Ocena toksykologiczna i działanie ochronne etanolowego ekstraktu z liści Cassia spectabilis DC na czynność wątroby i nerek myszy zakażonych Plasmodium Berghei
Oct 30, 2023
1. Wstęp
Do dziś problemPlazmodiumoporność pasożytów na istniejące leki przeciwmalaryczne nadal stanowi główny problem w zwalczaniu malarii [1–3]. dlatego też nadal prowadzone są badania nad odkryciem nowych źródeł leków przeciwmalarycznych, z których jednym jest roślina lecznicza [4].Na żywoIin vitromodele te są od dawna stosowane w testach przeciwmalarycznych. W drugiej połowie XX w.Plasmodium bergheiLubPlasmodium yoeliibył używany do zakażania gryzoni. Tymczasem,P.bergheistał się najczęściej używanym gatunkiem do badań na etapie wątroby, zwłaszcza tworzenia hipnozoitu w celu zbadania nawrotu malarii [5–7].
KLIKNIJ TUTAJ, ABY POBRAĆ ZIOŁOWĄ FORMUŁĘ CISTANCHE NA NERKI
Jedna z tradycyjnych roślin w Indonezji, Cassia spectabilis DC z rodziny Caesalpiniaceae, została udowodniona eksperymentalnie in vitro przeciwko P. falciparum oraz w leczeniu malarii in vivo przeciwko P. berghei [8, 9], co wskazuje, że roślina C. spectabilis DC jest ma duży potencjał do dalszego rozwoju jako kandydat na leki przeciwmalaryczne. Poprzednie prace donosiły, że test in vivo na 90% etanolowym ekstrakcie z liści C. spectabilis DC przeciwko P. berghei ANKA u myszy BALB/c wykazał, że wartość ED50 wyniosła 131,5 mg/kg masy ciała [9] i jest klasyfikowana jako bardzo dobre działanie przeciwmalaryczne [10].
Ponadto ekstrakt, frakcje, podfrakcje i wyizolowane związki C. spectabilis DC badano in vitro pod kątem ich działania przeciwmalarycznego. *Aktywny związek tej rośliny został pomyślnie zidentyfikowany jako związek identyczny z (–){{0}}hydroksykazyną, a jego test aktywności przeciwmalarycznej in vitro wykazał bardzo niski IC50 wynoszący 0,016 ug/ml [ 11], który zaliczany jest do leków o bardzo silnym działaniu przeciwmalarycznym [12].
Kontynuowano badania nad tą rośliną pod kątem przezwyciężania lekooporności malarii, sprawdzając bezpieczeństwo i wpływ ulepszonego ekstraktu z liści C. spectabilis DC na funkcje wątroby i nerek u myszy zakażonych P. berghei ANKA. Szeroko prowadzone są badania nad wpływem roślin leczniczych o działaniu przeciwmalarycznym na czynność wątroby i nerek myszy zakażonych pasożytami [13–16], a także badania toksyczności ostrej i podostrej [17–20]. Wątroba odgrywa ważną rolę w regulacji procesów fizjologicznych. jest narządem biorącym udział w kilku ważnych funkcjach, takich jak metabolizm, wydzielanie i magazynowanie. Ponadto wątroba odgrywa ważną rolę w detoksykacji i wydalaniu związków endogennych i egzogennych [21–24].
Zakażenie malarią rozpoczyna się w momencie zarażenia sporozoitów przez ukąszenie komara Anopheles zakażonego pasożytem malarii. Podczas karmienia krwią zakażona samica Anopheles wstrzykuje pasożytowi stadium sporozoitowe [25, 26]. Po około godzinie podróżowania po organizmie człowieka sporozoity przedostają się do wątroby, atakują hepatocyty i rozpoczynają bezpłciowy cykl schizogonii egzoerytrocytarnej. Wewnątrz komórek wątroby pasożyty rozmnażają się bezpłciowo, aż do osiągnięcia dojrzałego schizontu, a na koniec powstaje duża liczba merozoitów, które przedostają się do krwioobiegu po zakażeniu, pęknięciu hepatocytów. *Zakażone hepatocyty powodujące uszkodzenie wątroby w wyniku pęknięcia zakażonych hepatocytów i merozoitów dostają się do krwioobiegu i rozpoczynają cykl erytrocytarny w czerwonych krwinkach [27, 28]. Uszkodzenia zachodzące w komórkach wątroby mogą zwiększać aktywność enzymów wpływających na czynność wątroby, zwłaszcza enzymu transaminazy, i powodować zmiany morfologiczne w wyglądzie wątroby [29, 30], takie jak powiększenie wątroby. Hepatosplenomegalia jest częstą cechą zakażenia malarią u ludzi [31] i myszy [32], spowodowaną przewlekłą ekspozycją na pasożyty malarii. Jednak nie ma powiększenia nerek w zakażeniu malarią.
Dysfunkcję wątroby można wykryć poprzez transaminację w komórkach wątroby osoczowej transaminazy glutaminianowo-szczawiooctowej (SGOT) i osoczowej transaminazy glutaminianowo-pirogronowej (SGPT) uwalnianych w osoczu lub poprzez badanie histologiczne tkanki [33]. Najczęstszym uszkodzeniem jest aktywacja apoptotycznej śmierci komórek lub martwicy hepatocytów [34–36]. Klinicznie istotne zajęcie nerek jest związane z zakażeniem P. falciparum i P. malariae. *Zakażenie P. falciparum powoduje ostre objawy, od bezobjawowych po zaburzenia układu moczowego i łagodne zaburzenia elektrolitowe w przypadku ostrej niewydolności nerek (ARF) lub ostrego uszkodzenia nerek (AKI), które wymagają dializy [27, 37]. *Wiadomo, że przypadki AKI będącego powikłaniem malarii przyczyniają się do wysokiej śmiertelności, która wynosi około 75% przypadków. *Badanie histologiczne sugeruje obecność kłębuszkowego zapalenia nerek, ostrej martwicy kanalików nerkowych i śródmiąższowego zapalenia nerek jako kluczowych czynników hemodynamicznych w AKI związanej z malarią [38]. Generalnie stopień dysfunkcji nerek można rozpoznać po obecności odpowiedniej ilości białka w moczu oraz zwiększeniu stężenia mocznika, kreatyniny i elektrolitów w osoczu [39].
*Toksyczność 90% etanolowego ekstraktu z liści C. spectabilis DC (EECS) u myszy BALB/c, po wykonaniu badań enzymatycznych, może wpływać na histopatologię oraz funkcje wątroby i nerek po podaniu EECS.
2. Materiały i metody
2.1. Materiał roślinny i przygotowanie EECS. *e C. spectabilis
Liście DC zakupiono i oznaczono w LIPI (Indonesia Research Centre), Ogród Botaniczny, Purwodadi, East Java, Indonezja (B-160/IPH.06/KS.02/III/2019). *Okaz zdeponowano jako zielnik w Katedrze Farmakognozji i Fitochemii Wydziału Farmaceutycznego Universitas Airlangga. *Liście dokładnie przepłukano wodą wodociągową w celu usunięcia obcych zanieczyszczeń, wysuszono w temperaturze 45 stopni i zmielono na proszek za pomocą młynka. *Ekstrakcję przeprowadzono poprzez macerację sproszkowanych materiałów roślinnych (500 g) w kolbie zawierającej 2500 ml 90% etanolu (w temperaturze 25–30 stopni) przez 3 × 24 godziny. *Rozpuszczalnik ekstrakcyjny oddzielono, przesączono przez bibułę filtracyjną i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej. * Wydajność ekstraktu etanolowego z 1000 g suchej masy proszku z liści C. spectabilis DC wynosiła 10,20% (w/w) i została zastosowana w tym doświadczeniu.
2.2. Zwierząt.
W badaniu wykorzystano samce myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni, o masie ciała 25–30 g. Wszystkie myszy otrzymano z Centrum Weterynaryjnego Farma, Dyrekcji Generalnej ds. Hodowli Hodowli i Zdrowia Zwierząt, Ministerstwa Rolnictwa, Surabaya, Jawa Wschodnia, Indonezja. *Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach i karmiono dietą inwentarską i wodą ad libitum. *Zgodę na protokół badania uzyskano od Komisji Etyki ds. Badań nad Zwierzętami, Universitas Air langga, Indonezja, nr 2.KE.181.10.2018.
2.3. Test toksyczności ostrej.
EECS zważono i ponownie zawieszono w 0,5% karboksymetylocelulozie sodowej (Na CMC) w celu uzyskania pożądanych dawek. Myszy BALB/c głodzono przez 24 godziny przed karmieniem ekstraktem. *Zwierzęta podzielono na trzy grupy, każda grupa zawierała pięć myszy. *dawki dla każdej grupy wynosiły 1250; 2500; i 5,000 mg/kg masy ciała, odpowiednio. Ogólne zachowanie każdej myszy obserwowano w sposób ciągły przez godzinę po każdej dawce, sporadycznie co cztery godziny, a następnie przez okres 24 godzin [40–42].
2.4. Test toksyczności podostrej.
W teście toksyczności podostrej myszy podzielono na trzy grupy i każdej grupie podawano EECS jednorazowo, pięciokrotnie i dziesięciokrotnie w dawce doustnej wynoszącej 150 mg/kg masy ciała dziennie przez 28 dni; normalna grupa kontrolna otrzymywała wyłącznie jedzenie i napoje ad libitum [43]. *Zwierzęta obserwowano przez 28 dni pod kątem jakichkolwiek oznak toksyczności. Pod koniec okresu obserwacyjnego wszystkie zwierzęta uśmiercono w znieczuleniu eterowym i od wszystkich zwierząt pobrano ważne narządy, takie jak wątroba i nerki, w celu przeprowadzenia badań ogólnych i histopatologicznych.
2.5. Pasożyt gryzoni.
Czułość Plasmodium berghei ANKA na chlorochinę uzyskano w Instytucie Biomolekularnym Eijkman w Dżakarcie w Indonezji i utrzymywano ją poprzez seryjne pasażowanie zastosowane w tym badaniu.
2.6. Wpływ EECS na poziom SGOT i SGPT w osoczu.
*eksperyment ten był testem tłumiącym opartym na Petersie [44]. *czy test supresyjny został wykonany przed oceną EECS na poziomie SGOT i SGPT w osoczu. *Zwierzęta zakażono P. berghei ANKA i podzielono na pięć grup A, B, C, D i E. *Zwierzęta leczono wkrótce po zakażeniu w dniu 0 (D0) i kontynuowano codziennie przez trzy dni (D1–D3). Grupa A jako kontrola negatywna otrzymała doustnie 0,5% Na CMC. Grupom B i C jako grupom leczonym podano EECS w pojedynczej dawce doustnej odpowiednio 150 i 200 mg/kg masy ciała. Grupa D stanowiła kontrolę pozytywną, której podawano chlorochinę w pojedynczej doustnej dawce 100 mg/kg masy ciała. Ponadto grupa E, jako zdrowa kontrola, nie była zakażona pasożytami i otrzymywała jedynie jedzenie i napoje do woli. Czwartego dnia (D4) przygotowano rozmazy krwi każdej myszy i zbadano je pod mikroskopem. Ponadto osocze zebrano przed pomiarem poziomów SGOT i SGPT.
2.7. Wpływ EECS na histopatologię wątroby i nerek.
Pod koniec okresu obserwacyjnego wszystkie zwierzęta uśmiercono w znieczuleniu eterowym przed usunięciem wątroby i nerek. Po zważeniu narządów tkanki utrwalono w 10% roztworze formaldehydu i poddano dalszej obróbce w celu barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E). *Przeprowadzono obserwację histopatologiczną w celu sprawdzenia toksykologicznego wpływu EECS na komórki zwyrodnieniowe i martwicze tkanek. *Szkody zostały ocenione na podstawie Gibson-Corley i in. [45].
2.8. Analiza statystyczna.
*dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Do porównania danych o rozkładzie normalnym pomiędzy grupami leczenia zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie, gdy uzyskano inną istotność, przeprowadzono test wielokrotnych porównań post hoc. Gdy dane nie były rozłożone normalnie, do oceny różnic między sposobami leczenia zastosowano testy Kruskala – Wallisa i U Manna – Whitneya.
Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kup więcej szczegółów specyfikacji:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
