Markery podocytów w moczu w chorobach nerek

więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Lingfeng Zeng i inni

Abstrakcyjny

Podocyty odgrywają ważną rolę w utrzymaniu funkcji nerek i są głównym celem wielu osóbnerkachoroby. Uszkodzenie podocytów powoduje wydalanie do moczu fragmentów komórkowych pochodzących z podocytów i celów molekularnych specyficznych dla podocytów, które mogą służyć jako biomarkerynerkachoroby. Nienaruszone podocyty, żywe lub martwe, oraz mikropęcherzyki pochodzące z podocytów można było oznaczać ilościowo w moczu za pomocą różnych metod wirowania, wizualizacji i hodowli. Specyficzne dla podocytów cele białkowe z jądra, cytoplazmy, przepony szczelinowej, błony podstawnej naczyń włosowatych kłębuszków i cytoszkieletu, jak również odpowiadające im informacyjne RNA (mRNA) w moczu można oznaczyć ilościowo za pomocą western blotting, ELISA lub ilościowej polimerazy reakcja łańcuchowa. Chociaż niektóre z tych technik mogą być obecnie drogie lub pracochłonne, mogą stać się powszechnie dostępne w przyszłości ze względu na poprawę technologii i automatyzacji. Zastosowaniemoczowypodocytmarkery do diagnozowania i monitorowania różnychnerkachorobyzostał zbadany, ale opublikowane dane w tym obszarze nie są wystarczająco systematyczne i nie posiadają zewnętrznej walidacji. Dalsze badania powinny koncentrować się na standaryzacji, porównaniu i automatyzacji metod laboratoryjnych oraz określeniu ich wartości dodanej do rutynowych badań klinicznych.

Słowa kluczowe:Podocyt, Biomarker, mRNA, miRNA, Nefryna, Podocyna, Podokalyksyna, Synaptopodyna,Chronicznynerkachoroba

Łodyga Cistanche może leczyć przewlekłą chorobę nerek

1. Wstęp

1.1. Epidemiologia przewlekłej choroby nerek

Chronicznynerkachoroba(PChN) jest ważną i kosztowną chorobą niezakaźną [1]. Wraz z dostępnością terapii nerkozastępczej wydatki na opiekę zdrowotną przeznaczoną na leczenie PChN (Cchronicznynerkachoroba)gwałtownie wzrosła po latach 60. [2,3]. W 2015 roku na całym świecie było ponad 2,5 miliona pacjentów otrzymujących terapię nerkozastępczą, a przewiduje się, że do 2030 roku liczba ta podwoi się [4]. Skuteczne środki do diagnozowania, leczenia i monitorowanianerkachorobasą bardzo potrzebne.

1.2. Podocyt jako ognisko choroby nerek

Podstawową funkcją nerki jest wydalanie produktów przemiany materii i nadmiaru wody ustrojowej [5], co osiąga się poprzez trzy procesy: (1) filtrację krwi krążącej przez kłębuszki do ultrafiltracji w przestrzeni Bowmana; (2) selektywne wchłanianie zwrotne substancji użytecznych przez kanaliki nerkowe; oraz (3) selektywne wydzielanie innych produktów przemiany materii z naczyń włosowatych okołokanalikowych do płynu kanalikowego [6]

Chociaż nerka składa się z wielu typów komórek, które są ułożone w delikatną 3-wymiarową architekturę, podocyt odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania nerek i jest głównym celem wielunerkachoroby. Podocyty to wysoce specyficzne komórki ostatecznie zróżnicowane, które wraz z komórkami śródbłonka i błoną podstawną kłębuszków kapilarnych (GCBM) tworzą kłębuszkową barierę filtracyjną [7]. Podocyty mają obszerny korpus komórkowy, który jest oddzielony od GCBM przestrzenią subpodocytów [8]. Ciało komórki daje początek długim wyrostkom pierwotnym, które rozciągają się w kierunku GCBM i są przyczepione do tego ostatniego przez szeroki wachlarz wyrostków stóp [8].

Podocyty pełnią kilka funkcji fizjologicznych. Utrzymują morfologię kłębuszkowej pętli naczyniowej, regulują filtrację kłębuszkową, uczestniczą w miejscowej odpowiedzi immunologicznej i zapalnej. Ponadto podocyty są częściowo odpowiedzialne za syntezę i obrót GCBM [9], a także produkcję czynników parakrynnych, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który ma znaczenie w regulacji przepuszczalności i proliferacji komórek śródbłonka [10]. Dysfunkcja podocytów odgrywa kluczową rolę w patogenezie i progresji wielunerkachoroby. Mutacje różnych genów związanych z podocytami powodują:nerkachoroby, które zazwyczaj przedstawiają się klinicznie jako oporny na steroidy zespół nerczycowy, a histologicznie jako ogniskowe stwardnienie kłębuszków nerkowych (FGS). Z drugiej strony, nabyte dysfunkcje podocytów, w tym zmniejszenie liczby lub gęstości podocytów i zespolenie wyrostków stopy podocytowej, prowadzą poprzez różne mechanizmy do wtórnego uszkodzenia śródbłonka i GCBM, utraty ładunku ujemnego GCBM, nieprawidłowości w białku błony rozworu przełykowego, a w końcu białkomoczu [ 11,12].

Charakterystyczną konsekwencją uszkodzenia podocytów jest osłabienie oddziaływania z GCBM, które skumulowało się w oderwaniu podocytów od GCBM. Ponieważ podocyty mają ograniczoną zdolność regeneracji i kompensacji czynnościowej, pozostałe podocyty nie są w stanie utrzymać funkcji mechanicznej i bariery ładunkowej GCBM, co uległoby nieodwracalnemu uszkodzeniu, a efektem końcowym jest białkomocz [13]. W zależności od ciężkości urazu uszkodzenie podocytów może prowadzić do utraty wyrostków stóp, tworzenia wakuoli i pseudotorbieli, odróżnicowania i apoptozy. Sąsiednie struktury zostaną następnie zaatakowane, w tym proliferacja komórek nabłonka ciemieniowego, kurczenie się GCBM, utrata tuchu kapilar kłębuszkowych i ostatecznie stwardnienie kłębuszków nerkowych [14].

1.3. Metoda przeglądu literatury

Przeprowadziliśmy przegląd literatury z wyszukiwanymi terminami, w tym „podocyt”, „cząsteczki związane z podocytami” lub „biomarker” wraz z „chronicznynerkachoroba", "ostre uszkodzenie nerek„, „kłębuszkowe zapalenie nerek”, „nefropatia cukrzycowa” lub „cukrzyca”nerkachoroba”, wykorzystano do przeszukania odpowiedniej literatury z Medline, Embase i Cochrane Library. Odniesienia do odpowiednich publikacji zostały przeanalizowane pod kątem dodatkowych potencjalnych artykułów. Kwalifikujące się badania obejmowały badania na ludziach i zwierzętach opublikowane przed lipcem 2020 r. Publikacje o nieistotnych tematach, takie jak biologia komórek podocytów, Wykluczono fizjologię błony i manipulację molekularną podocytów.

1.4. Cele specyficzne dla podocytów jako biomarkery

Uszkodzenie podocytów prowadzi do zrzucania różnych cząsteczek pochodzących z podocytów do przestrzeni moczowej i może służyć jako biomarkernerkachoroby(rys. 1). Ciała komórek podocytów można podzielić na trzy anatomicznie i funkcjonalnie odrębne przedziały: część podstawową, część górną i część z przesłoną (SD) [15]. W każdej części obecne są specyficzne białka błony komórkowej, a ich interakcja z układem cytoplazmatycznym cytoszkieletu odpowiada za stabilność struktury i funkcji podocytów [16]. Główne cząsteczki pochodzące z podocytów, które są potencjalnymi celami rozwoju biomarkerów, podsumowano w Tabeli 1.

Ryc. 1. Uszkodzenie podocytów i potencjalne markery podocytów w moczu. Uszkodzenie podocytów skutkuje 3 powiązanymi ze sobą procesami patologicznymi: zmianą morfologiczną, apoptozą i odwarstwieniem. Podocyty mogą pozostać żywotne, ale objawiać się zmianami morfologicznymi, które mają dalsze konsekwencje funkcjonalne, takie jak białkomocz i zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe. Apoptoza podocytów może rozwinąć się w wyniku skumulowanych zmian morfologicznych lub bezpośrednio w wyniku określonych urazów. Utrata podocytów w kłębuszkach (tj. podocytopenia) prowadzi do zmian architektonicznych w kłębuszkowej pętli włośniczkowej i skutkuje stwardnieniem kłębuszków nerkowych. Podocyty, apoptotyczne lub żywotne z powodu utraty 3 1 integryny, mogą odrywać się od przestrzeni moczowej, być identyfikowane w moczu i służyć jako markerynerkachoroba. Pęcherzyki, mikrocząstki lub cząsteczki specyficzne dla podocytów pochodzące z uszkodzonych lub apoptotycznych podocytów mogą być również wykrywane w moczu i służyć jako biomarkery. (GCBM, błona podstawna naczyń włosowatych kłębuszków; AgII, angiotensyna II; TGF- , transformujący czynnik wzrostu beta; ROS, reaktywne formy tlenu).

1.5. Cele jądrowe i cytoplazmatyczne

Gen supresorowy guza Wilmsa-1 (WT1) jest podobnym do palca cynkowego czynnikiem transkrypcyjnym w jądrze podocytowym i jest prawdopodobnie najczęściej używanym markerem specyficznym dla podocytów w badaniach histologicznych [17]. Gen WT1 składa się z 10 eksonów, z których eksony od 7 do 10 kodują 4 palce cynkowe domeny wiążącej DNA. WT1 ulega swoistej ekspresji w podocytach i prawdopodobnie reguluje ekspresję nefryny [18]. Heterozygotyczne mutacje w eksonach 8 i 9 genu WT1 prowadzą do zespołu Denysa-Drasha, który objawia się zespołem nerczycowym, pseudohermafrodytyzmem męskim i guzem Wilmsa [19].

Inne białka jądrowe i cytoplazmatyczne podocytów są słabiej zbadane jako biomarkery. Kinaza zawierająca domenę aarF-4 (ADCK4) jest specyficznie obecna w mitochondriach w obrębie wyrostków stóp szczurzych podocytów [20]. ADCK4 odpowiada za stabilizację kompleksu CoQ i jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania homeostazy podocytów [20]. Ablacja ADCK4 specyficzna dla podocytów u myszy skutkuje zatarciem wyrostka racicowego, dezorganizacją szczeliny filtracyjnej, powiększeniem i dysfunkcją mitochondriów oraz zmniejszeniem CoQ10 [21], a leczenie przywróci CoQ10, funkcję mitochondriów, poprawioną morfologię podocytów i zapobiegnie zatarciu wyrostka łokciowego [21] ,22].

1.6. Kompleks białek szczelinowo-przeponowych

Składniki białkowe błony szczelinowej podocytów zostały szeroko przebadane jako biomarkerynerkachoroby. Główne białka w tej grupie to nefryna, podocyna, białko związane z CD2- (CD2AP) i podoplanina [23]. Nefryna jest białkiem transbłonowym z domenami zewnątrzkomórkowymi, które tworzą rdzeń przepony szczelinowej. Działa zarówno jako fizyczna bariera sitowa, jak i rusztowanie sygnalizacyjne [24]. Mutacje genu nefryny były pierwszą zgłoszoną przyczyną wrodzonego zespołu nerczycowego u ludzi [25]. Podocin i CD2AP są odpowiedzialne za połączenie nefryny z cytoszkieletem aktynowym pod błoną komórkową. Podocin jest białkiem podobnym do szpilki do włosów z rodziny stomatin i jest eksprymowany wyłącznie w podocytach [26]. Jest kodowany przez gen NPHS2, który składa się z ośmiu eksonów i znajduje się w regionie chromosomu 1q25-q31 [27]. Mutacje genu NPHS2 powodują autosomalny recesywny zespół nerczycowy oporności na steroidy zarówno u dzieci, jak iu dorosłych [27,28]. CD2AP jest cząsteczką rusztowania, która bezpośrednio oddziałuje z aktyną nitkowatą i innymi białkami błony komórkowej i bierze udział w dynamicznej przebudowie aktyny i przemieszczaniu się przez błonę [29]. Podoplanina to niewielka glikoproteina transbłonowa z dużą liczbą łańcuchów O-glikozydowych. Selektywna utrata podoplaniny w podocytach prowadzi do białkomoczu, a następnie zmian w morfologii podocytów w szczurzym modelu spontanicznego białkomoczu [30].

Cistance jest dobry na nerki

1.7. Cele powiązane z GCBM

Głównymi składnikami białkowymi regionu podstawnego podocytów są integryna 3 1 i -dystroglikan ( -DG). Białka te zakotwiczają podocyty w GCBM i odgrywają ważną rolę w utrzymaniu prawidłowego położenia podocytów oraz integralności błony filtracyjnej [31,32]. Integryna 3 1 jest białkiem transbłonowym z domeną zewnątrzkomórkową połączoną z domeną podobną do lamininy G (LG) lamininy 521 w GCBM, podczas gdy jej region cytoplazmatyczny jest połączony z cytoszkieletem podocytu przez -aktyninę{{ 9}}. Glikozylowane białko -DG jest połączone z cytoszkieletem poprzez utrofinę oraz z podocytem i GCBM poprzez oddziaływanie z lamininą 521.

1.8. Cele na górnej membranie

Podokaliksyna jest głównym białkiem transbłonowym po stronie wierzchołkowej podocytu. Jest to ujemnie naładowane białko kwasu sialowego, które przyczynia się do tworzenia bariery ładunkowej filtracji kłębuszkowej [33]. Podokalyksyna spełnia trzy funkcje: (1) zapobiega przedostawaniu się ujemnie naładowanego białka do moczu; (2) utrzymanie separacji sąsiednich podocytów; oraz (3) zapobieganie adhezji między komórkami nabłonka i pętlami naczyń włosowatych [34]. Podokaliksyna jest połączona z cytoszkieletem aktynowym przez ezrynę i czynnik regulacyjny wymiany sodowo-protonowej 2 (NHERF2).

1.9. Cele związane z aktyną

Szereg białek specyficznych dla podocytów jest połączonych z cytoszkieletem aktynowym i utrzymuje 3-wymiarową strukturę podocytu. Najlepiej zbadanymi celami tej grupy są synaptopodyna i -aktynina-4. Obydwa wiążą się ze szkieletem aktynowym poprzez interakcję z kinazą guanylanową związaną z błoną o odwróconej orientacji-1 (MAGI-1) [35]. Synaptopodyna jest bogatym w prolinę białkiem liniowym, kodowanym przez gen SYNPO [36] i ulega ekspresji w różnicujących się podocytach, gdy rozwijają się wyrostki stóp. W rezultacie synaptopodynę uważa się za marker dojrzałych podocytów [37].

2. Metody nauki

2.1. Wewnątrzkłębuszkowe markery podocytów

Chociaż celem tej recenzji jestmoczowypodocytmarkerów, logiczne jest krótkie omówienie wykrywania tych markerów w tkance nerki. Deplecja podocytów może być bezwzględna (utrata podocytów) lub względna (zmniejszona liczba podocytów na objętość kłębuszka) [38]. Złotym standardem metody oznaczania ilościowego podocytów w nerkach są metody stereologiczne (mikroskopy świetlne lub elektronowe, konfokalne mikroskopy skaningowe, ultradźwięki, tomografia komputerowa czy rezonans magnetyczny) [39]. Wszystkie są jednak czasochłonne i pracochłonne. Ostatnio Venkatareddy i in. ocenili metodę oceny gęstości podocytów za pomocą pojedynczych zatopionych w parafinie skrawków utrwalonych w formalinie, w których jądra podocytów uwidoczniono metodą immunofluorescencji pośredniej z przeciwciałami przeciw WT1 lub transducynopodobnym wzmacniaczem rozszczepienia [40]. Kolejne badanie wykazało, że metoda ta zapewniła dokładną liczbę podocytów w transgenicznym mysim modelu selektywnej deplecji podocytów, potwierdzając, że podejście to stanowi wydajne narzędzie ilościowe do analizy deplecji podocytów w całym kłębku nerkowym [41]. Niemniej jednak ta metoda nadal wymaga biopsji nerki i dlatego nie nadaje się do seryjnego monitorowania.

2.2. Ocena ilościowa i hodowla podocytów w moczu

Ponieważ podocyty są utrwalane w swojej fizjologicznej pozycji jedynie przez wyrostki stóp, są podatne na utratę jako żywotne komórki w moczu [42]. W rzeczywistości nienaruszone podocyty są wykrywalne w moczu zdrowych osób i pacjentów z:nerkachoroby[43], a utrata moczu jest prawdopodobnie głównym mechanizmem deplecji podocytów podczas progresji PChN(Cchronicznynerkachoroba)[42]. Tradycyjna metoda identyfikacji podocytów w moczu obejmuje techniki cytospinowe i badanie immunofluorescencyjne ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko podokaliksynom [44], dla których automatyzacja jest częściowo możliwa. Technika ta ma jednak ograniczoną czułość i swoistość ze względu na zanieczyszczenie szczątków komórkowych w osadzie moczu.

Alternatywnie, podocyty można zidentyfikować przez wykrycie peptydów trypsynowych specyficznych dla podocytów za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Chociaż koszt sprzętu tej techniki jest wysoki, ma ona tę zaletę, że jest niezależna od operatora i wysoce powtarzalna [45] i prawdopodobnie będzie miała coraz większe zastosowanie w klinicznej praktyce laboratoryjnej.

Wcześniejsze badania wykazały, że przy zastosowaniu techniki cytospinowej immunofluorescencji zdrowe osoby wydalają mniej niż 0,5 podocytów/mg kreatyniny, podczas gdy pacjenci z aktywną chorobą kłębuszków nerkowych wydalają do 400 podocytów/mg kreatyniny [43]. Wiekszosc zmoczowypodocytysą żywotne, gdy są testowane z wykluczeniem jodku propidyny i barwieniem TUNEL [43]. Teoretycznie hodowla żywotnych podocytów ex vivo poprawiłaby zatem specyficzność identyfikacji podocytów poprzez usunięcie martwych i niespecyficznych komórek. Jednak podocyty normalnie nie proliferują in vivo, a ich hodowla ex vivo wymaga specjalnych warunków doświadczalnych [46]. Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że podocyty można najpierw hodować w warunkach sprzyjających wzrostowi, w których unieśmiertelnione podocyty replikują się [46]. Pożywka do hodowli komórkowej do tego celu składa się na ogół z Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 lub pożywki Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco, z 10% płodową surowicą bydlęcą uzupełnioną 20-100 U/ml mysiego interferonu gamma (INF- ) oraz szalki hodowlane są zwykle pokryte kolagenem typu I w celu promowania proliferacji podocytów [46]. Metoda ta ma wielką wartość w badaniach translacyjnych i identyfikacji celów terapeutycznych, ale jest zbyt skomplikowana do rutynowego stosowania klinicznego.

Cistanche może poprawić czynność nerek

2.3. Fragmenty pochodzące z podocytów w moczu

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to kuliste ciała błoniaste uwalniane przez różne typy komórek [47]. W układzie moczowym EV zawierające błonę wierzchołkową i płyn wewnątrzkomórkowy są wydalane do moczu ze wszystkich segmentów nefronu, w tym z podocytów, komórek nabłonka kanalików nerkowych i komórek nabłonka dróg moczowych. Urinary EV zawierają białkowe markery dysfunkcji i strukturalnego uszkodzenia nerek. Ostatnie badania sugerują ponadto, że pojazdy elektryczne mogą mieć znaczenie dla komunikacji międzykomórkowej [48]. Ponadto wcześniejsze badania wykazały również, że fragmenty wierzchołkowych błon komórkowych są wydalane z uszkodzonych podocytów do moczu [49] i można je zidentyfikować jako podokaliksynowe struktury ziarniste dodatnie (PPGS) za pomocą mikroskopii elektronowej [49]. W modelach myszy cukrzycowych egzosomy moczu z podocytów można było wyizolować przez seryjne wirowanie, a mikrocząstki można oznaczyć ilościowo metodą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciała przeciwko aneksynie V (które wykrywa wszystkie mikrocząstki), a następnie przeciwciała przeciwko podokalyksynie lub podoplaninie (które specyficznie identyfikują mikrocząstki pochodzące z podocytów) [50,51]. Dodatkowa analiza rozpraszania światła może być wykorzystana do dalszego określenia wielkości mikrocząstek [52]. Dzięki tym wyrafinowanym technikom wykazano, że ilość mikrocząsteczek pochodzących z podocytów jest zwiększona u myszy po ekspozycji na wysoki poziom glukozy [51], a także u myszy z cukrzycą przed wystąpieniem albuminurii [52]. W pierwszym przypadku nieprawidłowość była tłumiona przez inhibitor kinazy Rho, co wskazuje, że reorganizacja cytoszkieletu jest głównym wyzwalaczem uwalniania mikrocząstek [51]. Jednak zastosowanie tych technik u ludzinerkachorobanie został zbadany.

Zamiast mierzyć liczbę i rozmiar EV i mikrocząsteczek pochodzących z podocytów w moczu, ostatnio rośnie zainteresowanie pomiarem cząsteczek specyficznych dla podocytów w egzosomach moczu. Na przykład, jako potencjalnego kandydata do oceny uszkodzeń podocytów zaproponowano czynniki transdukcji sygnału pochodzącego z podocytów (PDSTF) w moczu EV [52]. Jednak ich zastosowania kliniczne pozostają w fazie rozwoju.

2.4. Docelowe białka specyficzne dla podocytów w moczu

Stężenie w moczu kilku docelowych białek specyficznych dla podocytów jest łatwo mierzone, a ich rola jako biomarkerównerkachorobazostał zbadany. Stężenie podokalyksyny w moczu można mierzyć za pomocą immunofluorescencji pośredniej, ELISA lub cytometrii przepływowej [53] i została zaproponowana jako markermoczowypodocytliczyć. Wcześniejsze badania wykazały jednak, że podokalyksyna w moczu pochodzi głównie z błony szczytowej uszkodzonych podocytów, a nie z nienaruszonych rozdrobnionych do moczu, a jej poziom wzrasta we wczesnym uszkodzeniu nerek [49]. Podokaliksynę i nefrynę, inny ważny cel białkowy specyficzny dla podocytów w moczu, nie są wykrywalne w moczu zdrowych ludzi metodą tradycyjnego Western blotting [54], ale są wykrywalne za pomocą konwencjonalnego testu ELISA u pacjentów ze stanem przedrzucawkowym [55]. Ponadto poziom nefryny w moczu koreluje z nasileniem białkomoczu [56] i czynnością nerek [57]. Można również zmierzyć stężenie nefryny w osoczu [57], ale nie ustalono jego znaczenia biologicznego ani klinicznego. Głównym problemem stosowania w moczu poziomów docelowych białek specyficznych dla podocytów jako biomarkera klinicznego jest niskie stężenie (zwykle w zakresie ng/ml) i mylący efekt rozcieńczania stężenia w moczu.

2.5. mRNA specyficzne dla podocytów w moczu

PomiarmoczowypodocytJako alternatywną metodę oznaczania liczby podocytów w moczu zaproponowano swoisty poziom mRNA. Ilość mRNA specyficznego dla podocytów w moczu zwykle nie jest wystarczająca do tradycyjnego badania Northern blot, ale można ją łatwo zmierzyć za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-QPCR). Dwa poprzednie badania wykazały, że poziom mRNA nefryny w moczu miał ścisłą korelację z liczbą podocytów w moczu [56,58]. W mysim modelu przeciwkłębuszkowej choroby błony podstawnej z seryjną biopsją nerki,moczowypodocytswoiste poziomy mRNA korelowały z szybkością kłębuszkowej utraty podocytów [52].

Ostatnie badania przesunęły jednak uwagę na pochodne mRNA w moczu jako markery zastępcze stresu podocytów lub względnego uszkodzenia podocytów. W modelu szczurzym postępująca choroba kłębuszków nerkowych była związana ze zmniejszeniem stężenia nefryny w porównaniu z poziomem mRNA podocyny, a stosunek mRNA podocyny do mRNA nefryny korelował z nasileniem progresji histologicznej [59]. W kolejnym badaniu wykazano, że średnie ciśnienie tętnicze zdrowych osób koreluje ze stosunkiem mRNA podocyny do kreatyniny w moczu (marker oderwania podocytów), stosunkiem mRNA podocyny do nefryny (marker stresu podocytów) i podocyny w moczu stosunek mRNA do akwaporyny-2 (wskaźnik względnego uszkodzenia podocytów w porównaniu z uszkodzeniem kanalików) [60]. Uszkodzenie kłębuszków jest szczególnie związane ze zwiększonym stosunkiem mRNA podocyny do akwaporyny-2 i nefryny do akwaporyny-2 w moczu [61].

2.6. Markery miRNA w moczu specyficzne dla podocytów

Mikro-RNA (miRNA) to krótkie niekodujące RNA, które regulują wiele szlaków biologicznych poprzez celowanie w określone mRNA [62]. Podobnie jak mRNA, miRNA w moczu jest łatwo oznaczane ilościowo za pomocą RT-qPCR [63]. Z punktu widzenia rozwoju biomarkerów miRNA ma tę zaletę, że jest odporny na degradację, co ułatwia jego kliniczne zastosowanie, a także badanie próbek archiwalnych [63]. Szereg specyficznych zmian miRNA zaobserwowano wnerkachoroby[9]. Na przykład stwierdzono, że specyficzna dla podocytów utrata funkcjonalnych miRNA, w tym miR-23b, miR-24 i miR-26a, powoduje szybkie uszkodzenie kłębuszków i kanalików nerkowych [64]. W szczególności miR-27b reguluje przeżycie podocytów poprzez celowanie w receptor adenozyny 2B [65]. Podobnie, poziomy miR-21, miR-124 i miR-192 w moczu korelują z nasileniem dysfunkcji nerek (albuminuria i szacowany GFR) imoczowypodocytmarkerów (nefryna, synaptopodyna i podokaliksyna) u chorych na cukrzycę [66]. Ostatnie badania dodatkowo zidentyfikowały specyficzne ścieżki downstream dla kilku miRNA, które mogą być istotne dla patogenezy lub progresjinerkachoroby. Warto zauważyć, że miR-193a hamuje ekspresję WT- 1, co wpływa na różnicowanie podocytów [67] i może odgrywać rolę w patogenezie choroby kłębuszków nerkowych [68]. Z drugiej strony miR-21 hamuje ekspresję tkankowego inhibitora metaloproteinazy 3 (TIMP3) [69,70], miR-26a hamuje transformujący czynnik wzrostu beta-1 (TGF{{ 11}}) ekspresja [71,72], miR-23b celuje w białko 2 wiążące domenę SH3 białka aktywującego GTPazę Ras (G3BP2) [73], miR-29c celuje w homolog 1 Sprouty (Spry1 ) [74]; z których wszystkie biorą udział w progresji nefropatii cukrzycowej.

Cistanche dla poprawy funkcji nerek

Jednak podocyty przyczyniają się tylko do niewielkiej części miRNA w moczu. Wszelkie specyficzne zmiany miRNA obserwowane w podocytach mogą nie być łatwo dostrzegalne w moczu, podczas gdy wszelkie zmiany w poziomach miRNA w moczu mogą odzwierciedlać zmiany patologiczne w innych typach komórek nerkowych [75, 76]. Na przykład, chociaż poziomy miR-155, miR-663 i miR-1915 w moczu znacznie różnią się między pacjentami z FGS lub nefropatią z minimalnymi zmianami (MCN) a osobami zdrowymi [77], nie wykazano, aby miR-155, miR-663 lub miR-1915 pochodziły konkretnie z podocytów. Znaczące korelacje między wieloma poziomami miRNA a markerami uszkodzenia kanalików, w tym poziomy N-acetylo- -D-glukozaminidazy (NAG) i cząsteczki uszkodzenia nerek -1 (KIM-1) w moczu [66], zostały również zgłoszone. Innymi słowy, trudno jest potwierdzić ich specyficzność jako markerów uszkodzenia podocytów. Godnym uwagi wyjątkiem od tej reguły jest miR-26a. Niedawne badanie wykazało, że poziomy miR-26a w egzosomach w moczu były znacznie wyższe w toczniowym zapaleniu nerek niż w zdrowej kontroli, miR-26a był najliczniej wyrażanym miRNA w kłębuszkach normalnych myszy C57BL/6 i miR-26a był odpowiedzialny za regulację różnicowania podocytów i integralności cytoszkieletu [78]. Niemniej jednak rola miR-26a w moczu jako markera specyficznego dla podocytów wymaga walidacji.

2.7. Krążące markery podocytów

Wiele z wyżej wymienionych markerów podocytowych, w szczególności cele białkowe specyficzne dla podocytów i mRNA, można mierzyć w krążeniu ogólnoustrojowym [56,79,80], a ich poziomy w osoczu jako biomarkernerkachorobyzostały zbadane [55,81–84]. Jednak pełna dyskusja na ten temat wykracza poza zakres tego przeglądu. Kluczowe zalety i wady powyższych metodologii podsumowano w tabeli 2.

3. Markery podocytów w moczu w określonych chorobach nerek

3.1. Cukrzycowa choroba nerek

Cukrzycowynerkachoroba(DKD) jest najczęstszą przyczyną PChN(Cchronicznynerkachoroba)na całym świecie i istnieje bogata literatura na temat wykorzystania różnychmoczowypodocytmarkery do diagnozowania i monitorowania DKD. Na przykład Jim i wsp. [14] stwierdzili, że poziomy nefryny w moczu były wykrywalne u wszystkich pacjentów z DKD z albuminurią, ale tylko 54% u osób bez albuminurii. Stężenie nefryny w moczu korelowało z poziomem albuminurii i odwrotnie z czynnością nerek [14]. Ma i wsp. stwierdzili, że poziom angiopoetyny -4 (Angptl4) w moczu był podwyższony w DKD [85]. Poziom podokalyksyny w moczu był podwyższony u pacjentów z cukrzycą przed wystąpieniem mikroalbuminurii i był prawdopodobnie bardziej czuły niż mikroalbuminuria we wczesnym wykrywaniu DKD [86]. W rozpoznanej CKD poziom podokalyksyny w moczu korelował dodatnio z poziomem HbA1c i stosunkiem albuminy do kreatyniny [87,88]. Podsumowując, dostępne wyniki wskazują, że poziomy w moczu kilku docelowych specyficznych dla podocytów są wczesnymi wskaźnikami DKD, a poziom podokaliksyny w moczu jest najbardziej obiecującym wskaźnikiem pod tym względem [54].

Zbadano również poziomy celu specyficznego dla podocytów w poszczególnych składnikach moczu.MoczowypodocytPoziomy mikrocząstek, określone za pomocą cytometrii przepływowej, były wyższe w cukrzycy typu 1 niż u osób zdrowych, a poziom ten wzrastał wraz z klamrą hiperglikemiczną [89]. Poziomy WT w egzosomach -1 w moczu korelowały z nasileniem białkomoczu, czynnością nerek, uszkodzeniem kłębuszków nerkowych i szybkością pogorszenia czynności nerek u pacjentów z cukrzycą [58,90]. W innym badaniu poziomy kinazy syntazy glikogenu (GSK)3 w złuszczanych komórkach moczu były dokładniejsze niż albuminuria w różnicowaniu pacjentów z cukrzycą z postępującą niewydolnością nerek i bez niej [91]. Jednak metodologia tego testu jest kłopotliwa i może nie mieć zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej.

Jeśli chodzi o markery mRNA specyficzne dla podocytów w moczu, poprzednie badanie wykazało, że poziomy mRNA nefryny, podocyny, synaptopodyny, WT-1 i -aktyny-4 w moczu były wyższe u pacjentów z DKD niż u osób zdrowych [92]. Wystąpiła istotna różnica w poziomach mRNA nefryny, podocyny, -aktyniny-4 i białka związanego z CD2- w moczu u pacjentów z cukrzycą z różnym nasileniem albuminurii [93]. Poziomy mRNA w moczu nefryny, podocyny, synaptopodyny, WT-1 i -aktyny-4 również korelowały zmoczowypodocytstężenie nefryny w moczu, albuminuria i nasilenie niewydolności nerek [93]. Niedawno stwierdzono, że poziomy mRNA specyficzne dla podocytów w moczu poprzedzają wystąpienie mikroalbuminurii u pacjentów z cukrzycą typu 2 [94], a stosunek mRNA podocyny do kreatyniny w moczu, markera odwarstwiania się podocytów, istotnie korelował z późniejszą częstością występowania pogorszenie funkcji nerek [94]. Ponadto poziom mRNA synaptopodyny w moczu był niższy po 12 tygodniach terapii skojarzonej inhibitorem konwertazy angiotensyny (ACE) i blokerem receptora angiotensyny (ARB) w porównaniu z monoterapią inhibitorem ACE [95]. Podsumowując, dostępne dowody sugerują, że pomiar poziomu mRNA specyficznego dla podocytów w moczu może być cenny dla stratyfikacji ryzyka i monitorowania odpowiedzi terapeutycznej w DKD.

3.2. Minimalna zmiana w nefropatii i ogniskowej stwardnieniu kłębuszków nerkowych

MCN i FGS są często uważane za choroby podocytów, a rolamoczowypodocytcele zostały przetestowane. Zhou i in. [96] stwierdzili, że poziom WT w egzosomach -1 w moczu, mierzony techniką immunoblottingu, był znacząco wyższy u pacjentów z FGS niż u osób z zespołem nerczycowym wrażliwym na steroidy (SSNS) lub zdrowych ochotników. Poziomy WT w egzosomach -1 w moczu znacząco zmniejszyły się po leczeniu kortykosteroidami i remisji FGS lub SSNS [96]. W innym badaniu poziom nefryny w moczu, mierzony konwencjonalnym testem ELISA, był znacznie wyższy u dorosłych z FGS niż w przypadku innych przyczyn zespołu nerczycowego [97].

Zbadano również poziomy mRNA specyficznego dla podocytów w moczu. Wczesne badanie wykazało, że poziomy mRNA nefryny i podocyny w moczu nie różniły się istotnie między pacjentami z MCN a zdrowymi ochotnikami, a ich poziomy były znacznie niższe niż u pacjentów z DKD [98]. Kolejne badanie wykazało, że poziomy mRNA nefryny i podocyny w moczu były niższe u pacjentów z MCN niż u osób z FGS lub osób zdrowych, a wielkość redukcji korelowała ze stopniem białkomoczu [99]. W tym badaniu stwierdzono, że poziomy mRNA synaptopodyny w moczu korelują z późniejszym stopniem pogorszenia czynności nerek u pacjentów z FGS [99], co sugeruje, że można zidentyfikować jakościową zmianę w podocytach FGS w moczu.

3.3. Nefropatia błoniasta

Chociaż główną zmianą patologiczną nefropatii błoniastej (MGN) jest odkładanie się kompleksu immunologicznego w przestrzeni podnabłonkowej, co skutkuje zmianą bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych, badania nadmoczowypodocytmarkery w MGN są rzadkie. Poziomy mRNA nefryny, podocyny i synaptopodyny w osadzie moczowym były znacząco podwyższone w MGN, ale poziomy te niezawodnie różnicowały MGN od innych przyczyn zespołu nerczycowego [98]. Niedawno Lu i wsp. [100] podali, że liczbamoczowypodocytPochodzące z tego mikrocząstki zmniejszyły się jednocześnie z poprawą parametrów klinicznych po leczeniu immunosupresyjnym, co sugeruje rolę w monitorowaniu MGN.

3.4. Nefropatia IgA

Chociaż nefropatia immunoglobuliny A (IgAN) jest przede wszystkim chorobą mezangialną, rolamoczowypodocytliczyć jako biomarker został zbadany. Warto zauważyć, że Shen i wsp. [101] stwierdzili, że pacjenci z IgAN wykazywali zwiększoną utratę podocytów w moczu, mniej podocytów w kłębuszkach i bardziej nasilone zespolenie wyrostków stóp w próbkach z biopsji nerki. W tym badaniu podocyty w moczu zidentyfikowano za pomocą pośredniego badania immunofluorescencyjnego podokalyksyny, amoczowypodocytliczba skorelowana z kreatyniną w surowicy i białkomoczem [101]. Kolejne badanie wykazało, że liczba podocytów w moczu u pacjentów z IgAN ze stwardnieniem odcinkowym była wyższa niż u osób bez stwardnienia odcinkowego [102]. Hara i wsp. [103] wykazali, że u dzieci z IgAN lub Henoch-Sch¨ online purpura nephritis, skumulowana utrata podocytów w moczu korelowała z nasileniem uszkodzenia histologicznego i stopniem stwardnienia kłębuszków nerkowych w biopsji nerki orazmoczowypodocytwydalanie miało szybką progresję histologiczną.

Badania nad cząsteczkami specyficznymi dla podocytów w moczu jako biomarkerami IgAN są fragmentaryczne i niekompletne. Stężenie podokalyksyny w moczu istotnie korelowało z nasileniem ostrych zmian pozawłośniczkowych u dorosłych IgAN [102]. Stwierdzono, że poziom mRNA podocyny w moczu odzwierciedla ciężkość aktywnego uszkodzenia kłębuszków nerkowych w biopsji nerki i dostarcza informacji prognostycznych komplementarnych do poziomu białkomoczu [104]. Ponieważ IgAN jest najczęstszym pierwotnym kłębuszkowym zapaleniem nerek na świecie, z pewnością potrzebne są dalsze badania w tym obszarze.

Oprócz IgAN rolamoczowypodocytmarkery zostały zbadane w innych mezangialnych glomerulopatiach. Na przykład,moczowypodocytutrata jest znacznie zwiększona zarówno w dziedzicznych, jak i nabytych postaciach rozlanego stwardnienia mezangialnego [102]. Niemniej jednak obszar ten jest gorzej zbadany, prawdopodobnie z powodu niejednorodności w jego klasyfikacji patologicznej.

3.5. Toczniowe zapalenie nerek

Moczowypodocytzrzucanie w zapaleniu nerek tocznia było studiowane. Poprzedni raport wykazał, że głównymoczowypodocytyu pacjentów z aktywnym toczniowym zapaleniem nerek były żywe, ale odróżnicowane, a odsetek apoptotycznych podocytów w moczu był znacznie niższy niż u zdrowych osób kontrolnych [105]. W tym badaniu poziomy podokalyksyny, synaptopodyny, podocyny, nefryny i WT-1 w moczu (mierzone metodą Western blotting) były znacząco podwyższone w toczniu układowym, zwłaszcza w aktywnym toczniowym zapaleniu nerek, a ich poziomy istotnie korelowały z nasileniem białkomoczu i aktywność histologiczną [105]. Kolejne badanie wykazało, że poziomy mRNA nefryny, podocyny i synaptopodyny w moczu były znacznie wyższe u pacjentów z aktywnym toczniowym zapaleniem nerek niż w toczniu spoczynkowym [106]. W szczególności, poziom mRNA nefryny w moczu korelował z białkomoczem i ogólnoustrojową aktywnością choroby, ale nie z klasą histologiczną toczniowego zapalenia nerek, podczas gdy poziom mRNA podocyny w moczu był niezależnym predyktorem późniejszego pogorszenia funkcji nerek [107].

3.6. Zapalenie naczyń związane z przeciwciałami przeciwko cytoplazmie neutrofili (ANCA)

Chociaż podocyty nie są głównym celem uszkodzenia nerek w kłębuszkowym zapaleniu nerek związanym z ANCA, gęstość podocytów wewnątrz kłębuszków jest charakterystycznie zmniejszona [108]. Zou i wsp. [108] stwierdzili, że wskaźnik odklejania się podocytów do moczu przewiduje następującą utratę funkcji nerek w kłębuszkowym zapaleniu nerek związanym z ANCA, a Minakawa i wsp. [109] stwierdzili, że stosunek podocyny do mRNA nefryny w moczu jest zastępczym markerem wewnątrzkłębuszkowego podocytu. stres, skorelowany z procentem tworzenia sierpów [109]. W tym ostatnim badaniu pacjenci z wysokim poziomemmoczowypodocytmRNA pochodzące z p-pochodnych wykazywało korzystny wynik nerkowy, przypuszczalnie z powodu lepszej rezerwy kłębuszkowej podocytów i możliwości odwracalności [109].

3.7. Inne PChN

Użytecznośćmoczowypodocytmarkery w konkretnychnerkachorobypodsumowano w Tabeli 3. Wiele markerów specyficznych dla podocytów w moczu zostało również zbadanych jako markery generyczne PChN(Cchronicznynerkachoroba). Na przykład,moczowypodocytMikropęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzenia pozakomórkowego, oceniane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, były istotnie zwiększone u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym z zaburzoną czynnością nerek niż u pacjentów bez zaburzonej czynności nerek [110]. Poziom synaptopodyny w moczu, określony metodą Western blot, korelował z czynnością nerek zarówno w przypadku PChN z cukrzycą, jak i bez cukrzycy(Cchronicznynerkachoroba), niezależnie od stopnia albuminurii, co sugeruje, że synaptopodyna moczu jest generycznym markerem uszkodzenia podocytów [110]. Spośród panelu celów mRNA specyficznych dla podocytów w moczu, poziom mRNA neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) w moczu wykazywał najlepszą korelację z cząsteczką uszkodzenia nerek w moczu-1 (KIM-1), która jest markerem generycznym uszkodzenia nerek [111]. W przypadku docelowych miRNA poziomy miR-21 w egzosomach w moczu były zwiększone w zwierzęcych modelach uszkodzenia podocytów, a także CKD(Cchronicznynerkachoroba)pacjentów [112], ale w tym badaniu nie określono pochodzenia komórkowego miR-21.

Należy jednak pamiętać, że nie wszystkienerkachorobymieć uszkodzenie podocytów. Wzrost wmoczowypodocytUtratę odnotowano w różnych chorobach kłębuszków nerkowych, ale nie w autosomalnie dominującej policystycenerkachoroba(ADPKD) [113]. Co ważniejsze, związek między podocyturią a białkomoczem różnił się znacznie między różnymi chorobami kłębuszków nerkowych, co sugeruje, żemoczowypodocytmarkery powinny być lepiej traktowane jako specyficzne dla choroby [113].

4. Wniosek

Uszkodzenie podocytów odgrywa ważną rolę w patogenezie i progresji wielunerkachoroby. Fragmenty komórkowe pochodzące z podocytów i specyficzne dla podocytów cele molekularne w moczu mają ogromny potencjał do opracowania jako biomarkery do diagnozowania i monitorowanianerkachoroby. Proces opracowywania biomarkerów obejmuje identyfikację określonych markerów, określenie metodyki pomiaru oraz decyzję o kontekście klinicznym aplikacji (ryc. 2). Wraz z postępem w zrozumieniu biologii podocytów i dostępności nowych technologii,moczowypodocytOczekuje się, że markery będą miały coraz szerszy zakres zastosowań, zarówno ze względu na identyfikację nowych celów, jak i opracowanie nowych metod ich ilościowego oznaczania. W zamian walidacja markerów podocytów w moczu może rzucić światło na nasze zrozumienie patofizjologiinerkachoroby. Istnieje wiele metod oznaczania ilościowego podocytów i różnych markerów specyficznych dla podocytów w moczu. W nadchodzącej dekadzie wysiłki badawcze powinny koncentrować się na standaryzacji, porównywaniu i automatyzacji metod laboratoryjnych, a także określaniu ich wartości dodanej do rutynowych testów klinicznych.

Ryc. 2. Aspekty, które należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu biomarkerów związanych z podocytami w moczu dlanerkachoroby. (GCBM, błona podstawna naczyń włosowatych kłębuszków; CKD,chronicznynerkachoroba; DKD, cukrzycanerkachoroba; FGS, ogniskowe stwardnienie kłębuszków nerkowych).

Deklaracja Konkurencyjnego Interesu

Autorzy deklarują, że nie znają sprzecznych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Potwierdzenie

To badanie zostało wsparte przez Fundusz Badań PD Chińskiego Uniwersytetu Richarda Yu w Hongkongu (CUHK) oraz konta badawcze CUHK 6905134 i 8601286. Fundatorzy nie brali udziału w projekcie badania, gromadzeniu i analizie danych, decyzji o publikacji ani przygotowaniu rękopisu. Autorzy nie zgłaszają innego konfliktu interesów. Wyniki przedstawione w tym artykule nie były wcześniej publikowane w całości ani w części.

Poprawa choroby nerek--Cistanche acteoside

Od: 'Markery podocytów w moczu wnerkachoroby' za pomocąLingfeng Zeng i inni

---Klinika Chimica Acta 523 (2021) 315–324