Komórki nowotworowe nie prezentują epitopów ograniczonych do MHC-II pochodzących z onkogenów komórkom T CD4+

Komórki T CD4+ odgrywają kluczową rolę w odporności przeciwnowotworowej poprzez rozpoznawanie antygenów peptydowych prezentowanych na MHC klasy II (MHC-II). Chociaż w niektórych nowotworach litych można wywołać ekspresję MHC-II, nie jest jasne, w jakim stopniu umożliwia to bezpośrednie rozpoznanie przez komórki T CD4+ specyficzne dla nowotworu. Wyizolowaliśmy i scharakteryzowaliśmy receptory antygenów komórek T (TCR) z naturalnie pobudzonych limfocytów T CD4+ specyficznych dla 2 onkoprotein, HPV-16 E6 i aktywującej mutacji KRASG12V, od pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi i gruczolakorak przewodowy trzustki i określił ich zdolność do rozpoznawania autologicznych lub ludzkich komórek nowotworowych wykazujących ekspresję antygenu dopasowanych do antygenu leukocytów. W obu przypadkach odkryliśmy, że TCR były zdolne do rozpoznawania komórek docelowych obciążonych peptydem, wykazujących ekspresję odpowiednich komórek prezentujących antygen MHC-II lub komórek B (APC), gdy antygeny ulegały endogennej ekspresji i były kierowane na szlak endosomalny, ale nie rozpoznawały nowotworu komórki wyrażające białko źródłowe nawet po indukcji ekspresji powierzchniowego MHC-II przez IFN- lub transdukcja z CIITA. Wyniki te sugerują, że inicjowanie i funkcjonalne rozpoznawanie zarówno onkoproteiny jądrowej (E6), jak i związanej z błoną (KRAS) ogranicza się głównie do prezentujących krzyżowo APC, a nie poprzez bezpośrednie rozpoznawanie komórek nowotworowych indukowanych do ekspresji MHC-II.

Korzyści z cistanche tubulosa-przeciwnowotworowego

Wstęp

Złośliwa transformacja komórek somatycznych inicjowana jest przez działanie aktywowanych onkogenów, które rozregulowują szlaki wzrostu komórek i prowadzą do niekontrolowanej proliferacji (1). W przypadku nowotworów związanych z HPV ekspresja wczesnych genów HPV E6 i E7 przyczynia się do onkogenezy poprzez hamowanie odpowiednio genów supresorowych nowotworu p53 i Rb (2). Alternatywnie, konstytutywna aktywacja onkogenu może nastąpić poprzez mutacje somatyczne w genach regulujących szlaki wzrostu i proliferacji komórek, takich jak rodzina RAS. Rzeczywiście, aktywujące mutacje KRAS, takie jak KRASG12V, są powszechnie spotykane u pacjentów z rakiem trzustki, okrężnicy i płuc (3). Chociaż onkogeny sprzyjają chorobie, mogą również stanowić cele dla układu odpornościowego gospodarza. W ostatnich latach powszechnie uznano rolę układu odpornościowego w zwalczaniu nowotworów związanych z HPV. Limfocyty T CD8+ i CD4+ rozpoznające HPV E6 i E7, a także inne białka HPV, zidentyfikowano zarówno we krwi obwodowej, jak i limfocytach naciekających nowotwór (TIL) od pacjentów z chorobą związaną z HPV nowotwory (4–6). Immunoterapie ukierunkowane na te antygeny, w tym terapeutyczne szczepionki przeciwnowotworowe i adoptywna terapia komórkowa (ACT) z użyciem TIL lub limfocytów T modyfikowanych TCR, stanowią aktywny obszar badań przedklinicznych i klinicznych (2). Szeroko opisano także odpowiedź komórek T na mutacje onkogenne (7–9). Ponadto istnieją bezpośrednie dowody kliniczne na to, że ACT z TIL ukierunkowanymi na zmutowanego KRAS może promować obiektywne odpowiedzi (10). Chociaż limfocyty T CD8+ rozpoznające epitopy pochodzące z onkogenów pośredniczą w bezpośredniej cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych (11–13), rola limfocytów T CD4+ w odporności przeciwnowotworowej jest mniej poznana. Niedawne badania podkreśliły podzbiór limfocytów T CD4+ wykazujących ekspresję markerów cytotoksycznych, takich jak granzym B (GrzmB), w nowotworach u ludzi (14, 15). Jednakże specyficzność antygenowa tych komórek, a tym samym ich potencjał terapeutyczny, pozostają w dużej mierze nieznane. Co więcej, aby te cytotoksyczne limfocyty T CD4+ rozpoznały i zabiły komórki nowotworowe, nie tylko komórka nowotworowa musi wykazywać ekspresję MHC-II, ale także odpowiednie antygeny muszą zostać skierowane na odpowiednią ścieżkę prezentacji. W tym badaniu zbadaliśmy zdolność limfocytów T CD4+ specyficznych dla onkoprotein HPV-16 E6 i KRASG12V do rozpoznawania komórek nowotworowych wykazujących ekspresję antygenu. Chociaż oba TCR były w stanie bezpośrednio rozpoznać endogennie przetworzone i zaprezentowane antygeny skierowane do przedziału endosomalnego komórek B dopasowanych pod względem HLA, żaden z nich nie był w stanie rozpoznać komórek nowotworowych wykazujących ekspresję antygenu z indukowaną ekspresją MHC-II. Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki sugerują, że tylko niektóre antygeny są prezentowane bezpośrednio na komórkach nowotworowych MHC-II+, co może ograniczać pulę limfocytów T CD4+ zdolnych do bezpośredniego rozpoznawania i eliminowania komórek nowotworowych.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Wyniki

Identyfikacja odpowiedzi limfocytów T CD-16 E6-specyficznych dla HPV4+ i CD8+ na TIL raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Przebadaliśmy serię indywidualnych hodowli TIL wyizolowanych z 2–4 mm fragmentów nowotworu od pacjenta (Hu-56) z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi HPV-16+ (HNSCC) (Tabela uzupełniająca 1; materiały dodatkowe dostępny w Internecie z tym artykułem; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) za pomocą testów IFN-ELISPOT w celu identyfikacji odpowiedzi komórek T skierowanych przeciwko onkoproteinom wirusa HPV-16 E6 i E7, przy użyciu pul peptydów obejmujących nakładające się 15-mery obejmujące całą długość białek E6 i E7. Warto zauważyć, że fragmenty 12 i 29 TIL generowały znaczną liczbę plamek na tle po ponownej stymulacji pulą peptydów E6 i zawierały zarówno limfocyty T CD4+, jak i CD8+ (Figura 1A i Figura dodatkowa 1A). Aby zidentyfikować odpowiednie podzbiory komórek T, przeanalizowaliśmy te hodowle TIL za pomocą testu wydzielania cytokin. To ujawniło, że fragment TIL 29 (F29) zawierał E6-reaktywne komórki T CD8+, podczas gdy fragment 12 (F12) zawierał zarówno komórki T CD4+, jak i CD8+ zdolne do rozpoznając pulę peptydów E6 (Figura 1B). Żadna z limfocytów T CD4+ nie wytworzyła IL-5 w odpowiedzi na ponowną stymulację E6, potwierdzając fenotyp podobny do Th1-. Aby określić klonalność TCR TIL specyficznych dla E6-, posortowaliśmy pojedyncze komórki T CD4+ wydzielające IFN z F12 i komórki T CD8+ z F12 i F29. Sekwencjonowanie TCR ujawniło pojedynczy TCR wyrażany przez limfocyty T CD4+ wydzielające IFN (n=31 z 31 zsekwencjonowanych komórek), jak również pojedynczy klon TCR wspólny dla CD wydzielających IFN-{{53 }} Limfocyty T zarówno z F12, jak i F29 (odpowiednio n=40 z 41 i 37 z 38 zsekwencjonowanych komórek) (tabela uzupełniająca 2). Wyniki te wskazują, że monoklonalne limfocyty T CD4+ i CD8+ reagujące na E6 są obecne w TIL od tego pacjenta. Limfocyty T CD8+ z ograniczeniem do HLA-A*02:01 z TIL rozpoznają E6 prezentowany przez linię komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta. TIL z F29 wytwarzały IFN- po ponownej stymulacji peptydem E629-38, co sugeruje, że TCR F29 rozpoznał ten wcześniej opisany epitop ograniczony do HLA-A*02:01 (Uzupełniający Rysunek 1B) (11). Zostało to potwierdzone w badaniach wiązania tetrameru przy użyciu E629-38/HLA-A*02:01 do znakowania komórek J76 z niedoborem TCR wykazujących ekspresję ludzkiego CD8 i przy użyciu wcześniej opisanego TCR specyficznego dla E628-38 jako wyniku dodatniego sterowanie (rysunek 2A) (11). Obydwa TCR wykazywały podobny poziom awidności funkcjonalnej, co wykazano przez zwiększenie poziomu markera ostrej aktywacji CD69 na J76 po stymulacji autologicznymi liniami komórek limfoblastoidalnych B (B-LCL) poddanych działaniu impulsów peptydu E629-38 w miareczkowanych stężeniach (Figura 2, B i C). Dane te potwierdzają obecność klonu komórek T CD8+ specyficznego dla znanego epitopu E6 o cechach funkcjonalnych podobnych do TCR, który był testowany w warunkach klinicznych (16). Następnie staraliśmy się ustalić, czy CD8+ TCR specyficzny dla E może rozpoznawać antygeny wyrażane endogennie i w ten sposób pośredniczyć w cytotoksyczności przeciwnowotworowej. Aby to zrobić, wykorzystaliśmy dobrze scharakteryzowaną linię nowotworową HLA-A*02:01+ HPV-16+, CaSki, a także autologiczną linię komórek nowotworowych, HNSCC-56, wygenerowaną przez przeprogramowanie komórkowe pierwotnej tkanki nowotworowej, jak opisano wcześniej (17), do testów cytotoksyczności in vitro. Analiza RNA-Seq potwierdziła ekspresję wczesnych genów HPV-16, w tym E6, zarówno w próbce pierwotnego guza, jak i autologicznej linii komórkowej (rysunek uzupełniający 1C). Pierwotne ludzkie komórki T CD8+ eksprymujące F29 TCR mogą pośredniczyć w zabijaniu komórek zarówno CaSki, jak i HNSCC-56 w zakresie stosunku efektora do celu in vitro (ryc. 2, D i E). Łącznie dane te potwierdzają, że F29 TCR rozpoznaje endogennie eksprymowany antygen E6. Identyfikacja ograniczonych do HLA-DQ, specyficznych dla E6-komórek T CD{121}} z TIL. Aby rozszerzyć TIL specyficzne dla E6-do dalszej analizy funkcjonalnej, zastosowaliśmy wcześniej opisany protokół hodowli szybkiej ekspansji z OKT-3 i napromieniowanymi allogenicznymi PBMC w celu namnożenia TIL z F12. Chociaż pierwotna kultura F12 pierwotnie zawierała zarówno limfocyty T CD8+, jak i CD4+ z reaktywnością E6, końcowy produkt komórkowy po szybkiej ekspansji zawierał 99% limfocytów T CD4+, z czego około 38,33 % wykazało reaktywność wobec E6, jak wykazano poprzez barwienie wewnątrzkomórkowych cytokin pod kątem IFN- (Figura 3A).

Zioło chińskie cistanche roślina-przeciwnowotworowa

Oprócz IFN-, stymulowane E6-specyficzne dla E4+ TIL mogą wydzielać TNF-, ale nie IL-2 (rysunek uzupełniający 2A). Chociaż całkowita częstotliwość występowania komórek GrzmB+ nie wzrosła wraz ze stymulacją antygenem, bramkowanie komórek wydzielających TNF- ujawniło, że TIL CD6-specyficzne dla E4+ zawierały więcej zmagazynowanego wewnątrzkomórkowego GrzmB niż nieswoiste TIL (rysunek uzupełniający 2B). ). CD4+ wydzielające IFN- TIL wyrażały także marker współhamujący programowanej śmierci komórki 1 (PD-1), co jest zgodne z opublikowanymi sygnaturami CD4+ TIL reagujących na nowotwór (rysunek uzupełniający 2C) ( 18, 19). E6-specyficzne CD4+ TIL wykazały wysoką awidność funkcjonalną, ponieważ komórki te mogły wydzielać cytokiny przy stężeniach peptydów mniejszych niż 1 ug/ml (Rysunek 3B). Aby określić specyficzność hodowli F12 TIL, pulsowaliśmy autologiczne B-LCL indywidualnymi peptydami odpowiadającymi każdemu z 37 peptydów zawartych w oryginalnej puli E6 (tabela uzupełniająca 3). CD4+ TIL z F12 wydzielały IFN- po stymulacji peptydami E61-15 i E65-19, które mają wspólną sekwencję rdzenia składającą się z 11 aminokwasów (rysunek uzupełniający 2D). Eksperymenty z współkulturą w obecności Ab blokujących HLA ujawniły znacząco zmniejszone wydzielanie IFN przez TIL, gdy B-LCL były blokowane Ab anty-HLA-DQ, ale nie Ab anty-HLA-DR lub Ab kontroli izotypowej (Figura 3C). Aby określić, które allele HLA-DQ są odpowiedzialne za prezentację tego epitopu, do B-LCL eksprymujących znane allele HLA-DQ (tabela uzupełniająca 4) dodaliśmy E61-15 i odkryliśmy, że komórki KAS011 eksprymujące HLA-DQA1*01 :02 i DQB1*05:02, ale nie Hu-195 B-LCL wyrażające DQA1*05:05 i DQB1*03:01, mogą prezentować antygen TIL w sposób porównywalny z autologicznym Hu{{63} } B-LCL (rysunek 3D). Na koniec staraliśmy się sprawdzić, czy zidentyfikowana wcześniej sekwencja TCR rzeczywiście była odpowiedzialna za rozpoznanie E6. Ekspresja F12 TCR w komórkach T CD4+ pierwotnego ludzkiego zdrowego dawcy była wystarczająca do promowania rozpoznawania peptydu E61-15, o czym świadczy zwiększenie ekspresji CD69 i PD-1 (Figura 3E ). Podsumowując, wyniki te pokazują identyfikację epitopu E6 ograniczonego do HLA-DQ rozpoznawanego przez monoklonalne CD4+ TIL. E6-specyficzne limfocyty T CD4+ nie rozpoznają ani nie zabijają autologicznych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję MHC-II. W ostatnich badaniach zidentyfikowano sygnatury genetyczne cytotoksycznych CD4+ TIL w niektórych nowotworach u ludzi (14, 15). Nie wiadomo jednak, czy cytotoksyczne komórki T CD4+ odgrywają rolę w nowotworach wywoływanych przez HPV. Aby ustalić, czy komórki T CD4+ specyficzne dla E z TIL mogą bezpośrednio rozpoznawać HNSCC-56, najpierw zbadaliśmy jego status ekspresji MHC-II. Chociaż komórki nowotworowe nie wyrażały wykrywalnego powierzchniowego MHC-II w hodowli, leczenie IFN- przez 72 godziny było wystarczające do wywołania zwiększonej ekspresji MHC-II (Figura 4A). Następnie hodowaliśmy HNSCC-56 z CD4+ TIL. Co ważne, komórki nowotworowe MHC-II+ prekondycjonowane IFN- nie były w stanie stymulować TIL CD4+, jak zmierzono na podstawie wydzielania IFN- (Figura 4B).

Rysunek 1. Identyfikacja E6-reaktywnych CD4+ i CD8+ TIL z HPV-16+ HNSCC. (A)

Rysunek 2. Charakterystyka funkcjonalna TCR ograniczonego do HLA-A*02:01, specyficznego dla E6-TIL z Hu-56 TIL. (A)

Jednakże linie komórkowe nowotworu traktowane IFN, poddane działaniu E61-15 przed dodaniem TIL, były w stanie stymulować odpowiedź komórek T, co wskazuje, że ekspresja powierzchniowa restrykcyjnych alleli HLA-DQ w linii komórkowej, która endogennie wyraża E6 nie było wystarczające do rozpoznania nowotworu, ale wymagało egzogennego obciążenia docelowym peptydem. Ten sam wymóg dotyczący obciążenia egzogennym docelowym peptydem zaobserwowano w przypadku komórek nowotworowych transdukowanych CIITA (HNSCC-56 CIITA), które konstytutywnie wyrażają wysoki poziom powierzchniowego MHC-II (Figura 4B). Aby sprawdzić, czy CD4+ TIL potrafią rozpoznać endogennie obrobioną i zaprezentowaną wersję epitopu E6 na APC, dokonaliśmy retrowirusowej transdukcji autologicznych B-LCL konstruktem ekspresyjnym kodującym pierwsze 50 aminokwasów E6 połączonych z MHC- Domena transbłonowa I (E6-MITD), która indukuje lokalizację połączonej sekwencji aminokwasowej w błonie komórkowej i wspiera prezentację MHC-II poprzez transport endosomalny (20). B-LCL wyrażające konstrukt E6-MITD mogą stymulować TIL CD4+ specyficzne dla E4+, co wskazuje, że epitop peptydowy rozpoznawany przez te TIL może być naturalnie przetwarzany i prezentowany na MHC-II, gdy skierowane na odpowiednią ścieżkę (Rysunek 4C).

Rycina 3. Charakterystyka funkcjonalna ekspandowanych klonalnie, ograniczonych do HLA-DQ, specyficznych dla E6-TIL CD4+. (A)

Następnie staraliśmy się ustalić, czy TIL specyficzne dla F12 E6-CD4+ są zdolne do bezpośredniej cytotoksyczności nowotworu. Zgodnie z danymi z naszych testów rozpoznawania, limfocyty TIL specyficzne dla E6-CD4+ nie były w stanie ograniczyć wzrostu komórek nowotworowych HNSCC-56, które nie wyrażają MHC-II (Rysunek 4D) . Co więcej, komórki nowotworowe HNSCC-56 CIITA również rosły w sposób niehamowany w obecności CD4+ TIL. Jednakże wzrost komórek nowotworowych HNSCC-56 CIITA poddanych działaniu peptydu E61-15 został zahamowany w sposób zależny od dawki komórek efektorowych. Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że chociaż HNSCC-56 może prezentować epitopy E6 limfocytom T CD8+, TIL specyficzne dla E6-CD4+ nie są w stanie bezpośrednio rozpoznawać i lizować MHC- Autologiczne komórki nowotworowe II+. Geny biorące udział w prezentacji antygenu są często mutowane w przypadku nowotworów, co może uniemożliwić rozpoznanie przez limfocyty T (21). Aby ustalić, czy komórki nowotworowe HNSCC-56 zawierają jakiekolwiek mutacje somatyczne wykluczające prezentację antygenu na MHC-II, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie całego egzomu komórek nowotworowych i PBMC z Hu-56 jako próbki referencyjnej. Spośród 104 zidentyfikowanych niesynonimicznych mutacji somatycznych nie było widocznych mutacji w składnikach szlaku prezentacji MHC-II, w tym HLADMA, HLADMB i CD74 (tabela uzupełniająca 5). Identyfikacja TCR ograniczonego do HLA-DRB5*01:01, specyficznego dla KRASG12V z krwi pacjenta z gruczolakorakiem przewodowym trzustki. Po tych wynikach postanowiliśmy ustalić, czy niezdolność komórek nowotworowych do prezentacji antygenu na MHC-II była prawdziwa w przypadku innych onkogenów. Biorąc pod uwagę, że u ludzi chorych na raka zidentyfikowano krążące limfocyty T specyficzne dla nowotworu (8, 22), stymulowaliśmy PBMC od pacjenta (Hu-66) z gruczolakorakiem przewodowym trzustki (tabela uzupełniająca 1) pulą peptydów odpowiadające powszechnym mutacjom onkogennym (tabela uzupełniająca 6) przez 14 dni przed ponowną stymulacją indywidualnymi peptydami w celu zidentyfikowania odpowiednich odpowiedzi komórek T za pomocą testu ELISPOT. Wyniki te wskazują na obecność odpowiedzi komórek T skierowanej przeciwko KRASG12V, o czym świadczy zwiększona liczba plamek IFN- na tle w odpowiedzi na aminokwasy 1–15 KRASG12V (Figura 5A). Aby zidentyfikować odpowiednie TCR związane z tą odpowiedzią, ponownie zastosowaliśmy test wydzielania cytokin do sortowania komórek wydzielających IFN. Test wydzielania cytokin ujawnił specyficzną produkcję IFN przez limfocyty T CD4+ w odpowiedzi na ponowną stymulację KRASG12V (Figura 5B). Porównanie łańcuchów TCR z posortowanych komórek wydzielających IFN z łańcuchami obecnymi w nieekspertowanych PBMC od tego pacjenta ujawniło pojedynczy klonotyp TCR występujący z najwyższą częstotliwością w obu populacjach (Figura 5C i Tabela uzupełniająca 2). Wyniki te wskazują, że częstotliwość występowania tego klonu komórek T wzrosła na początku w PBMC, co sugeruje naturalnie powstającą odpowiedź in vivo, a nie in vitro w naszej hodowli ekspansji. Aby zweryfikować specyficzność antygenową tego TCR, wyraziliśmy go w pierwotnych ludzkich limfocytach T CD4+ poprzez transdukcję retrowirusową i hodowaliśmy te komórki z autologicznymi B-LCL traktowanymi pulsowo zmutowanym KRASG12V lub odpowiadającym mu peptydem WT. Zaprojektowane komórki T wydzielały IFN- po stymulacji zmutowanym, ale nie WT, peptydem KRAS, weryfikując, że ten TCR jest specyficzny dla KRASG12V (Figura 5D). Zgodnie z naszymi wynikami z E6 TCR, zmodyfikowane komórki T wyrażające TCR specyficzny dla KRASG12V były również w stanie rozpoznać B-LCL wyrażające fragment KRASG12V, ale nie WT KRAS, skierowane do endosomu przez włączenie MITD, co sugeruje, że to TCR rozpoznaje endogennie przetworzony i prezentowany antygen (ryc. 5D).

Rycina 4. Autologiczne komórki nowotworowe nie prezentują endogennego E61-15 na limfocytach T CD4+ MHC-II. (A)

Rycina 5. Identyfikacja TCR ograniczonego do HLA-DRB5*01:01, specyficznego dla KRASG12V z krwi pacjenta z gruczolakorakiem przewodowym trzustki. (A)

Aby zidentyfikować ograniczający allel HLA, powtórzyliśmy te eksperymenty ze stymulacją peptydami, stosując B-LCL wyrażające różne kombinacje genów HLA. B-LCL wyrażające powszechny haplotyp HLA-B7-DR15-DQ6 mogą stymulować zmodyfikowane limfocyty T, podczas gdy B-LCL bez tych alleli nie mogą (Rysunek 5E). Ostatecznie, stymulacja tych komórek przez IHW03304, mysią linię komórkową DAP3 transfekowaną ludzkim HLA-DRB5*01:01 z impulsem peptydu, potwierdziła, że ​​jest to ograniczająca cząsteczka HLA (Figura 5F). Komórki nowotworowe MHC-II+ NCI-H2444 i DAN-G nie prezentują epitopu pochodzącego z KRASG12V limfocytom T CD4+. Następnie zbadaliśmy zdolność komórek nowotworowych do bezpośredniej prezentacji epitopów pochodzących z KRASG12V na MHC-II. Aby wygenerować linie komórkowe MHC-II+ dopasowane pod względem HLA do tych badań, transdukowaliśmy linie komórkowe KRASG12V+ NCI-H2444 i DAN-G, pochodzące odpowiednio z ludzkich nowotworów płuc i trzustki, za pomocą CIITA i konstruktu kodującego HLA-DRB5*01: 01 ze skróconym genem reporterowym CD34 (Figura 6A). Zgodnie z naszymi wcześniejszymi wynikami, komórki nowotworowe MHC-II+ wyrażające restrykcyjny allel HLA nie były w stanie stymulować limfocytów T zmodyfikowanych TCR, chyba że komórki docelowe zostały najpierw poddane działaniu egzogennego peptydu (Figura 6B). Co ważne, w publicznie dostępnych danych sekwencjonowania nie wymieniono mutacji somatycznych w genach prezentacji MHC-II (mianowicie HLADMA, HLADMB, CD74) ani dla NCI-H2444, ani DAN-G (23). Komórki NCI-H2444 CIITA rosły bez zahamowań w obecności limfocytów T zmodyfikowanych TCR, podczas gdy komórki NCI-H2444 CIITA poddane działaniu peptydu KRASG12V doświadczyły opóźnionego wzrostu guza (Figura 6C). Zgodnie z wynikami uzyskanymi dla HNSCC-56, limfocyty T CD8+ eksprymujące TCR ograniczony do HLA-A*03:01, specyficzny dla KRASG12V (24) były w stanie rozpoznać komórki NCI-H2444, ale nie Komórki CaSki, które wyrażają HLA-A*03:01, ale nie KRASG12V (Figura 6D). Wyniki te pokazują, że odrębny onkogen obecny w cytozolu również nie może być prezentowany przez komórki nowotworowe MHC-II+, mimo że jest skutecznie prezentowany na MHC-I. Ekspresja ligandów współhamujących, takich jak ligand programowanej śmierci komórkowej 1 (PD-L1), przez komórki nowotworowe ogranicza sygnalizację TCR w komórkach T (25). Aby ustalić, czy ten mechanizm może zapobiegać rozpoznawaniu komórek nowotworowych MHC-II+ przez komórki T CD4+, hodowaliśmy komórki T CD4+ wyrażające nasz TCR ​​specyficzny dla KRASG12V lub specyficzny dla E6- F12 TCR z odpowiednio NCI-H2444 CIITA i HNSCC-56 CIITA, z Abs blokującym anty-PD-L1 lub bez niego. Blokowanie interakcji PD-L1/PD-1 nie było wystarczające, aby promować rozpoznawanie komórek nowotworowych (Uzupełniający Rysunek 3). Podobnie dodanie agonisty anty-CD28 Ab nie modulowało rozpoznawania komórek nowotworowych. Wyniki te sugerują, że za ten fenotyp odpowiedzialny jest raczej brak prezentacji antygenu niż obecność lub brak odpowiednio sygnałów współhamujących lub kostymulujących. Niektóre badania sugerują, że endogenne białka internalizowane z błony komórkowej są preferencyjnie ładowane na MHC-II w celu prezentacji, w porównaniu z innymi przedziałami subkomórkowymi (26). Chociaż białka KRAS są często powiązane z błonami poprzez modyfikacje lipidów, nie wyrażają domeny transbłonowej, a interakcje te nie są stabilne (3, 27). Doszliśmy zatem do wniosku, że zakotwiczenie immunogennego fragmentu KRASG12V w błonie komórkowej komórek nowotworowych może umożliwić bezpośrednie rozpoznawanie antygenu przez limfocyty T CD{103}}. Jednakże komórki nowotworowe eksprymujące konstrukt KRASG12V-MITD, o czym świadczy ekspresja reportera EGFP połączonego z P2A, były podobnie niezdolne do stymulacji limfocytów T CD4+ TCR (Uzupełniająca Figura 4). Wyniki te sugerują, że subkomórkowa lokalizacja onkogenu nie jest jedynym wyznacznikiem bezpośredniej prezentacji MHC-II przez komórki nowotworowe. Ponadto wyniki te sugerują, że nadekspresja antygenu nie jest wystarczająca do promowania prezentacji MHC-II. Nasze dotychczasowe wyniki sugerują, że komórki T CD4+ specyficzne dla nowotworu mogą z większym prawdopodobieństwem rozpoznawać antygeny prezentowane przez APC niż przez same komórki nowotworowe. Dlatego oceniliśmy zdolność DC HLADRB5*01:01+ do prezentowania antygenów pochodzących z białek egzogennych. DC dopasowane do HLA wytworzone in vitro były zdolne do stymulacji zmodyfikowanych za pomocą TCR limfocytów T CD4+ wykazujących ekspresję TCR specyficznego dla KRASG12V, gdy niedojrzałe DC albo poddano impulsowi peptydu 20-merowego KRASG12V, albo karmiono całym białkiem KRASG12V, ale nie białko KRAS WT (Figura 6E). Wyniki te sugerują, że chociaż TCR nie może rozpoznać endogennych antygenów prezentowanych przez komórki nowotworowe, może rozpoznać antygeny egzogenne prezentowane krzyżowo w kontekście DC.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Dyskusja

Celem tego badania było ustalenie, czy TCR wyizolowane z naturalnie przygotowanych komórek T uzyskanych od pacjentów chorych na raka mogą rozpoznawać komórki nowotworowe wykazujące ekspresję onkogenów. W odniesieniu do ograniczonego do klasy I (HLA-A*02:01) TCR HPV-16 E629-38 uzyskanego z HNSCC TIL, rozpoznanie zostało potwierdzone, co być może nie jest zaskoczeniem, zarówno w przypadku autologicznej linii komórek nowotworowych oraz dobrze scharakteryzowaną komórkę nowotworową CaSki dopasowaną do HLA i wyrażającą E6- (co ważne, patrz Figura 2). Te same TIL (ryc. 1) zawierały także znaczną liczbę komórek T CD4+ wytwarzających IFN-specyficznie (ryc. 3), które natomiast nie rozpoznawały E6- wyrażające komórki nowotworowe, nawet jeśli indukowano je do ekspresji dużej powierzchni MHC klasy II prawidłowo prezentującego allelu (DQA1*01:02/DQB1*05:02) przez traktowanie IFN lub transdukcję CIITA (Figura 4). Ekspresja CIITA indukuje nie tylko powierzchniową ekspresję białek MHC-II, ale także HLA-DM i cząsteczek o łańcuchu niezmiennym, które są wymagane do przetwarzania i prezentacji antygenu (28). Natomiast komórki B dopasowane pod względem HLA zostały rozpoznane przez ten TCR, gdy antygen został skierowany na szlak MHC-II. Podobną sytuację zaobserwowano w przypadku TCR specyficznego dla KRASG12V, ograniczonego do HLA-DRB5*01:01, który potrafił rozpoznać limfocyty B dopasowane do HLA, ale nie komórki nowotworowe eksprymujące MHC-II, gdy antygen został skierowany do Ścieżka prezentacji MHC-II. Obydwa TCR wykazywały wystarczającą awidność funkcjonalną, aby pośredniczyć w rozpoznawaniu endogennie wyrażanych antygenów w warunkach opisanych powyżej i oba mogły pośredniczyć w cytotoksyczności komórek docelowych obciążonych peptydem. Ta ostatnia obserwacja odzwierciedla sytuację przedstawioną w kilku raportach na temat cytotoksycznych limfocytów T CD4+, chociaż nasze dane poszerzają kontekst tej obserwacji, pokazując, że endogenna ekspresja antygenu źródłowego i indukcja MHC-II przez IFN- jest mało prawdopodobna w celu uzyskania fizjologicznego celu na komórkach nowotworowych pochodzących z nabłonka dla TCR przeciwko antygenom jądrowym lub związanym z błoną. Niedawne badania ludzkiego raka pęcherza moczowego i czerniaka zidentyfikowały sygnatury genetyczne odpowiadające cytotoksycznym limfocytom T CD4+ wśród TIL (14, 15). Funkcjonalnie te cytotoksyczne CD4+ TIL są zdolne do bezpośredniego rozpoznawania guza zależnego od MHC-II, ostatecznie prowadząc do docelowej lizy przez granzymy w sposób podobny do ich odpowiedników CD8+. Jednakże terapeutyczne tłumaczenie tych odkryć może być ograniczone faktem, że niewiele guzów litych wyraża MHC-II. Rzeczywiście, wyniki 2 niezależnych badań sugerują, że tylko około jedna trzecia pacjentów z czerniakiem ma jakiekolwiek komórki nowotworowe MHC-II+, a częstość występowania tych komórek w nowotworze jest często mniejsza niż 10% (15, 29). Zamiast tego wydaje się, że dominującym komórkowym źródłem MHC-II w mikrośrodowisku nowotworu są naciekające leukocyty (26).

Rycina 6. Komórki nowotworowe MHC-II+ KRASG12V+ nie prezentują epitopów pochodzących z KRASG12V limfocytom T CD4+. (A)

Chociaż niektóre komórki guza litego rzeczywiście eksprymują konstytutywny lub indukowalny MHC-II, nasze wyniki wskazują, że pomimo obecności limfocytów T CD4+ specyficznych dla onkogenu wśród TIL i PBMC, komórki te nie są w stanie bezpośrednio rozpoznawać i lizować wyrażających antygen Komórki nowotworowe MHC-II+, podczas gdy epitopy z tego samego białka mogą być skutecznie prezentowane limfocytom T CD8+ na MHC-I (13). Sugeruje to, że zwykła ekspresja docelowego antygenu może nie wystarczyć do rozpoznania przez limfocyty T CD4+ podzbioru nowotworów wykazujących ekspresję MHC-II. Co więcej, wyniki te wydają się być spójne w przypadku wielu typów nowotworów, ponieważ linie komórkowe badane w tym badaniu obejmują te pochodzące z HNSCC, gruczolakoraka płuc i raka trzustki. W 2 badaniach opisano bezpośrednie rozpoznawanie przez limfocyty T CD4+ linii komórkowych czerniaka wykazujących ekspresję MHC-II w sposób naturalny lub po transdukcji CIITA (30, 31). Jednakże w obu tych badaniach znaczna część badanych TCR nie rozpoznawała bezpośrednio komórek nowotworowych. Nie jest jasne, czy te TCR reprezentują klonotypy „obserwatorów”, które nie rozpoznają antygenów nowotworowych, czy też TCR specyficzne dla nowotworu, które nie są w stanie rozpoznać swojego pokrewnego antygenu z powodu braków w prezentacji antygenu, takich jak te podkreślone w tym badaniu. Oliveira i in. (31) wykazali, że bezpośrednie rozpoznawanie przez limfocyty T CD4+ ograniczało się do 2 czerniaków z wyjątkowo wysokim obciążeniem mutacjami nowotworowymi, co sugeruje, że ten fenotyp może powodować dodatkowe niezbędne zmiany umożliwiające prezentację antygenów nowotworowych MHC-II. Chociaż dołączenie MITD do immunogennego fragmentu KRASG12V nie spowodowało bezpośredniego rozpoznania komórek nowotworowych przez limfocyty T CD4+, badania wykazały błąd w kierunku endogennych peptydów pochodzących z białek związanych z błoną eluowanych z MHC-II, prawdopodobnie w wyniku recyklingu membran (26, 32). Antygen czerniaka Trp1 występuje w błonie komórkowej, co może ułatwiać bezpośrednią prezentację limfocytom T CD4+ przez komórki nowotworowe B16 (33). Inny antygen związany z czerniakiem, gp100, jest prezentowany przez komórki nowotworowe limfocytom T CD4+ w sposób zależny od domeny transbłonowej gp100 (34). W niedawnej pracy badającej rolę limfocytów T CD4+ specyficznych dla neoantygenu w mysim modelu mięsaka, epitopy pochodzące ze zmutowanej podjednostki integryny, również białka związanego z błoną, wyeluowano z MHC-II na guzie transdukowanym CIITA komórki (35). Nasze wyniki sugerują, że chociaż białka związane z błoną mogą być preferencyjnie transportowane do endosomów w celu bezpośredniej prezentacji na MHC-II, obecność samego immunogennego białka błonowego nie jest wystarczająca do promowania tej prezentacji. Opisano inne nieklasyczne szlaki prezentacji, które mogą umożliwiać białkom cytozolowym lub jądrowym dostęp do MHC-II, w tym związaną z autofagią prezentację białek wewnątrzkomórkowych i transportera związanego z zależną od przetwarzania antygenu prezentacją limfocytom T CD4+, przy czym antygen peptydy są prawdopodobnie przenoszone z MHC-I do MHC-II podczas recyklingu membrany (36, 37). Donoszono o bezpośrednim, zależnym od MHC-II rozpoznawaniu autologicznych komórek nowotworowych przez limfocyty T CD4+ specyficzne dla epitopów E7 (38, 39); jednak oba badania dotyczyły białek E7 wyrażanych przez mniej rozpowszechnione onkogenne podtypy HPV (tj. HPV-33 i HPV-59) prezentowane przez komórki raka szyjki macicy na cząsteczkach HLA-DR. Jest zatem możliwe, że podtyp HPV, histologia nowotworu i allele ograniczające HLA mogą być również istotnymi czynnikami w różnicowej prezentacji antygenów jądrowych HPV na komórkach nowotworowych MHC-II+. Chociaż nasze dane sugerują, że bezpośrednia cytotoksyczność nowotworu nie jest prawdopodobnym mechanizmem limfocytów T CD4+ specyficznych dla E6- i KRASG12V, opisano inne mechanizmy przeciwnowotworowe limfocytów T CD4+ i Adopcyjny transfer limfocytów T CD4+ specyficznych dla nowotworu u pacjentów chorych na raka wykazał działanie przeciwnowotworowe (7, 40, 41). Dlatego też TCR ograniczone do MHC-II, takie jak te zidentyfikowane w tym badaniu, mogą być przydatne w ACT u ludzi, biorąc pod uwagę, że takie TCR są ukierunkowane na epitopy pochodzące z onkoprotein sterujących ograniczone do haplotypów HLA szacowane na 1,27% i 16,10% amerykańskiej białej populacji odpowiednio dla HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 i HLA-DRB5*01:01 (42). Warto zauważyć, że limfocyty T CD4+ pomagają w pobudzaniu limfocytów T CD8+ specyficznych dla nowotworu poprzez licencjonowanie DC niosących antygen w sposób zależny od CD40L (43–45). Wykazujemy, że TCR specyficzny dla KRASG12V zidentyfikowany w tym badaniu rozpoznaje antygeny prezentowane krzyżowo w kontekście DC, co sugeruje, że komórki te mogą być w stanie przyczyniać się do odporności przeciwnowotworowej poprzez tę funkcję. Limfocyty T CD4+ mogą również zapewniać lokalną pomoc limfocytom T CD8+ w nowotworach, wydzielając cytokiny, takie jak IL-2 i IFN-, wspierając przeżycie limfocytów T CD8+ i rekrutacja do nowotworu (46). Ponadto CD4+ TIL mogą rozpoznawać antygeny w mikrośrodowisku guza na komórkach mieloidalnych, takich jak makrofagi. Rzeczywiście, badania przedkliniczne wykazały, że w przypadku braku MHC-II na komórkach nowotworowych, adoptywnie przeniesione limfocyty T Trp1 CD4+ nadal mogą wykazywać odporność przeciwnowotworową zależną od IFN- i korelują ze zwiększoną aktywnością cytotoksyczną makrofagów (47). Jednakże zjawisko to wydaje się być zależne od wydzielania antygenu nowotworowego, które, jak spekulujemy, jest minimalne w przypadku większości onkogenów. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badanie podkreśla selektywność bezpośredniej prezentacji endogennych antygenów przez komórki nowotworowe MHC-II+ i pokazuje, że ani ekspresja CIITA, ani obecność antygenu związanego z błoną nie są same w sobie wystarczające do promowania bezpośredniego rozpoznawania komórek nowotworowych przez CD{{115} } Komórki T. Potrzebne są dalsze badania, aby scharakteryzować, które antygeny mogą być prezentowane bezpośrednio przez komórki nowotworowe MHC-II+, w jakich warunkach, aby w pełni zrozumieć zależną od kontekstu rolę limfocytów T CD4+ w nowotworze.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Metody

Hodowlę komórkową. TIL zebrano i hodowano w sposób opisany wcześniej (48). W skrócie, tkankę guza pierwotnego wypreparowano na fragmenty o wielkości 2–3 mm, które umieszczono w 24-płytce studzienkowej i hodowano w RPMI-1640 z dodatkiem 1{{1{117}}2}}% ludzka surowica AB, penicylina-streptomycyna, HEPES, gentamycyna i 6,000 IU/ml IL-2. Wynaczynione TIL hodowano poprzez wymianę połowy podłoża co 2–3 dni. Pierwotne ludzkie limfocyty T z krwi obwodowej hodowano w pożywce 50:50 składającej się z 50% AIM V plus 50% RPMI-1640 uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB, penicyliną-streptomycyną (100 U/ mL każdy; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/ml IL-2, 5 ng/ml IL-7 i 5 ng/ml IL-15. Wytworzono i hodowano linie komórkowe nowotworu pochodzące od pacjenta, jak opisano wcześniej (17). W skrócie, tkankę nowotworu pierwotnego pocięto na fragmenty mniejsze niż 2 mm i zdysocjowano przy użyciu GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Komórki nowotworowe zawieszono w pożywce F zawierającej 5 µM inhibitora kinazy Rho i wysiano na złoże napromieniowanych fibroblastów 3T3 (30 Gy). Po początkowej hodowli komórki nowotworowe namnażano w mieszaninie 3:1 napromieniowanej kondycjonowanej pożywki 3T3- i pożywki F zawierającej 5 µM inhibitora kinazy Rho. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L i B-LCL utrzymywano w pożywce RPMI uzupełnionej l-glutaminą i HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM pirogronian sodu (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1 x nieistotne aminokwasy MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific) i penicylina-streptomycyna (100 U/ mL każdy; Gibco). Utrzymaliśmy 293GP (ATCC) w dodatku do pożywki DMEM z 10% FBS i penicyliną-streptomycyną (100 U/ml każdy; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Komórki IHW03304, GM3107, KAS011, D8 i D66 były prezentem od Alessandro Sette (Instytut Immunologii La Jolla). Testy ELISPOT. TIL lub PBMC wysiano w ilości 100000 komórek na studzienkę na płytkach ELISPOT pokrytych antyIFN-Ab (1-D1K, Mabtech). Komórki ponownie stymulowano pulami peptydów HPV-16 E6 i E7 PepMix (JPT), pulami peptydów reprezentującymi wybrane mutacje onkogenne lub wskazanymi pojedynczymi peptydami w stężeniu 5 ug/ml dla pul lub 10 ug/ml dla peptydów przez 22 godziny przed rozwinięciem Płytki ELISPOT zgodnie z instrukcją producenta (Mabtech). Jako kontrolę pozytywną zastosowano 5 µg/ml fitohemaglutyniny-L. Kultura ekspansji ex vivo. PBMC wysiano na płytki z pulą peptydów reprezentującą wybrane mutacje onkogenne w stężeniu 5 µg/ml. W dniach 4, 7 i 10 dodano świeże podłoże zawierające 10 IU/ml IL-2. W dniu 14 PBMC ponownie stymulowano do stosowania w teście ELISPOT lub wydzielaniu cytokin. Sekwencjonowanie TCR. TIL lub PBMC ponownie stymulowano 5 ug/ml HPV-16 E6 PepMix (JPT) lub peptydem KRASG12V, a komórki wydzielające IFN znakowano fluorescencyjnie przy użyciu zestawu Human IFN-Section Assay zgodnie z instrukcjami producenta (Miltenyi Biotec) . Pojedyncze komórki IFN- + sortowano do płytki 96-studzienkowej przy użyciu FACSAria (BD Biosciences), a RNA-Seq przeprowadzono przy użyciu Illumina Miseq w celu identyfikacji sparowanych TCR i łańcuchów. W celu identyfikacji klonu CD4+ TCR specyficznego dla E, komórki wydzielające IFN- posortowano jak powyżej, a sekwencje TCR i TCR amplifikowano metodą zagnieżdżonej, multipleksowanej PCR, jak opisano wcześniej (49). Produkty PCR poddano sekwencjonowaniu Sangera (ETON Biosciences). Do analizy częstotliwości TCR komórki PBMC przed i po 14-dniowej ekspansji ex vivo wskazanymi peptydami wysłano do Adaptive Biotechnologies. Analiza ekspresji HPV. RNA wyizolowano z pierwotnych komórek nowotworowych Hu-56 i linii komórek nowotworowych i poddano masowemu badaniu RNA-Seq. Odczyty sekwencjonowania par końców zmapowano przy użyciu BWA (v0.7.12) (50) na pełny genom HPV (nr dostępu GenBank NC_001526.2) i odpowiadający mu transkryptom. Powstały plik mapy dopasowania sekwencji przekonwertowano na posortowaną binarną mapę dopasowania i zindeksowano, a następnie zliczono odczyty map przy użyciu narzędzia SAMtools (wersja 1.2) (50). Sekwencjonowanie całego egzomu. Sekwencjonowanie całego egzomu i sekwencję RNA przeprowadzono w La Jolla Institute for Immunology Sequence Core przy użyciu odpowiednio zestawów Agilent do przechwytywania całego egzomu i zestawów Illumina. Próbki biologiczne FFPE zostały rozesłane przez Moores Cancer Center do firmy Tempus w celu sekwencjonowania nowej generacji wraz z dopasowanym referencyjnym DNA przy użyciu próbek krwi obwodowej. Odczyty sekwencji z sekwencjonowania egzomu guza i próbek normalnych dopasowano do genomu referencyjnego GRCh38 za pomocą SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Warianty egzomu zidentyfikowano za pomocą SpeedSeq Somatic, a warianty opatrzono adnotacjami za pomocą SNPeff (v4.3i) (52). Dane dotyczące sekwencjonowania RNA-Seq i całego egzomu dla tego manuskryptu zostały przesłane do NCBI BioProject pod numerem dostępu PRJNA924789. Transdukcja retrowirusowa komórek T. Sekwencje nukleotydowe TCR zsyntetyzowano i sklonowano w szkielecie retrowirusa MSGV1 przy użyciu BioXP 3200 (Codex). Sekwencję zoptymalizowano pod kątem kodonów do ekspresji w komórkach ludzkich. Ludzkie regiony stałe TCR wymieniono na mysie regiony stałe TCR z podstawieniami w celu zwiększenia ekspresji powierzchniowej i promowania preferencyjnego parowania (53, 54). Ludzkie PBMC wyizolowano z kożuszka leukocytarnego. Komórki T CD4+ lub CD8+ usunięto metodą selekcji magnetycznej, a frakcję ujemną zawierającą wszystkie pozostałe limfocyty hodowano w pożywce dla komórek T z 50 ng/ml Ab anty-CD3 (OKT3) przez 2 dni.

Korzyści z cistanche tubulosa-przeciwnowotworowego

Supernatanty retrowirusa TCR wytworzono przez kotransfekcję komórek 293GP wektorem MSGV1 zawierającym odpowiednią sekwencję TCR i plazmid RD113. Dwa dni po transfekcji zebrano supernatanty retrowirusów i wykorzystano je świeże lub zamrożone w temperaturze –80 stopni. Transdukcje przeprowadzono na płytkach pokrytych RetroNectin (Takara), jak opisano wcześniej (5). Ekspresję mysiego regionu stałego TCR oceniano za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia wydajności transdukcji. Komórki T zmodyfikowane TCR zastosowano nie wcześniej niż 7 dnia po początkowej stymulacji. Testy funkcjonalne komórek T. Wspólnie hodowaliśmy 5 × 104 TIL, transdukowanych komórek T lub komórek J76 Jurkat z 1 × 105 B-LCL poddanych pulsowi przez noc wskazanymi stężeniami peptydu lub 5 × 103 komórek nowotworowych wysianych poprzedniego dnia w {{16} } odpowiednio płytki z dnem w kształcie litery U lub z płaskim dnem. Tam, gdzie wskazano, do hodowli komórek T i komórek nowotworowych dodano przeciwciała anty-CD28 (klon CD28.2, BioLegend) lub przeciwciała blokujące PD-L1 (klon 29E.2A3, BioLegend) w ilościach odpowiednio 5 i 10 µg/ml. Do testów cytokin i markerów aktywacji jako kontrolę pozytywną zastosowano 1 x koktajl aktywujący komórki (BioLegend) zawierający PMA i jonomycynę. Do badań blokowania HLA dodano 20 µg/ml następujących Ab do B-LCL pulsowanych peptydami co najmniej 2 godziny przed dodaniem komórek T: anty-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anty-HLA-DR (L243, BioLegend) lub mysia kontrola izotypowa IgG2a (MOPC-173, BioLegend). Tam, gdzie wskazano, komórki nowotworowe hodowano przez 72 godziny z 10 ng/ml rekombinowanego IFN- przed dodaniem komórek T. Supernatanty zbierano po 18–24 godzinach, mierzono IFN- za pomocą testu ELISA (Thermo Fisher Scientific), a osady komórkowe barwiono do cytometrii przepływowej. Testy cytotoksyczności przeprowadzono poprzez współhodowlę limfocytów T z komórkami nowotworowymi we wskazanych stosunkach efektora do celu. W skrócie, 5 x 103 komórek nowotworowych wysiano i hodowano przez noc, po czym dodano komórki T we wskazanych proporcjach. Lizę komórek docelowych określono za pomocą analizatora komórek xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), który oceniał impedancję elektryczną wynikającą z przylegania komórek co 30 minut aż do zakończenia eksperymentu. Dane analizowano przy użyciu pakietu oprogramowania xCELLigence RTCA, a wyniki raportowano jako indeks komórek znormalizowany do 1 w momencie dodania komórek T. Test prezentacji MHC-II. Wytworzono syntetyczne konstrukty DNA kodujące następujące elementy i wklonowano je do MSGV1 przy użyciu BioXP 3200 (Codex): N-końcowe 25 aminokwasów ludzkiego genu HLA-B, a następnie pierwsze 50 aminokwasów HPV-16 E6 lub 25 aminokwasów KRASG12V połączonych z C-końcowymi 55 aminokwasami ludzkiego HLA-B, elementem samoodcinającym T2A i sekwencją kodującą EGFP. Supernatanty wirusa wytworzono jak opisano powyżej, a autologiczne B-LCL transdukowano na płytki pokryte RetroNectin po całonocnej stymulacji na złożu napromieniowanych (0,5 Gy) komórek 3T3 wyrażających ludzki CD40L (3T3-CD40L). Skuteczność transdukcji oceniano za pomocą cytometrii przepływowej, oznaczając ilościowo ekspresję EGFP. Transdukowane B-LCL stymulowano 3T3-CD40L w obecności 200 IU/ml rekombinowanej ludzkiej IL-4 (PeproTech) przez 2 kolejne rundy po 2–3 dni przed wspólną hodowlą z autologicznymi TIL. Wytwarzanie DC do testów prezentacji antygenu. DC wygenerowano metodą przylegania plastycznego. Zamrożone PBMC rozmrożono i wysiano na płytki w pożywce DC (RPMI-1640 uzupełnionej l-glutaminą, 5% inaktywowaną termicznie ludzką surowicą AB i 100 U/ml każdej penicyliny-streptomycyny) przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Nieprzylegające komórki usunięto przez przemycie ciepłym PBS, a przylegające komórki hodowano w pożywce DC uzupełnionej 800 U/ml GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) i 500 U/ml IL-4 (PeproTech) przez 6 dni . Dodaliśmy 1 ug/ml peptydu KRASG12V lub 20 ug/ml białka KRASG12V lub WT KRAS (Abcam) bezpośrednio do niedojrzałych DC przez noc. Następnego dnia zebrano DC i hodowano wspólnie z limfocytami T zmodyfikowanymi za pomocą TCR w stosunku 1:1 przez noc, po czym oceniano regulację w górę CD137 za pomocą cytometrii przepływowej. Transdukcja retrowirusowa komórek nowotworowych. Sekwencję kodującą ludzką CIITA zsyntetyzowano (Integrated DNA Technologies) i sklonowano do MSGV1 przez Gibson Assembly. Sekwencje kodujące HLADRB5*01:01 i łańcuchy oddzielone sekwencją P2A zsyntetyzowano (Integrated DNA Technologies) i wklonowano do zmodyfikowanego wektora lentiwirusowego pHAGE powyżej sekwencji T2A, po której nastąpiła skrócona sekwencja reporterowa CD34 przez Gibson Assembly. Supernatanty retrowirusowe wytworzono z MSGV1, jak opisano powyżej. Supernatanty lentiwirusowe wytworzono przez kotransfekcję komórek 293T plazmidami pHAGE, tat, rev, gag/pol i vsv-g. Supernatanty wirusa zebrano 24 godziny później i zatężono przez odwirowanie w probówkach Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Komórki nowotworowe wysiano na płytki i 1 dzień później pożywkę zastąpiono supernatantem retrowirusowym lub lentiwirusowym uzupełnionym 10 µg/ml polibrenu. Cztery godziny później supernatant zawierający wirusa odessano i zastąpiono pożywką hodowlaną. Komórki nowotworowe MHC-II+ i CD34+ sortowano przy użyciu sortownika komórek FACS Fusion (BD Biosciences). Cytometrii przepływowej. Komórki znakowano monoklonalnymi Abs sprzężonymi z fluorochromem z następującymi antygenami: antyludzki CD3–PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8–APC (Hit8a, Tonbo , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) i anty-mysi TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Martwe komórki barwiono DAPI lub LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– Tetramer HLA-A*02:01–PE został zmontowany i oznaczony w ośrodku NIH Tetramer Core Facility. Komórki barwiono tetramerem w stężeniu 1 µg/ml przez 1 godzinę na lodzie. Barwienie Ab pod kątem antygenów powierzchniowych przeprowadzono przez 15 minut na lodzie. W celu wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (ICS) komórki T hodowano razem z APC pulsowanymi peptydami przez 4–6 godzin w obecności Brefeldin A. Komórki permeabilizowano i barwiono pod kątem cytokin wewnątrzkomórkowych za pomocą zestawu Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) po barwieniu powierzchniowym zgodnie z instrukcją producenta. Do barwienia cytokin zastosowano następujące Abs sprzężone z fluorochromem: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) i Granzym B-PE (QA16A02, BioLegend). Dane zebrano za pomocą cytometru przepływowego FACSCelesta (BD Biosciences) i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo v10.7. Statystyka. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania Prism 8 (oprogramowanie GraphPad). Do porównań ICS zastosowano niesparowany 2-test t z ogonem. Do porównania supresji sygnalizacji komórek T, w której pośredniczy HLA, Ab–Ab, zastosowano 2-analizę ANOVA. Za statystycznie istotny uznano P < 0,05. Zatwierdzenie badania. Zdeidentyfikowane próbki ludzkie użyte w tym badaniu uzyskano za świadomą zgodą zgodnie z protokołem UCSD IRB 101391CX, „Fenotypowanie środowiska nowotworu i izolacja komórek”. Osoby biorące udział w badaniu wyraziły pisemną świadomą zgodę.

Bibliografia

1. Hanahan D, Weinberg RA. Cechy charakterystyczne raka: następne pokolenie. Komórka. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA i in. Odporność nowotworowa i immunoterapia nowotworów związanych z HPV. Rak Discov. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK i in. Wiodący przegląd białek RAS i ich regulatorów w chorobach ludzi. Komórka. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ i in. Nieoczekiwanie duży repertuar poliklonalny limfocytów T specyficznych dla HPV jest gotowy do zastosowania u pacjentek z rakiem szyjki macicy. Rak Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S i in. Krajobraz immunogennych antygenów nowotworowych w skutecznej immunoterapii raka nabłonkowego wywołanego wirusem. Nauka. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH i in. Profilowanie odpowiedzi komórek T-16-specyficznych dla wirusa HPV ujawnia szeroką reaktywność antygenów u pacjentów z rakiem jamy ustnej i gardła. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR i in. Limfocyty T CD4 + naciekające nowotwór specyficzne dla BRAF V600E korelują z całkowitą odpowiedzią kliniczną w przypadku czerniaka. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR i in. Endogenne limfocyty T CD4+ rozpoznają neoantygeny u pacjentów z rakiem płuc, w tym nawracające onkogenne mutacje kierowcy KRAS i ERBB2 (Her2). Rak Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G i in. Limfocyty T pamięci ukierunkowane na mutacje onkogenne wykryte we krwi obwodowej pacjentów z rakiem nabłonkowym. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E i in. Terapia transferem komórek T ukierunkowana na zmutowany KRAS w raku. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM i in. Celowanie w komórki raka nabłonkowego HPV-16+ przez komórki T zmodyfikowane genetycznie TCR, skierowane przeciwko E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY i in. Zaprojektowane komórki T ukierunkowane na E7 pośredniczą w regresji nowotworów wywołanych wirusem brodawczaka ludzkiego w modelu mysim. Wgląd JCI. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS i in. Charakterystyka biochemiczna i funkcjonalna zmutowanych epitopów KRAS potwierdza przydatność tej onkoproteiny do celów immunologicznych. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Och DY i in. Wewnątrznowotworowe limfocyty T CD4+ pośredniczą w cytotoksyczności przeciwnowotworowej w przypadku ludzkiego raka pęcherza moczowego. Komórka. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A i in. Specyficzne dla nowotworu cytolityczne limfocyty T CD4 pośredniczą w odporności ochronnej przeciwko ludzkiemu nowotworowi. Adw. nauk. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL i in. Terapia genowa receptora komórek T w leczeniu nowotworów nabłonkowych związanych z wirusem brodawczaka ludzkiego: pierwsze badanie fazy I/II na ludziach. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X i in. Warunkowe przeprogramowanie i długoterminowa ekspansja komórek normalnych i nowotworowych z ludzkich próbek biologicznych. Protokół Nat. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR i in. Swoiste dla neoantygenu limfocyty T CD4+ w ludzkim czerniaku mają różnorodne stany różnicowania i korelują z funkcją limfocytów T CD8+, makrofagów i komórek B. Komórka Rakowa. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ i in. Sygnatury molekularne komórek T reagujących na neoantygen przeciwnowotworowy z przerzutowych ludzkich nowotworów. Nauka. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S i in. Zwiększona skuteczność prezentacji antygenu poprzez sprzęganie antygenów z sygnałami przemytu MHC klasy I. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM i in. Mutacje związane z nabytą opornością na blokadę PD-1 w czerniaku. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A i in. Rozpoznawanie neoantygenów ludzkiego raka przewodu pokarmowego przez krążące limfocyty PD-1+. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J. i in. TCLP: internetowy katalog linii komórek nowotworowych integrujący typ HLA, przewidywane neoepitopy, wirusy i ekspresję genów. Medycyna Genomu. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, wynalazcy; BioNTech US Inc., cesjonariusz. Konstrukty receptorów komórek T i ich zastosowania. Patent USA nr US202103040215A1. 4 listopada 2021 r.

25. Sharpe AH, Pauken KE. Różnorodne funkcje szlaku hamowania PD1. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG i in. Zdefiniowanie zasad przetwarzania i wiązania ligandu HLA-II za pomocą spektrometrii mas ułatwia przewidywanie epitopów nowotworowych. Odporność. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR i in. K-ras4B i białka prenylowane pozbawione „drugich sygnałów” łączą się dynamicznie z błonami komórkowymi. Komórka Mol Biol. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. Transaktywator klasy II reguluje ekspresję wielu genów zaangażowanych w prezentację antygenu. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ i in. Białka MHC nadają zróżnicowaną wrażliwość na blokadę CTLA-4 i PD-1 w nieleczonym czerniaku z przerzutami. Sci Transl Med. 2018;10(450):ear3342.

30. Ahmadzadeh M i in. Naciekające nowotwór ludzkie limfocyty T regulatorowe CD4+ wykazują odrębny repertuar TCR i wykazują reaktywność nowotworu i neoantygenu. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G i in. Krajobraz pomocniczych i regulatorowych przeciwnowotworowych limfocytów T CD4+ w czerniaku. Natura. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL i in. Zaprezentuj się! Przez cząsteczki MHC klasy I i MHC klasy II. Trendy Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y i in. Białko błony melanosomalnej jest celem na powierzchni komórki w terapii czerniaka. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Sekwencje kierujące do melanosomu z gp100 są niezbędne do prezentacji endogennych epitopów ograniczonych przez MHC klasy II i mobilizacji do przedziałów endosomalnych. Rak Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E i in. Neoantygeny MHC-II kształtują odporność nowotworu i odpowiedź na immunoterapię. Natura. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J. i in. Autofagia promuje prezentację peptydów klasy II MHC z białek źródłowych wewnątrzkomórkowych. Proc Natl Acad Sci USA A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J i in. Do bezpośredniego rozpoznawania nowotworu przez komórki T CD4+ specyficzne dla NY-ESO-1- wymagane są nieklasyczne szlaki przetwarzania antygenu, ograniczone do MHC klasy II. Rak Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H i in. Limfocyty CD4+ naciekające nowotwór w raku szyjki macicy rozpoznają peptydy ograniczone do HLA-DR dostarczane przez wirusa brodawczaka ludzkiego-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H i in. Peptydy wirusa brodawczaka ludzkiego typu 33 E7 prezentowane przez HLA-DR*0402 limfocytom T naciekającym nowotwór w raku szyjki macicy. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC i in. Leczenie pacjentów z rakiem z przerzutami z zastosowaniem receptora komórek T o ograniczonym dostępie do klasy II, głównego kompleksu zgodności tkankowej, ukierunkowanego na antygen nowotworowej linii zarodkowej MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E i in. Immunoterapia nowotworu oparta na limfocytach T CD4+ specyficznych dla mutacji u pacjenta z rakiem nabłonkowym. Nauka. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF i in. Aktualizacja bazy danych częstotliwości alleli (AFND) z 2020 r.: klasyfikacja danych według złotego standardu, dane genotypowe o otwartym dostępie i nowe narzędzia do zapytań. Kwasy nukleinowe Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP i in. Pomoc limfocytów T dla cytotoksycznych limfocytów T odbywa się za pośrednictwem interakcji CD40-CD40L. Natura. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T. i in. Limfocyty T CD4+ pomagają w realizacji programu efektorowego cytotoksycznych limfocytów T, obejmującego współhamowanie regulacji w dół receptora i zwiększoną inwazyjność tkanki. Odporność. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST i in. cDC1 prime i są licencjonowane przez limfocyty T CD4+ do indukowania odporności przeciwnowotworowej. Natura. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R., Sherman, Los Angeles. Pomoc limfocytów T CD4+ w środowisku nowotworu jest wymagana do rekrutacji i funkcji cytolitycznej limfocytów T CD8+. Rak Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW i in. Odrzucenie komórek nowotworowych pozytywnych pod względem MHC klasy II za pośrednictwem komórek T CD4+ zależy od wydzielania antygenu i pośredniej prezentacji na APC gospodarza. Rak Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME i in. Wytwarzanie hodowli limfocytów naciekających nowotwór do zastosowania w terapii transferu adoptywnego u pacjentów z czerniakiem. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P i in. Analiza jednokomórkowa repertuaru receptorów komórek T. Metody Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H. i in. Format dopasowania sekwencji/mapy i narzędzia SAM. Bioinformatyka. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C i in. SpeedSeq: ultraszybka analiza i interpretacja genomu osobistego. Metody Nata. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P i in. Program do opisywania i przewidywania skutków polimorfizmów pojedynczych nukleotydów, SnpEff: SNP w genomie Drosophila melanogaster szczep w1118; iso-2; izo-3. Leć (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A i in. Włączenie transbłonowych mutacji hydrofobowych do TCR zwiększa jego ekspresję powierzchniową i awidność funkcjonalną komórek T. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ i in. Zwiększona aktywność przeciwnowotworowa komórek T zaprojektowanych tak, aby wyrażały receptory komórek T z drugim wiązaniem dwusiarczkowym. Rak Res. 2007;67(8):3898–3903.