycznej wykonano oprogramowanie SPSS w wersji 22.0. Do porównywania różnych grup zastosowano jednokierunkową analizę ANOVA. Za różnicę statystyczną uznano P <>

WYNIKI

TG zwiększają masę ciała i zmniejszają uszkodzenia mózgu u szczurów MCAO/R

Po 14 dniach leczenia TG, PSs, Oss i EDI oceniano masy ciała, deficyty neurologiczne i objętość zawału u szczurów I/R. Wyniki pokazały, że masa ciała w grupie MOD uległa znacznemu zmniejszeniu, podczas gdy zmniejszona masa w grupach TG, PS i EDI wzrosła (ryc. 2A). Wyniki deficytów neurologicznych zostały znacznie obniżone przez EDI i TG (ryc. 2B). Skrawki mózgu szczurów z grupy NOR były ciemnoczerwone i nie było zawałów, podczas gdy szczury z grupy MOD wykazywały duży ipsilateralny zawał mózgu. Po leczeniu TG, objętości zawału uległy znacznemu zmniejszeniu (Figury 2C, D). Leczenie PSs i OSs nie wykazało wyraźnego wpływu na powyższe wskaźniki. Powyższe dane wykazały, że TG mogą znacznie złagodzić uraz mózgu wywołany przez I/R, ale PS i OS nie były w stanie.

TG łagodzą uszkodzenia histopatologiczne u szczurów MCAO/R

Aby określić niektóre skutki leczenia TG, PS i OS na uszkodzenia histopatologiczne, wykonano barwienie H&E w celu wykrycia uszkodzeń patologicznych. Struktury histomorfologiczne mózgów w grupie NOR układały się regularnie. Zmiany morfologiczne w grupach TG były mniejsze niż w grupie MOD. Jednak grupy leczone PS i OS nie wykazały znaczącej poprawy zmian morfologicznych (ryc. 3).

TG łagodzą uszkodzenie neuronów u szczurów indukowanych przez I/R

Barwienie Nissla wykazało zmiany histopatologiczne neuronów w półcieniu obszaru niedokrwienia. Jak pokazano na rycinie 4, normalne neurony miały wyraźne jąderko i nienaruszoną strukturę. W grupie MOD neurony miały powiększone przestrzenie międzykomórkowe. Ciała nissla zniknęły, skurczyły się i były głęboko poplamione. Zmiany te były jednak rzadko obserwowane w grupach EDI, TG i PSs. Wyniki te pokazują, że TG i PS mogą znacząco osłabiać uszkodzenie neuronów wywołane niedokrwieniem/reperfuzją.

TG łagodzą zakłócenia BBB po leczeniu szczurów I/R

Test Evans blue to klasyczna metoda badania zmiany przepuszczalności BBB. Wyniki eksperymentu wykazały, że w grupie MOD zaobserwowano zwiększony błękit Evansa, podczas gdy u szczurów leczonych TG i EDI zaobserwowano znacznie obniżony błękit Evansa. Co więcej, nie było istotnej różnicy między grupami terapeutycznymi PS i OS (ryc. 5). Wyniki te sugerowały, że TG mogą znacząco złagodzić zakłócenia BBB.

TG promują angiogenezę u szczurów po urazie I/R

Nowsze badania pokazują, że angiogeneza odgrywa kluczową rolę w regeneracji funkcji neurologicznej i rokowaniu po ostrym udarze niedokrwiennym (Yuen i wsp., 2015). Aby ocenić wpływ TG, PS i OS na angiogenezę, zastosowano CD31 i a-SMA do ilościowego określenia liczby naczyń włosowatych. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że grupa MOD spowodowała znaczny spadek ekspresji CD31 (Figury 6A, B) i a-SMA (Figury 6C, D) w półcieniu obszarów niedokrwionych szczurów I/R w porównaniu z normalnymi szczurami . Wynik ten ilustruje, że I/R może powodować uszkodzenie naczyń w półcieniu kory niedokrwiennej półkul. Jednak leczenie TG i EDI znacznie zwiększyło gęstość naczyń włosowatych, angiogenezę i arteriogenezę, na co wskazuje zwiększona ekspresja CD31 i a-SMA. Wyniki te sugerują, że TG mogą promować angiogenezę w niedokrwiennym półcieniu szczurów I/R, ale PS i OS nie.

TG zwiększają ekspresję białek o ścisłym połączeniu u szczurów po urazie I/R

Zakłócenie BBB może podnieść zawartość wody w mózgu i obrzęk tkanek, prowadząc do uszkodzenia mózgu. Białka ścisłego połączenia są ważnymi składnikami strukturalnymi BBB (Tenreiro i wsp., 2016; Jiang i wsp., 2018). Aby sprawdzić, czy leczenie TG, PS i OS po udarze mózgu może wpływać na integralność BBB, przeprowadzono analizę immunofluorescencyjną ekspresji ZO-1, klaudyny-5 i okludyny. Wyniki wskazują, że ekspresja klaudyny-5, okludyny i ZO-1 była wyraźnie obniżona w grupie MOD. Jednak były one znacznie zwiększone po 14 dniach podawania TG. Grupy PSs i OSs nie wykazały znaczących zmian w ekspresji tych białek (Figura 7). Dane te wskazują, że TG mogą regulować ekspresję białek ścisłych połączeń i prawdopodobnie utrzymywać integralność BBB po uszkodzeniu I/R. TG zwiększają pokrycie przez perycyty naczyń włosowatych u szczurów po urazach I/R Pokrycie perycytami na naczyniach włosowatych odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności BBB (Armulik i in., 2010; Daneman i in., 2010). W związku z tym zbadaliśmy, czy pokrycie perycytami można zwiększyć przez leczenie TG, PS i OS. Wyniki analizy intensywności immunofluorescencji wykazały, że zarówno ekspresja PDGFRb, jak i CD31 była dramatycznie obniżona w grupie MOD. Podawanie TG szczurom I/R znacząco wyzdrowiało lub nawet zwiększyło intensywność ekspresji PDGFRb i CD31, ale nie zaobserwowano różnicy w grupach leczonych PSs i OSs (Figura 8). Zatem leczenie TG może znacznie zwiększyć pokrycie perycytów. Odkrycia te potwierdziły ponadto, że TG mogą zachować integralność BBB po I/R.

TG promują przebudowę neuronalną u szczurów po urazie I/R

Według licznych badań neurogeneza po udarze może znacznie poprawić powrót do funkcji funkcjonalnych (Grefkes i Ward, 2014; Zhang i in., 2019). Synaptofizynę (SYN), białka postsynaptycznej gęstości 95 (PSD-95) i białko 2 związane z mikrotubulami (MAP-2) zastosowano jako markery do badania plastyczności neuronalnej w niedokrwiennym półcieniu kory. Aby ocenić wpływ leczenia TG, PS i OS na neurogenezę u szczurów po urazie I/R, przeprowadzono immunofluorescencję i analizę western blot dla ekspresji SYN, PSD95 i MAP-2. Jak pokazano na Figurach 9 i 10, poziomy ekspresji SYN, PSD95 i MAP-2 u szczurów I/R po 14 dniach reperfuzji zmniejszyły się w porównaniu ze szczurami NOR, podczas gdy wyleczenie TG i PS mogło znacznie regulują ich poziomy ekspresji. Grupa OS nie wykazała istotnych zmian w porównaniu z grupą MOD. Dane wskazywały, że wyleczenie TG i PS było w stanie radykalnie promować przebudowę neuronalną po uszkodzeniu I/R.

TG Zmień ekspresję Nrf-2 i zachowaj-1 u szczurów z urazem I/R

Stres oksydacyjny jest głównym mechanizmem patogenicznym w urazach I/R (Ya i wsp., 2018; Yu i wsp., 2018). Badania potwierdziły, że Nrf-2 jest głównym regulatorem odpowiedzi antyoksydacyjnych (Thompson et al., 2015). Aby zbadać reakcje oksydacyjne, w których pośredniczą Nrf-2 i Keap-1 po uszkodzeniu I/R, oceniliśmy ekspresję cytoplazmatyczną oraz translokację jądrową Keap-1. W międzyczasie zbadano również ekspresję Nrf-2 w tkankach mózgu szczura po urazie I/R (Figury 10 i 11). Na podstawie analizy immunofluorescencji stwierdzono, że Nrf-2 jest zlokalizowany głównie w cytoplazmie w grupie NOR. W grupie TG ekspresja Nrf-2 w lokalizacji cytoplazmatycznej była obniżona, ale podwyższona w jądrze; zaobserwowano również obniżoną ekspresję Keap-1. Dane wykazały, że ochrona mózgu TG może być powiązana z modulacją Nrf-2 i Keap-1

TG łagodzą stres oksydacyjny tkanki mózgowej u szczurów po urazie I/R

Aby potwierdzić działanie antyoksydacyjne TG, oceniano aktywność SOD, CAT, GSH-Px i MDA u szczurów po urazach I/R. Na Rycinie 12 zawartość MDA była znacznie zwiększona w grupie MOD, a jednocześnie aktywność SOD, CAT i GSH-Px była zmniejszona w porównaniu z normalnymi szczurami. Odwrotnie, leczenie TG doprowadziło do znacznego zmniejszenia zawartości MDA i zwiększenia aktywności SOD, CAT i GSH-Px. Wyniki te dodatkowo potwierdziły aktywność przeciwutleniającą TG.

DYSKUSJA

Wiele badań sugeruje, że TCMC. deserticolama rozległą aktywność biologiczną, np. poprawia zdolność uczenia się, pamięć i odporność (Dong i in., 2007; Jiang i Tu, 2009; Wang i in., 2017; Xia i in., 2018). Jednak aktywne składniki C. deserticola dla neuroprotekcji pozostają niejasne. Obecne prace mają na celu przesiewanie aktywnych komponentów zC. deserticolaudaru niedokrwiennego w modelu MCAO/R. Trzy ekstrakty z C. deserticola (TG, PS i OS) zastosowano do oceny ich wpływu na szczury MCAO/R, a także możliwych mechanizmów.

Udar jest powszechną ostrą chorobą naczyń mózgowych. Badania epidemiologiczne pokazują, że udar mózgu występuje częściej u mężczyzn niż u kobiet (Sealy-Jefferson i in., 2012; Guzik i Bushnell, 2017). Tak więc w naszym eksperymencie do testów przyjęto samce szczurów. Nasze wyniki dowiodły, że indukcja I/R przyspieszyła stres oksydacyjny i objętość zawału, przerywając BBB i prowadząc do uszkodzenia nerwów i naczyń mózgowych. Po badaniu przesiewowym stwierdzono, że TG zmniejszają objętość zawału i sprzyjają przebudowie neuronalnej i angiogenezie. Ponadto zaobserwowano, że TG utrzymują integralność BBB po urazie I/R. Wręcz przeciwnie, PS i OS nie przynoszą znaczącego złagodzenia urazu I/R. Tak więc TG są uważane za główną aktywną frakcjęC. deserticolado neuroprotekcji, potencjalnie poprzez promowanie przebudowy neuronów, angiogenezy i integralności BBB poprzez aktywację szlaku Nrf- 2/Keap-1.

Coraz więcej dowodów wskazuje, że ustanowienie skutecznego krążenia obocznego jest istotne dla uniknięcia powstania zawału i półcienia niedokrwiennego i jest krytycznym leczeniem we wczesnym stadium udaru niedokrwiennego (ElAli, 2016; Iwasawa i wsp., 2016). Proliferacja komórek śródbłonka naczyń i komórek mięśni gładkich po zawale niedokrwiennym warunkuje ustanowienie krążenia obocznego. Jednak modele niedokrwienia mają wspólne zjawisko – stres oksydacyjny powszechnie występujący w mikronaczyniu mózgu. Dane z badań wykazały, że duża ilość antyoksydantów może zaburzać funkcję BBB i właściwości angiogenezy (Mentor i Fisher, 2017). CD31 i a-SMA są markerami odpowiednio komórek śródbłonka naczyniowego oraz komórek mięśni gładkich (Saboor et al., 2016). Aby zbadać wpływ ekstraktów z:C. deserticola, zbadaliśmy ekspresję CD31 i a-SMA w homogenacie półcienia z niedokrwieniem mózgu. Nasze dane wykazały, że TG uderzająco wzmocniły ekspresję CD31 i a-SMA. Jednak nie było istotnych różnic w grupach PS i OS. Dlatego wywnioskowaliśmy, że TG mogą zmniejszać uszkodzenie mózgu poprzez promowanie angiogenezy poprzez zwiększenie ekspresji CD31 i a-SMA, podczas gdy PS i OS nie zapewniają takiej ochrony przed uszkodzeniem mózgu. Wyniki te dodatkowo potwierdziły, że tylko TG mogą zapobiegać uszkodzeniom mózgu I/R.

Udar niedokrwienny można uważać za wynik niedokrwienia mózgu spowodowanego upośledzeniem plastyczności neuronalnej lub przebudową obszarów mózgu. Większość pacjentów po udarze ma deficyty neurologiczne. Aktywacja neurogenezy jest obiecującą strategią dla pacjentów po udarze w celu poprawy ich funkcji neurologicznych (Cramer i Chopp, 2000). Neurogeneza bezpośrednio uczestniczy w przywracaniu funkcji neurologicznych po uszkodzeniu mózgu I/R (Zhang i wsp., 2019). Wcześniejsze badania pokazują, że TG mogą poprawić przeżywalność komórek piramidowych hipokampa i indukować neurogenezę (Lian i wsp., 2017). Stres oksydacyjny powoduje utratę neuronów podczas wielu chorób, takich jak choroba Parkinsona, udar itp. (Duan i Si, 2019; Singh i in., 2019). Nrf-2 dokonuje transkrypcji wielu genów związanych z neuroprotekcją w ich regionie promotorowym, w tym głównie ligazy SOD, MDA, CAT i g glutamylocysteiny itp. (Satoh et al., 2006). Białka SYN, PSD-95 i MAP-2, które są ściśle związane z tworzeniem synaps i neuroprzekaźnictwem, można uznać za markery plastyczności neuronalnej w badaniach niedokrwiennego półcienia. Po badaniu odkryliśmy, że wyleczenie TG może znacznie zwiększyć ekspresję PSD95, SYN i MAP-2, co wskazuje, że mózgowa ochrona TG była skorelowana ze zwiększoną plastycznością neuronalną podczas I/R. Szkoda jednak, że nie ma oczywistej różnicy dla grup PS i OS. Wyniki te wskazują, że TG mogą zwiększać neuroplastyczność po urazie I/R mózgu.Badania obrazowe pacjentów po udarze wykazały, że dysfunkcję BBB można uważać za uderzającą cechę mózgu w stanie niedokrwienia (Bang i wsp., 2007). TJ, które składają się z białek cytoplazmatycznych, białek transbłonowych i cząsteczek adhezyjnych połączeń między komórkami śródbłonka naczyń włosowatych, są bardzo ważne w utrzymaniu integralności BBB (Ye i wsp., 2019). Wśród nich ZO-1, klaudyna-5 i okludyna są najważniejszymi białkami w TJ. Coraz więcej dowodów wskazuje, że zwiększona przepuszczalność BBB wywołana niedokrwieniem ogólnie koreluje ze zmianami ZO-1, klaudyny-5 i okludyny (Cao i wsp., 2016a; Page i wsp., 2016; Yu i in., 2017; Liu i in., 2018). W tej pracy wyniki wykazały, że chociaż TG mogą znacząco zwiększyć ekspresję ZO-1, klaudyny-5 i białek okludyny w tkankach mózgu indukowanych MCAO, ani PS, ani OS nie. BBB składa się z komórek śródbłonka mózgu i jest ściśle związany z perycytami (Nyul-Toth i wsp., 2016). Pericyty są niezbędne dla integralności BBB (Bell i wsp., 2010). Udar niedokrwienny powoduje śmierć perycytów i ich oderwanie od komórek śródbłonka mózgu w ostrej fazie, destabilizując w ten sposób mikrokrążenie i zmieniając właściwości BBB (Zechariah i wsp., 2013). Nasze dane wykazały, że TG mogą zwiększać pokrycie perycytów na naczyniach włosowatych i zwiększać poziomy ekspresji ZO-1, klaudyny-5 i okludyny. Zjawiska te dowiodły, że TG mogą skutecznie chronić integralność BBB po urazie I/R mózgu. Podsumowując, TG mogą łagodzić uszkodzenia mózgu na wiele sposobów, takich jak promowanie angiogenezy, poprawa plastyczności neuronalnej i utrzymywanie integralności BBB.

Następnie zbadaliśmy ścieżkę sygnałową, aby zbadać mechanizm leżący u podstaw ochrony mózgu TG. Proces uszkodzenia I/R jest wieloczynnikowy, stąd w patogenezie zaangażowanych jest wiele mechanizmów. Stres oksydacyjny jest podstawowym czynnikiem ryzyka uszkodzenia mózgu wywołanego przez I/R (Suda i wsp., 2013), takich jak uszkodzenie struktury BBB, dysfunkcja śródbłonka naczyniowego i zaostrzenie niedokrwiennego uszkodzenia neuronów (Xiong i wsp., 2015; Caglayan i in., 2019; Priestley i in., 2019). Tak więc stres oksydacyjny stał się atrakcyjnym celem terapeutycznym w uszkodzeniu mózgu wywołanym przez I/R. Enzymy fazy 2, w których pośredniczy czynnik jądrowy E2-związany z czynnikiem -2 (Nrf-2), zostały uznane za ważny środek, za pomocą którego neurony chronią się przed stresem oksydacyjnym (Suzuki i Yamamoto, 2015; Ya i in., 2018). Coraz więcej dowodów wskazuje, że aktywacja Nrf-2 podczas I/R jest potencjalnym celem terapeutycznym neuroprotekcji (Ding i wsp., 2015; Zhang R. i wsp., 2017). Nrf-2, jako ważny regulator endogennej obrony antyoksydacyjnej, pośredniczy w poziomie oksydoreduktazy hemowej 1 (HO-1) i innych enzymów antyoksydacyjnych, takich jak oksydoreduktaza chinonowa NAD(P)H 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH i MDA (Siow i in., 2007; Ding i in., 2014). Co więcej, Nrf-2 odgrywa ważną rolę regulatorową w angiogenezie. Niniejsze badanie pokazuje, że Nrf-2 może być znacząco wzmocniony i aktywowany w procesie rozwoju naczyń (Wei i wsp., 2013).

Jak wcześniej opisano (Jiang i Tu, 2009), TG zawierają wiele związków bioaktywnych, na przykład echinakozyd, tubulozyd A, akteozyd, izo-akteozyd i 2'-acetyloakteozyd, a niektóre z nich wykazywały funkcje neuroprotekcyjne po mózgowym I/R uraz (Peng i in., 2016). Echinakozyd ma wiele efektów farmakologicznych, takich jak przeciwutlenianie, przeciwdziałanie starzeniu się, neuroprotekcja, działanie przeciwzapalne, promowanie bliznowacenia, hepatoprotekcja, promowanie tworzenia kości i działanie przeciwnowotworowe (Yu i wsp., 2016; Li i wsp., 2018; Zhang Y. i wsp., 2018; Ji i wsp., 2019; Xu i wsp., 2019). Ostatnio echinakozyd został zidentyfikowany jako silny przeciwutleniacz w ośrodkowym układzie nerwowym (Lu et al., 2016). Echinakozyd może zmniejszyć zawartość MDA i poprawić aktywność SOD i GSH Px w niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu, a analiza dokowania molekularnego wykazała, że ​​echinakozyd może wiązać się z Keap-1, prowadząc do translokacji jądrowej Nrf-2 (Li i in., 2018). Badanie Xia wykazało, że akteozyd może zmniejszyć objętość zawału i zawartość wody w mózgu, aby poprawić deficyty neurologiczne u szczurów MCAO/R poprzez łagodzenie stresu oksydacyjnego (Xia i wsp., 2018). Inne badania wykazały, że izoakteozyd może zwiększać aktywność komórkowych enzymów antyoksydacyjnych, SOD i CAT w komórkach V79-4 poddanych działaniu H2O2-(Chae et al., 2005). Na podstawie powyższych doniesień o związkach czynnych zawartych w TG można wywnioskować, że TG mogą chronić przed udarem niedokrwiennym poprzez szlaki antyoksydacyjne.

Li poinformował o neuroprotekcyjnym działaniu glikozydów fenyloetanoidowych (PhG) na apoptozę indukowaną przez H2O2- w komórkach PC12 za pośrednictwem szlaku Nrf2/ARE (Li i wsp., 2018). Te PhG zostały znacząco stłumione przez wyzwolenie translokacji jądrowej Nrf2 i zwiększenie ekspresji HO-1, NQO1, podjednostki katalitycznej ligazy glutaminianowo-cysteinowej (GCLC) i podjednostki modyfikatora ligazy glutaminianowo-cysteinowej (GCLM) (Li i wsp., 2018 Gong i in., 2019). Dlatego odkrycia te sugerują, że szlak Nrf-2/ARE odgrywa kluczową rolę w działaniu ochronnym, w którym pośredniczą PhGs na komórki neuronalne. Podobnie w tym badaniu stwierdziliśmy, że TG mogą obniżać poziom MDA i zwiększać poziomy SOD, CAT i GSH-Px u szczurów I/R. Tymczasem TG mogą zwiększać ekspresję Nrf2 w jądrze, zmniejszać odpowiednią ekspresję w cytoplazmie i znacznie zmniejszać ekspresję Keap-1. W związku z tym szlak Nrf-2/Keap-1 może brać udział w neuroprotekcyjnych efektach, w których pośredniczą TG. Dalszą walidację tego szlaku można by w przyszłości przeprowadzić w hodowli komórkowej in vitro z modelami pozbawienia tlenu i glukozy/reoksygenacji uszkodzeń. Ponadto,C. deserticolaekstrakty podawano w naszym badaniu nieprzerwanie przez 14 dni. Ponieważ neurogeneza dorosłych wpłynęłaby na interpretację efektów neuroprotekcyjnych podczas 14 dni reperfuzji, nie można wykluczyć neurogenezy w naszym obecnym projekcie eksperymentu badającego neuroprotekcyjne działanie CT. To jest ograniczenie naszych badań.

Podsumowując, to TG zC. deserticolaktóre mogą wzmacniać angiogenezę i neurogenezę, a także utrzymywać integralność BBB u szczurów z urazem I/R, ale nie PS i OS. W skutkach może pośredniczyć aktywacja szlaku Nrf-2/Keap-1.