Tubulozyd B z salsy Cistanche ratuje komórki neuronowe PC12 przed apoptozą i stresem oksydacyjnym wywołaną jonami 1-metylo-4-fenylopirydyniowymi

Wstęp

Patologicznie, sporadyczna choroba Parkinsona (PD) charakteryzuje się zazwyczaj utratą neuronów katecholaminergicznych, zwłaszcza neuronów dopaminergicznych istoty czarnej pars Compacta (SNc) i obecnością charakterystycznych neuronów wewnątrzneuronowych. wtręty zwane ciałami Lewy’ego w dotkniętych obszarach mózgu. Pomimo tego, że w patogenezę choroby Parkinsona zaangażowanych jest wiele czynników, mechanizmy zaangażowane w inicjację i progresję choroby Parkinsona pozostają niejasne. Chociaż przyczyna choroby Parkinsona pozostaje wyjaśniona, kilka dowodów silnie sugeruje udział stresu oksydacyjnego, co ostatecznie prowadzi do do śmierci neuronów lub apoptozy w wyniku nadmiernego wytwarzania wolnych rodników. Fakt, że układ dopaminergiczny czarnucha może wytwarzać wysoki poziom wolnych rodników i ma stosunkowo niski poziom układu obrony oksydacyjnej, dodatkowo potwierdza tę hipotezę. Zarówno badania in vivo, jak i in vitro wykazały neurotoksyczność MPP ＋, mediowaną stresem oksydacyjnym, aktywnego metabolitu l-metylo-4-fenylo-l,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) na neurony dopaminergiczne. Udział wolnych rodników wytwarzanych w nadmiernych ilościach w wyniku stresu oksydacyjnego jako bezpośredniej przyczyny chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona, sugeruje kluczową rolę przeciwutleniaczy. Tubulozyd B (ryc. 1) był jednym ze związków fenyloetanoidowych izolowanych z łodyg salsy Cistanche. Poprzednie badania wykazały, że wiele fenyloetanoidów, w tym tubulozyd B, wykazuje silne działanie wychwytujące wolne rodniki.

Biorąc pod uwagę te ustalenia, w niniejszym badaniu zbadaliśmy wpływ tubunizydu B na neurotoksyczność indukowaną MPP+-in vitro, stosując linię komórkową guza chromochłonnego nerwu współczulnego PC12, którą przez lata z powodzeniem stosowano do badania funkcji neuronów.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA W ZAPOBIEGANIU CHOROBIE PARKINSONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiały i metody

Materiały

Tubulozyd B z Cistanche Salsa został dostarczony przez dr Li Lei (Wydział Produktów Naturalnych, Szkoła Nauk Farmaceutycznych, Uniwersytet Pekiński, Pekin, Chiny). Czystość związku według analizy HPLC wynosiła ponad 98%. Pożywkę Eagle'a modyfikowaną Dulbecco (DMEM), surowicę końską i płodową surowicę cielęcą zakupiono od GIBCO BRL, 1-jon metylo-fenylopirydyniowy (MPP+), poli-L-lizyna, 3-(4,{ {8}}dimetylotiazol-2 -yl)-2,5- bromek difenylotetrazoliowy (MTT), jodek propidyny (PI), RNaza A, proteinaza K i 2; Dioctan 7'-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) zakupiono od firmy Sigma.

Hodowlę komórkową

Komórki PCI2 utrzymywano w DMEM uzupełnionym 10% surowicą końską, 5% płodową surowicą cielęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny. Komórki hodowano w nawilżonym inkubatorze napowietrzanym 95% powietrzem i 5% CO2 w temperaturze 37°C. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono 24-48 godzin po posianiu komórek. Komórki rutynowo zbierano metodą trypsynizacji 0,25%, gdy komórki osiągnęły stan subkonfluentny, i umieszczano na płytkach w 25 cm kolbach hodowlanych rozdzielonych w stosunku 1:8.

Analiza żywotności komórek

Żywotność komórek określono za pomocą zmodyfikowanego testu MTT, jak opisano wcześniej [10]. W skrócie, komórki PC12 wysiano na płytki z 96-studzienkami przy gęstości 1 × 104 komórek na studzienkę. Hodowle prowadzono przez 48 godzin, a następnie zmieniono pożywkę na zawierającą różne stężenia oparzenia B lub MPP+. Po inkubacji przez maksymalnie 48 i 72 godziny, do płytek 96-dołkowych dodano roztwór MTr (5 mg/ml w DMEM) i komórki pozostawiono do inkubacji przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Po usunięciu pożywki, kryształy komórek i barwnika stały się rozpuszczalnym surowcem przez dodanie 200 µl DMSO i zmierzono absorpcję przy 570 nm (540 nm jako odniesienie) za pomocą czytnika mikropłytek model 550 (Bio-Rad). Żywotność komórek analizowano także metodą wykluczenia błękitu trypanu. Komórki zebrano, delikatnie osadzono i wybarwiono 0,6% roztworem błękitu trypanu przez 3 deszcze. Następnie oceniano procent komórek niezabarwionych w dziesięciu losowo wybranych polach mikroskopowych. Jako lek pozytywny zastosowano 100 ng／ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO AKTYWNOŚCI WYMIATANIA WOLNYCH RODNIKÓW PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Wykrywanie apoptozy metodą cytometrii przepływowej

Komórki apoptotyczne wykrywano metodą cytometrii przepływowej przy użyciu jodku propidyny (PI) [11]. W skrócie, około 1 x 106 komórek inkubowanych z substancjami testowymi zebrano przez odwirowanie i przemyto raz PBS. Komórki utrwalono 70% etanolem przez 24 godziny w temperaturze - 20 i jednokrotnie przemyto PBS. Komórki następnie zawieszono w 300 µl PBS zawierającego 0,5 mg/ml RNazyA i 0,5 mg/ml PI. Po dalszej inkubacji przez 30 minut w ciemności przeprowadzono cytometrię przepływową za pomocą FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Niemcy).

Analiza fragmentacji DNA metodą elektroforezy

Zastosowaliśmy protokół Moore'a [12], który izolował tylko fragmentaryczne DNA, a eksperymenty normalizowano przy użyciu równej liczby hodowli z każdej grupy testowej. W skrócie, 3 × 106 neuronów z każdej próbki poddanej działaniu przemyto w zrównoważonym roztworze soli Hanka (1000 g przez 10 minut), a osady utworzone na dnie probówki homogenizowano z 1 ml buforu do lizy (10 mM Tris o pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) przez 20 minut na lodzie. Po odwirowaniu przy 11,000 g przez 20°C w temperaturze 4°C, supernatanty zawierające pofragmentowany DNA usunięto i trawiono 20 mg/ml RNazy A w 37°C przez 1 h i 0,1 mg/ml proteinazy K w 56°C. przez dodatkową 1 godz. Fragmentowane DNA ekstrahowano fenolem i chloroformem i odwirowano przy 10,000 g przez 1 deszcz w temperaturze 4 C. Fazę wodną przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa, zmieszano z 2 objętościami lodowatego etanolu, a następnie umieszczono w 20 stopniach na co najmniej 1 godzinę w celu wytrącenia DNA. Po wirowaniu w temperaturze 15,000 g przez 20 minut w temperaturze 4 stopni, supernatanty usunięto, a osady DNA przemyto jednokrotnie 80% etanolem (15 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni), wysuszono na powietrzu i rozpuszczono w 20 µl Bufor TE o pH 7,6. Całą próbkę poddano następnie elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym przez 1 godzinę przy 85 V. Żel zbadano i sfotografowano za pomocą systemu dokumentacji żelowej Ultra Violet Products (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Pomiar wewnątrzkomórkowego tworzenia się ROS

Tworzenie się wewnątrzkomórkowych nadtlenków wykryto za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego przy użyciu niefluorescencyjnego związku, dioctanu 2”7”-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) [13], który jest deestryfikowany w komórkach przez endogenne esterazy do zjonizowanego wolnego kwas, 2;7"-dichlorofluoresceina. 2",7-Dichlorofluoresceina może zostać utleniona do fluorescencyjnej 2"7"-dichlorofluoresceiny (DCF) przez hydroprzeciwutleniacze. Komórki inkubowano z 10 µM DCFH-DA przez 30 minut w temperaturze 37°C. Hodowle przemyto dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka i obrazowano w tym samym podłożu. Obrazowanie wykonano przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego, DCF wzbudzono przy 488 nm, a filtrem emisyjnym był filtr barierowy 510 nm. Aby zapewnić prawidłowe porównanie, do wszystkich obserwacji zastosowano te same parametry akwizycji. Ustalono optymalną pozycję pionową pośrodku komórek, a następnie szybko przeskanowano pole. Ponieważ oświetlenie przy długości fali wzbudzenia 488 nm powodowało zwiększoną fluorescencję w wyniku utlenienia tego barwnika, każde pole było wystawione na działanie światła przez ten sam czas. Wartości bazowe z niestymulowanych komórek zastosowano jako wartości kontrolne do porównania z komórkami traktowanymi MPP+ w obecności lub nieobecnościtubulozyd B. Po skanowaniu określono ilościowo średnią względną intensywność fluorescencji w 15-20 ciałach komórek nerwowych na pole mikroskopowe w czterech oddzielnych hodowlach na warunki leczenia.

Analiza statystyczna

Wszystkie uzyskane wartości wyrażono jako średnie ±SD. Istotność statystyczną różnic między grupami określono za pomocą testu t-Studenta; Obliczone wartości p mniejsze niż 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

Jak pokazano na ryc. 2, MPP+ powodowało zależne od dawki zmniejszenie żywotności komórek PCI2. W przeciwieństwie do tego, EGF, dobrze znany czynnik neurotroficzny, zapewniał znaczącą ochronę żywotności komórek przy 100 ng/ml MPP. Efekty cytotoksyczne indukowane MPP zostały również osłabione w obecności tubulozydu B (5, 10, 50 lub 100 ug-ml{{12} }), chociaż z mniejszą mocą niż odniesienie

lek (ryc. 3)． Tubulozyd B w tych stężeniach wykazywał działanie cytoprotekcyjne w sposób zależny od dawki, a sam związek nie powodował żadnej widocznej cytotoksyczności (dane nie pokazane). Elektroforeza żelowa ekstraktu DNA z komórek PCI 2 traktowanych 200 µM MPP+ przez 48 godzin wykazała drabinkę DNA. klasyczna cecha apoptozy, tubulozyd B, w dawkach 10 i 100 μg·ml-1wywoływana tworzeniem drabinki DNA (ryc.．4) ． Ryc. 5 przedstawia typowe histogramy analizy cytometrii przepływowej apoptotycznej śmierci komórek indukowanej przez MPP＋ w komórkach PC12 w obecności lub nieobecności tubulozydu B. Ilościowa ocena profilu cyklu komórkowego za pomocą PI ujawniła liczbę komórek o charakterystyce subdiploidalnej (region M1) wskazuje na apoptotyczną fragmentację DNA. W komórkach nietraktowanych frakcja subdiploidalna apoptozy była minimalna aż do 5．94% z wszystkich 10000 komórek (ryc. 5 A). Po 48-godzinnej ekspozycji na MPP+ odsetek apoptozy wzrósł do 43．02;j;(Ryc. 5 B)． Po dodaniu do hodowli komórkowej tubulozyd Bhamował apoptozę indukowaną MPP+-w sposób zależny od dawki. Przy stężeniu 10 ug·ml-1ochrona przez tubulozyd B nie była statystycznie istotna, ale przy 50 i 1 00ug·ml-1, odpowiednio 45 ％ i 63% spadku. był obserwowany. zwiększenie odsetka komórek przeżywających (ryc. 5D, E)．

Nagromadzenie wewnątrzkomórkowych ROS można wykryć za pomocą komórek DCFH-DA．PC12 traktowanych 200 uM MPP＋ przez 48 godzin, które wykazywały intensywną fluorescencję wewnątrz komórki po barwieniu barwnikiem DCFH-DA (ryc. 6)． Jednoczesne leczenie tubulozydem B (w dawkach 10 i 100 µg·ml) hamowało wytwarzanie ROS indukowane przez MPP＋一 (zmniejszony odsetek wynosił odpowiednio 24．52％ i 55．63％)．

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO LECZENIA CHOROBY PARKINSONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dyskusja

Patogeneza choroby Parkinsona obejmuje silny stres oksydacyjny, obniżony poziom przeciwutleniaczy i defekty mitochondrialne. wszystkie znane z indukowania apoptozy w kilku układach komórkowych. W szczególności wykazano, że wolne rodniki powodują aktywną śmierć komórek w neuronach. MPTP powoduje nieodwracalny i ciężki zespół podobny do choroby Parkinsona, który powoduje selektywną degenerację neuronów dopaminergicznych nigrostriatu u ludzi. Ta neurotoksyna została wykorzystana do stworzenia. jedliśmy zwierzęce modele PD[15]．MPTP jest przekształcany przez monoaminooksydazę B do Mpp＋, który gromadzi się w mitochondriach． gdzie hamuje kompleks mitochondrialny I i tę dysfunkcję mitochondriów. funkcja powoduje apoptozę[16]． Dlatego neurotoksyczność indukowana MPP+ w neuronach dopaminergicznych była szeroko stosowana jako model etiologiczny PD do badań przesiewowych środków neuroprotekcyjnych.

W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że tubulozyd B powoduje zmniejszenie śmierci komórek wywołanej MPP+- przez stres oksydacyjny w komórkach PC12. Ponadto wykazaliśmy, że tubulozyd B chroni również przed MPP w sposób zależny od dawki{{ 3}} indukowaną drabinkę DNA i apoptozę, co zmierzono za pomocą elektroforezy w żelu DNA i analizy cytometrii przepływowej. Co więcej, jednoczesne leczenie wyższymi stężeniami tubulozydu B hamowało wytwarzanie ROS indukowane przez MPP. Zatem tubulozyd B wykazał wielofunkcyjne działanie neuroprotekcyjne. W działaniu tubulozydu B może brać udział kilka mechanizmów, oddzielnie lub łącznie. Działanie przeciwutleniające jest możliwym mechanizmem neuroprotekcji za pośrednictwem tubulozydu B. Xiong Q odkrył, że tubulozyd B wykazywał silną aktywność wychwytywania wolnych rodników w stosunku do rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylhydrazylu, a anionorodnik ponadtlenkowy wytwarzany przez oksydazę ksantynowo]ksantynową.

Ostatnio doniesiono, że kilka fenyloetanoidów ma właściwości wychwytywania wolnych rodników i chroni toksyczne uszkodzenia wywołane stresem oksydacyjnym. ROS wytwarzane przez MPP+, takie jak nadtlenek wodoru, anion ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy, łatwo uszkadzają cząsteczki biologiczne, co może ostatecznie prowadzić do apoptotycznej lub nekrotycznej śmierci komórek. Zatem tubulozyd B może mieć bezpośrednie działanie zmiatające ROS. Chociaż nasze dane nie ustalają dokładnego miejsca, w którym tubulozyd B działa hamując akumulację ROS, sugerują, że mechanizm neuroprotekcyjny obejmuje stymulację szlaków antyoksydacyjnych. Badanie struktury molekularnej tubulozydu B wskazuje również, że posiada on silną zdolność dowymiatanie wolnych rodników(komunikacja personalna).

Inne mechanizmy również mogą być istotne. Na przykład tubulozyd B może mieć zdolność przeciwdziałania toksyczności MPP poprzez hamowanie otwierania porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów i dysfunkcji. Ponadto należy rozważyć, czy tubulozyd B ma bezpośredni wpływ na wzrost komórek nerwowych. Dokładny mechanizm neuroprotekcyjnego działania tubulozydu B pozostaje niejasny. Aby wyjaśnić pełny obraz jego działania neuroprotekcyjnego, potrzebne są dodatkowe badania.

Podsumowując, tubulozyd B zEkstrakt z salsy Cistanchema ewidentne działanie ochronne przeciwko apoptozie indukowanej MPP+-i stresowi oksydacyjnemu. Jego neuroprotekcyjne działanie przeciwko MPP + toksyczność może być ważne i sugerować, że może mieć potencjał terapeutyczny w zapobieganiu i leczeniu PD.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO LECZENIA CHOROBY PARKINSONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%