Wzmacnianie odgórnej proteomiki tkanki mózgowej za pomocą FAIMS, część 2

Analiza danych

Identyfikację proteoform przeprowadzono za pomocą TopPIC w wersji 1.3.53. Ustawienia dla TopPIC obejmowały okno prekursora 3 m/z (w celu uwzględnienia obwiedni izotopowej), tolerancję błędu masy 15 ppm, nieznane przesunięcie masy max/min 500 Da i maksimum liczba dozwolonych nieznanych modyfikacji 1.

W ostatnich latach coraz więcej badań pokazuje, że istnieje ścisły związek pomiędzy morfologią białek a pamięcią. Białka są najbardziej podstawowymi cząsteczkami w czynnościach życiowych. Mogą kontrolować aktywność życiową komórek i utrzymywać normalne funkcjonowanie organizmu ludzkiego. Badania wykazały, że morfologia białek nie tylko odgrywa ważną rolę w czynnościach życiowych komórek, ale ma także nierozerwalny związek z funkcją pamięci w mózgu. Gdy zmieni się morfologia białek, będzie to miało wpływ na połączenia między neuronami, wpływając w ten sposób na zdolność człowieka do zapamiętywania.

Na wczesnych etapach życia zmiany w morfologii białek odgrywają istotną rolę w rozwoju i funkcjonowaniu mózgu. Jeśli morfologia białek nie jest taka, jak powinna, spowoduje to szereg problemów neurologicznych, ostatecznie prowadzących do utraty pamięci, upośledzenia funkcji poznawczych i tak dalej.

Jednakże nie ma powodu się martwić. Nowoczesna technologia medyczna umożliwiła ludziom dostosowanie morfologii białek poprzez dietę w celu poprawy pamięci. Bogata i zróżnicowana dieta jest bogata w białko, jednak wybierając białko, staraj się wybierać produkty o niskiej zawartości tłuszczu, cholesterolu i węglowodanów, aby uniknąć negatywnych skutków jego nadmiernego spożycia dla organizmu.

Krótko mówiąc, morfologia białek i pamięć są nierozłączne. Aby zachować dobry stan zdrowia i jednocześnie zachować dobrą pamięć, powinniśmy zwracać uwagę na zdrową dietę i zbilansowane spożycie białka. Można zauważyć, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwstarzeniowe, co może pomóc w zmniejszeniu utleniania i reakcji zapalnych w mózgu, chroniąc w ten sposób zdrowie organizmu. układ nerwowy. Ponadto Cistanche może również promować wzrost i naprawę komórek nerwowych, poprawiając w ten sposób łączność i funkcjonowanie sieci neuronowych. Efekty te mogą pomóc poprawić pamięć, zdolność uczenia się i szybkość myślenia, a także mogą zapobiegać występowaniu dysfunkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.

increase brain power

Kliknij Wiedz, aby poprawić pamięć krótkotrwałą

Widma MS2 przeszukiwano w bazie danych połączonej z wpisami Homo sapiens Swiss-Prot (20 352), wariantami splicingowymi Swiss-Prot (22,000) i TrEMBL (54 436), a także typowymi zanieczyszczeniami. Zidentyfikowane proteoformy przefiltrowano do współczynnika fałszywych odkryć (FDR) wynoszącego 1% za pomocą TopPIC.

Dalszą analizę danych przeprowadzono w środowisku R w celu obliczeń statystycznych i generowania figur.54 W dalszej analizie proteoformy z tego samego genu z tymi samymi aminokwasami początkowymi i końcowymi, których zawartość mieściła się w zakresie ± 5 Da, połączono jako pojedynczą proteoformę, aby zwiększyć rygorystyczność naszych zadań.

Chociaż próg 5Da jest arbitralny, podejście to kompensuje nieprawidłowo przypisane piki monoizotopowe, niejednoznaczność nieznanych przesunięć mas i inne artefaktyczne odchylenia. Aby określić względne odchylenie standardowe (RSD) proteoform w obrębie replik, wykorzystaliśmy dane wyjściowe dotyczące „intensywności cech” z TopPIC.

Mapy pokrycia sekwencji fragmentacji i powiązane widma wygenerowano przy użyciu oprogramowania LCMsSpectator.55

Specyficzne ustawienia dla LCMsSpectator obejmowały tolerancję jonów prekursorowych wynoszącą 10 ppm, tolerancję produkcyjną wynoszącą 10 ppm, minimalny próg S/N wynoszący 1,5, próg korelacji Pearsona wynoszący 0,7, domyślne wygładzanie wynoszące 9 punktów, i próg względnej intensywności izotopu prekursora wynoszący 0,1.

WYNIKI I DYSKUSJA

Dodatek FAIMS znacznie zwiększa zasięg proteomu

Próbkę tkanki kory mózgowej od pacjenta, u którego zdiagnozowano chorobę Alzheimera, poddano obróbce zgodnie z procedurą, jak pokazano na rycinie 1. Najpierw staraliśmy się przeanalizować skuteczność FAIMS w różnych CV w porównaniu z tymi bez FAIMS (określane jako „Brak FAIMS”).

Warto pamiętać, że interfejs FAIMS powoduje niewielką utratę transmisji jonów, prawdopodobnie z powodu dłuższej ścieżki jonów przez źródło.56 Dlatego też, aby lepiej przedstawić typowe warunki i zapewnić sprawiedliwe porównania, dane „No FAIMS” zebrano przy użyciu tej samej próbki bez zainstalowana jednostka FAIMS.

Te dane „Brak FAIMS” zebrano w trzech powtórzeniach i przeanalizowano zgodnie z przebiegiem pracy, jak pokazano na Ryc. 1 z analizą 6 najlepszych DDA MS2. Zestawy danych „Brak FAIMS” pozwoliły zidentyfikować średnio 754 ± 35 proteoform (Rysunek 2A i Tabela S1) i wspólnie zidentyfikowali 1073 unikalnych (niezbędnych) proteoform (ryc. 2B) pochodzących z 293 unikalnych genów (ryc. 2C), obejmujących 29 359 aminokwasów w całym proteomie (ryc. 2D).

Metryka „pokrycia proteomem” (Figura 2D) jest zdefiniowana jako nienadmiarowe aminokwasy objęte sekwencją każdej proteoformy. Zasadniczo ta metryka uwzględnia zarówno długość, jak i różnorodność zidentyfikowanych proteoform.

Uważamy, że jest to bardziej zrównoważony wskaźnik w porównaniu z surową liczbą proteoform i genów, ponieważ pozwala uniknąć uprzedzeń w stronę mniejszych proteoform. Chociaż proste zliczenie proteoform lub genów jest intuicyjne, wydaje się, że na te metryki duży wpływ mają krótkie fragmenty proteolityczne. Zestawy danych FAIMS zebrano od -50 do -20 CV skanowanych w krokach co 5 V.

Każdy z powstałych 7 CV zebrano w trzech powtórzeniach. Jeśli chodzi o proteoformy i geny, FAIMS uzyskał lepsze wyniki niż „Brak FAIMS” dla wszystkich testowanych CV w zakresie od -50 do -30 CV (ryc. 2A – C).

Na przykład trzy zestawy danych przy -50 CV zidentyfikowały 1833 ± 17 proteoform, co stanowi średni wzrost o około 140% na przebieg w porównaniu z „Bez FAIMS”. Łącznie te trzy zestawy danych przy -50 CV zidentyfikowały 2564 unikalnych proteoform z 530 unikalnych genów obejmujących łącznie 43 437 aminokwasów, co stanowi wzrost o 95, 69 i 69% odpowiednio w porównaniu z trzema zestawami danych „NoFAIMS” (ryc. 2B – D i tabela S1).

increase memory

Ponadto, chociaż FAIMS przy -25 V obserwuje mniej unikalnych proteoform i genów w porównaniu z „No FAIMS”, same proteoformy są średnio znacznie dłuższe. Zatem, biorąc pod uwagę długość proteoform (Rysunek 2D), zestawy danych -25 V obejmują prawie tyle samo aminokwasów z proteomu (28 398) w porównaniu z „No FAIMS” (29 359), przy czym tylko o połowę mniej proteoform (Rysunek 2B ).

Zbadaliśmy również, czy FAIMS może zapewnić równie solidną i powtarzalną analizę w porównaniu z analizą bez FAIMS. Oceniliśmy powtarzalność ilościową poprzez obliczenie RSD (równoważnego współczynnikowi zmienności) intensywności cech każdej proteoformy, pod warunkiem, że proteoforma spełnia kryterium obserwacji we wszystkich trzech replikowanych zestawach danych dla każdego ustawienia CV.

Ponieważ wszystkie zestawy danych FAIMS i „Brak FAIMS” zostały zebrane z pojedynczej próbki biologicznej, różnice między powtórzeniami należy przypisywać wyłącznie czynnikom instrumentalnym.

Wykres pudełkowy na rysunku 3 (a także poszczególne histogramy na rysunku S1) pokazują, w jaki sposób rozkłady RSD porównują się między zestawami danych FAIMS i „Brak FAIMS”.

W oparciu o medianę RSD, dodanie FAIMS spowodowało podobną lub nieco lepszą jakość oceny ilościowej w porównaniu z „Bez FAIMS”. Poprawa RSD przy niższych napięciach (od -20 do -30 CV) może być powiązana z obserwacją, że w tym zakresie transmitowanych jest mniej proteoform, co zapewnia wyższą jakość widm MS1, a zatem lepsze oszacowanie intensywności cech.

Co więcej, warto zauważyć, że RSD określone na podstawie tych powtórzeń są podobne do poprzednich eksperymentów typu top-down55 i oddolnych57,58 przeprowadzonych przy użyciu podobnego instrumentu.

Podsumowując, dane te pokazują, że dodanie FAIMS do TDP znacznie zwiększa identyfikację proteoform, bez utraty jakości oznaczania ilościowego.

Następnie zbadaliśmy nakładanie się identyfikacji CV, co mogło dostarczyć największego, niezbędnego zestawu obserwacji.

Używając współczynników nakładania się, zdefiniowanych jako przecięcie dwóch zbiorów podzielone przez mniejszy z dwóch zbiorów, określiliśmy podobieństwo pomiędzy każdym zbiorem danych. Ogólny średni współczynnik nakładania się identyfikacji genów proteoform i genów w każdym CV FAIMS wyniósł 0,76.

Jest to porównywalne ze współczynnikiem nakładania się ze zbiorów danych „Brak FAIMS” (0,77), co sugeruje, że repliki techniczne wykazują podobną odtwarzalność. Mapę cieplną przedstawiającą współczynniki nakładania się FAIMS proteoform i genów pokazano odpowiednio na Figurach 4 i S2.

Warto zauważyć, że nakładanie się identyfikacji genów w przestrzeni CV jest znacznie większe w porównaniu z proteoformami, chociaż jest to szczególnie zauważalne przy porównywaniu najdłuższych odległości CV.

Na przykład nakładanie się między -50 i -20 CV wynosi 0,64 na poziomie genu i 0,06 na poziomie proteoformy. Tego oczekiwano, ponieważ każdy gen może potencjalnie być reprezentowany przez wiele proteoform.

ways to improve brain function

Rysunek 4 pokazuje, że podczas gdy różnica w CV wynosząca 5−10 V daje współczynniki nakładania się przeważnie powyżej 0,5, odległości większe niż 15 V powodują większe stopnie odmienności i dlatego są lepiej rozmieszczone w celu uchwycenia wystarczająco różnych zestawów proteoform.

Mając te zestawy danych, następnie staraliśmy się określić, które kombinacje CV są optymalne do osiągnięcia maksymalnej identyfikacji genów, identyfikacji proteoform i pokrycia sekwencji, z ograniczeniami dotyczącymi liczby CV dla każdej kombinacji.

Najpierw ustaliliśmy optymalne kombinacje dla dowolnej liczby CV od 1 do 7, korzystając z metryk unikalnych proteoform, genów i pokrycia sekwencji proteomu (ryc. 5).

Używając jako przykład kombinacji ograniczonych do trzech CV, Rysunek 5A, B szczegółowo opisuje, w jaki sposób -35, -40 i -50 V są idealne, jeśli chce się zmaksymalizować liczbę proteoform lub genów.

Proteoformy i geny zidentyfikowane w tych trzech CV (dziewięć zestawów danych) obejmują 84% wszystkich unikalnych proteoform i 92% wszystkich genów w całym zestawie 21 zestawów danych.

Kiedy ważymy długość proteoformy z pokryciem sekwencji jako miarą, idealna kombinacja wynosi -30, -40 i -50 CV, obejmująca 88% unikalnych aminokwasów ze wszystkich 21 zbiorów danych FAIMS z jedynie niewielką utratą identyfikacji proteoform i genów ( 4221 proteoform i 723 genów, Ryc. 5C). Jednakże te kombinacje obejmują wszystkie powtórzenia i reprezentują maksymalną identyfikację, jaką można osiągnąć dla danej kombinacji CV. Dlatego, aby zademonstrować zalety zewnętrznego stopniowania CV, postanowiliśmy zbadać, jakie liczby można w rozsądny sposób osiągnąć średnio w zaledwie trzech seriach, gdzie każdy przebieg jest innym CV.

Wykorzystując jako przykład zestawy danych -50, -40 i -30 V, określiliśmy średnie unikalne proteoformy, unikalne geny i pokrycie sekwencji proteomów w oparciu o 27 unikalnych kombinacji z trzech różnych replik w każdym CV.

Na podstawie tej analizy mogliśmy uzyskać 2986 (±46) unikalnych proteoform i 618 (±12) unikalnych genów obejmujących średnio 64 534 (±1089) aminokwasów. W porównaniu z potrójnymi zestawami danych „No FAIMS”, które zidentyfikowały 1073 unikalnych proteoform i 293 unikalnych genów obejmujących 29 359 aminokwasów, zewnętrzny krok CV przy -50, -40 i -30 V może ponad dwukrotnie zwiększyć każdą metrykę.

Niemniej jednak optymalna kombinacja CV będzie prawdopodobnie również zależeć od organizmu i tkanki, z której pochodzi próbka, zastosowanych etapów przygotowania próbki, a także dodatkowego frakcjonowania offline zastosowanego przed analizą LC-MS.

Ogólnie rzecz biorąc, w połączeniu z analizą nakładania się (rysunek 4), sugeruje się, że odległości między CV 15 V lub większe zapewniają najmniejsze nakładanie się proteoform, podczas gdy separacja 5-10 V w zakresie od -50 do -30 CV maksymalizuje geny, proteoformy i proteom pokrycie sekwencji.

Aby dokładniej określić wpływ FAIMS na głębokość pokrycia proteomem, porównaliśmy geny zidentyfikowane na podstawie naszych zestawów danych odgórnych z typową analizą oddolną ludzkiego mózgu.

Kompleksowe oddolne zestawy danych na temat ludzkiej tkanki mózgowej pozwoliły nam oszacować liczebność 8528 białek przy użyciu ważonego zliczania widm.59–61 Białka podzielono na 10 różnych percentyli liczebności na podstawie zliczeń widmowych zebranych z kilku oddolnych zestawów danych ludzkiego mózgu.

Dokonując odniesień do naszych odgórnych zbiorów danych, byliśmy w stanie określić, skąd pochodzą geny i proteoformy oraz uszeregować je pod względem szacowanej obfitości białka (przy użyciu zliczeń widmowych znormalizowanych na podstawie zestawu danych) w ludzkim mózgu (Rysunek 6).

improve your memory