Szczepionki wywołują wysoce reaktywną krzyżową odporność komórkową na SARS-CoV-2 Wariant Omicron

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jinyan Liu1*, Abishek Chandrashekar1*, Daniel Sellers1*, Julia Barrett1, Michelle Lifton1, Katherine McMahan1, Michaela Sciacca1,

Haley VanWyk1, Cindy Wu1, Jingyou Yu1, Ai-ris Y. Collier1, Dan H. Barouch1,2*

1 Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA, USA;

2 Ragon Institute of MGH, MIT i Harvard, Cambridge, MA, USA

Wykazano, że wysoce zmutowany wariant SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) unika znacznej części odpowiedzi przeciwciał neutralizujących wywoływanych przez obecne szczepionki, które kodują immunogen WA1/2020 Spike1, co skutkuje zwiększoną liczbą infekcji i zmniejszona skuteczność szczepionki. Komórkowe odpowiedzi immunologiczne, w szczególności odpowiedzi CD8 plus komórek T, są prawdopodobnie kluczowe dla ochrony przed ciężką chorobą SARS-CoV-22-6. Tutaj pokazujemy, że odporność komórkowa indukowana przez obecne szczepionki SARS-CoV-2 jest wysoce reaktywna krzyżowo przeciwko wariantowi SARS-CoV-2 Omicron. Osoby, które otrzymały szczepionki Ad26.COV2.S lub BNT162b2 wykazały trwałe odpowiedzi limfocytów T CD8 plus i CD4 plus, które wykazywały rozległą reaktywność krzyżową przeciwko obu wariantom Delta i Omicron, w tym w subpopulacjach komórek pamięci centralnej i efektorowej. Mediana odpowiedzi limfocytów T CD8 plus swoistych dla Omikrona wynosiła 82-84 procent odpowiedzi limfocytów T CD8 plus dla WA1/2020-swoistych. Dane te sugerują, że obecne szczepionki mogą zapewniać znaczną ochronę przed ciężką chorobą z wariantem SARS-CoV-2 Omicron pomimo znacznego zmniejszenia odpowiedzi przeciwciał neutralizujących.

korzyści zdrowotne cistanche: poprawa odporności

Ostatnie badania wykazały, że przeciwciała neutralizujące (NAb) wywołane przez szczepionkę są znacznie zredukowane do wysoce zmutowanego wariantu SARS-CoV-2 Omicron, co skutkuje szybkim globalnym rozprzestrzenianiem się, w tym przełomowymi infekcjami u w pełni zaszczepionych osób1. Aby ocenić reaktywność krzyżową komórkowych odpowiedzi immunologicznych wywołanych przez szczepionkę przeciwko wariantowi SARS-CoV-2 Omicron, oceniliśmy odpowiedzi limfocytów T CD8 plus i CD4 plus u 51 osób, które zostały zaszczepione Ad26 opartym na wektorze adenowirusowym. Szczepionka COV2.S7 (Johnson & Johnson; N=20) lub szczepionka BNT162b2 oparta na mRNA8 (Pfizer; N=31).

Po szczepieniu BNT162b2 zaobserwowaliśmy wysokie odpowiedzi WA1/2020-specyficzne NAb w miesiącu 1, a następnie ostry spadek w miesiącu 8, jak oczekiwano9,10 (ryc. 1a). Po szczepieniu Ad26.COV2.S, w miesiącu 1 wystąpiły zasadniczo niższe odpowiedzi specyficzne dla WA1/2020-nab, ale odpowiedzi te były trwalsze i utrzymywały się w miesiącach 89,11 (ryc. 1a). Jednak w przypadku obu szczepionek zaobserwowano minimalne reaktywne krzyżowo NAb swoiste dla Omicron (ryc. 1a), co jest zgodne z ostatnimi danymi dotyczącymi braku dodatkowej dawki przypominającej1. Odpowiedzi przeciwciał swoiście wiążących domenę receptora (RBD) zostały ocenione za pomocą testu ELISA i wykazały podobne trendy, z minimalną reaktywnością krzyżową przeciwciał swoiście wiążących Omicron (ryc. 1b). Testy ELISPOT z połączonym peptydem IFN-g wykazały znaczną reaktywność krzyżową z Omicronem (Dane rozszerzone Fig. 1). Następnie oceniliśmy odpowiedzi limfocytów T CD8 plus i CD4 plus specyficzne wobec kolca za pomocą testów barwienia wewnątrzkomórkowych cytokin. Ad26.COV2.S indukował medianę odpowiedzi CD8 swoistych dla pików IFN-g plus komórek T wynoszącą 0.061 procent, 0.062 procent i {{ 72}}.051 procent przeciw odpowiednio WA1/2020, Delta i Omicron, w 8. miesiącu po szczepieniu (ryc. 2a). BNT162b2 indukował medianę odpowiedzi IFN-g CD8 plus limfocytów T, swoistych wobec piku, wynoszącą 00,028 procent i 0,023 procent odpowiednio wobec WA1/2020 i Omicron w 8 miesiącu po szczepieniu (ryc. 2a). Dane te sugerują, że specyficzne dla Omikronu odpowiedzi komórek T CD8 plus były 82-84procentem reaktywności krzyżowej z odpowiedziami komórek T specyficznymi dla WA1/{2020-CD8 plus. Swoiste wobec skoku odpowiedzi IFN-g CD4 plus limfocyty T wywołane przez Ad26.COV2.S wyniosły medianę 0,026 procent, 0,030 procent i 0,029 procent odpowiednio w stosunku do WA1/2020, Delta i Omicron, a dla BNT162b2 była to mediana 0,033 procent i 0,027 procent odpowiednio w stosunku do WA1/2020 i Omicron, co wskazuje również na znaczną krzyżową reaktywność odpowiedzi komórek T CD4 plus (ryc. 2b). Istotną reaktywność krzyżową Omicron zaobserwowano również dla odpowiedzi limfocytów T CD8 plus i CD4 plus wydzielających TNF-α i IL-2 swoistych dla piku (Dane rozszerzone Fig. 2).

Analiza regresji liniowej wykazała, że ​​swoiste dla Omikronu odpowiedzi limfocytów T CD8 plus były skorelowane ze specyficznymi dla WA1/2020- odpowiedziami limfocytów T CD8 plus dla szczepionki Ad26.COV2.S dla obu punktów czasowych (R=0.78, P<0.0001, slope="" 0.75)="" and="" the="" bnt162b2="" vaccine="" (r="0.56,"><0.0001, slope="" 0.81),="" although="" two="" individuals="" had="" undetectable="" omicron-specific="" cd8+="" t="" cell="" responses="" following="" bnt162b2="" vaccination="" (fig.="" 3a).="" similarly,="" omicron-specific="" cd4+="" t="" cell="" responses="" correlated="" with="" wa1/2020-specific="" cd4+="" t="" cell="" responses="" for="" both="" the="" ad26.cov2.s="" vaccine="" (r="0.79,"><0.0001, slope="" 0.83)="" and="" the="" bnt162b2="" vaccine="" (r="0.90,"><0.0001, slope="" 0.88)="" (fig.3b).="" spike-specific="" ifn-g="" cd8+="" and="" cd4+="" t="" cell="" central="" memory="" and="" effector="" memory="" subpopulations="" elicited="" by="" ad26.cov2.s="" also="" showed="" extensive="" cross-reactivity="" to="" delta="" and="" omicron.="" at="" month="" 8,="" cd8+="" central="" memory="" responses="" were="" 0.076%,="" 0.054%,="" and="" 0.075%,="" cd8+="" effector="" memory="" responses="" were="" 0.168%,="" 0.143%,="" and="" 0.146%,="" cd4+="" central="" memory="" responses="" were="" 0.030%,="" 0.035%,="" and="" 0.038%,="" and="" cd4+="" effector="" memory="" responses="" were="" 0.102%,="" 0.094%,="" and="" 0.083%,="" against="" wa1/202,="" delta,="" and="" omicron,="" respectively="" (fig.="">

Nasze dane pokazują, że Ad26.COV2.S i BNT162b2 wywołują szeroko reaktywną krzyżową odporność komórkową przeciwko wariantom SARS-CoV-2, w tym Omicron. Spójność tych obserwacji w dwóch różnych technologiach platform szczepionkowych (wektor wirusowy i mRNA) sugeruje możliwość uogólnienia tych odkryć. Rozległa reaktywność krzyżowa swoistych dla Omikronu odpowiedzi limfocytów T CD8 plus i CD4 plus ostro kontrastuje ze znacznie zredukowanymi odpowiedziami przeciwciał neutralizujących i wiążących swoistych dla Omikronu. Dane te są zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi większą reaktywność krzyżową komórkowych odpowiedzi immunologicznych wywołanych szczepionką w porównaniu z humoralną odpowiedzią immunologiczną przeciwko wariantom SARS-CoV-2 alfa, beta i gamma12. Procentowy 82-84 procent reaktywności krzyżowej odpowiedzi limfocytów T CD8 plus na Omicron jest zgodny z przewidywaniami teoretycznymi opartymi na mutacjach Omicron6.

Badania przedkliniczne wykazały, że limfocyty T CD8 plus przyczyniają się do ochrony przed SARS-CoV-2 u makaków rezus, szczególnie gdy odpowiedź przeciwciał jest suboptymalna5. Zgłaszano również trwałe odpowiedzi komórek T CD8 plus i CD4 plus po zakażeniu i szczepieniu2- 4,6,9,11,13,14. Biorąc pod uwagę rolę limfocytów T CD8 plus w usuwaniu infekcji wirusowych, prawdopodobne jest, że odporność komórkowa znacząco przyczynia się do ochrony szczepionki przed ciężką chorobą SARS-CoV-2. Może to być szczególnie istotne w przypadku Omicron, który unika znacznej części odpowiedzi przeciwciał. Nasze dane sugerują, że obecne szczepionki mogą zapewniać znaczną ochronę przed ciężką chorobą wywołaną wariantem SARS-CoV-2 Omicron pomimo zmniejszonej odpowiedzi przeciwciał neutralizujących i zwiększonej liczby zakażeń przełomowych.

proszek cistanche

Metody

Badana populacja

Próbki od osób, które otrzymały szczepionkę BNT162b2 uzyskano z biorepozytorium próbek Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC). Próbki od osób, które otrzymały Ad26.COV2.S, uzyskano z badania COV1001 (NCT04436276). Oba badania zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną BIDMC. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę. Z tego badania wykluczono osoby, które miały historię infekcji SARS-CoV- 2, otrzymały inne szczepionki przeciw COVID-19 lub otrzymywały leki immunosupresyjne.Pseudowirusowy test przeciwciał neutralizujących

Pseudowirusy SARS-CoV-2 eksprymujące gen reporterowy lucyferazy zastosowano do pomiaru przeciwciał neutralizujących pseudowirusy. W skrócie, konstrukty pakujące psPAX2 (AIDS Resource and Reagent Program), plazmid reporterowy lucyferazy pLentiCMV Puro-Luc (Addgene) i pcDNA3 eksprymujący białko wypustek.1-SARS-CoV-2 SΔCT były współ- transfekowano do komórek HEK293T (ATCC CRL_3216) za pomocą lipofektaminy 2000 (ThermoFisher Scientific). Pseudowirusy wariantów SARS-CoV-2 zostały wygenerowane przy użyciu szczepu WA1/2020 (Wuhan/WIV04/2019, identyfikator dostępu GISAID: EPI_ISL_402124), wariant B.1.1.7 (Alfa, identyfikator dostępu GISAID: EPI_ISL_601443), wariant B.1.351 (Beta, identyfikator dostępu GISAID: EPI_ISL_712096), B.1.617. 2 (Delta, identyfikator dostępu GISAID: EPI_ISL_2020950) lub B.1.1.529 (Omicron, identyfikator GISAID: EPI_ISL_7358094.2). Supernatanty zawierające pseudotypy wirusów zebrano 48 godzin po transfekcji; Wirusy pseudotypowe oczyszczono przez filtrację przez filtr 0.45-μm. Aby określić aktywność neutralizacyjną surowicy ludzkiej, komórki HEK293T-hACE2 wysiano w płytkach do hodowli tkankowych 96-dołkowych przy gęstości 1,75 x 104 komórek na dołek przez noc. Przygotowano trzykrotne seryjne rozcieńczenia próbek surowicy inaktywowanej termicznie i zmieszano z 50 ul pseudowirusa. Mieszaninę inkubowano w 37 stopniach przez 1 godzinę przed dodaniem do komórek HEK293T-hACE2. Po 48 godzinach komórki poddano lizie w teście Steady-Glo Luciferase Assay (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Miana neutralizujące SARS-CoV-2 zdefiniowano jako rozcieńczenie próbki, przy którym zaobserwowano 50% redukcję (NT50) we względnych jednostkach światła w stosunku do średniej studzienek z kontrolą wirusa.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

SARS-CoV-2 przeciwciała swoiście wiążące się z domeną wiążącą receptor (RBD) w surowicy oceniano metodą ELISA. 96-dołkowe płytki pokryto 2 ug/ml SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta), B.1.351 (Beta) lub B.1.1.529 (Omicron) białko RBD w 1x Dulbecco buforowanym fosforanem (DPBS) i inkubowane w temperaturze 4 stopni przez noc. Po inkubacji płytki płukano raz buforem do płukania (0,05% Tween 20 w 1x DPBS) i blokowano 350 µl roztworu bloku kazeinowego na studzienkę przez 2 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Po inkubacji roztwór blokujący odrzucono, a płytki osuszono bibułą. Do studzienek dodano seryjne rozcieńczenia inaktywowanej termicznie surowicy rozcieńczonej w bloku kazeiny, a płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przed kolejnymi 3 płukaniami i 1-godzinną inkubacją z rozcieńczeniem 1:4000 anty- ludzka peroksydaza chrzanowa IgG (HRP) (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) w temperaturze pokojowej w ciemności. Płytki przemyto 3 razy i do każdego dołka dodano 100 µl roztworu SeraCare KPL TMB SureBlue Start; rozwój płytki zatrzymano przez dodanie 100 µl roztworu SeraCare KPL TMB Stop na studzienkę. Absorbancję przy 450 nm, z odniesieniem przy 650 nm, rejestrowano czytnikiem mikropłytek VersaMax (Molecular Devices). Dla każdej próbki miano punktu końcowego ELISA obliczono stosując dopasowanie 4-parametrowej krzywej logistycznej w celu obliczenia wzajemnego rozcieńczenia surowicy, które daje skorygowaną wartość absorbancji (450 nm-650 nm) wynoszącą 0,2. Zgłoszono interpolowane miana punktów końcowych.

ekstrakt z cistanche deserticola: poprawia odporność

Test immunoenzymatyczny (ELISPOT).

Płytki ELISPOT opłaszczono mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu IFN z MabTech w ilości 1 µg/studzienkę i inkubowano przez noc w 4 stopniach. Płytki przemyto DPBS i zablokowano pożywką R10 (RPMI z 10% inaktywowaną termicznie FBS z 1 procentem 100x penicyliny-streptomycyny, 1M HEPES, 100mM pirogronianu sodu, 200mM L-glutaminy i 0,1% 55mM 2-Merkaptoetanol) przez 2-4 godz. przy 37 stopniach . Przygotowano połączone peptydy SARS-CoV-2 z SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta) lub B.1.1.529 (Omicron) (21st Century Biochemicals) i wysiano w stężeniu 2 µg/studzienkę i do płytki dodano 100 000 komórek/studzienkę. Peptydy i komórki inkubowano przez 15-20 godz. w 37 stopniach. Wszystkie etapy następujące po tej inkubacji przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto buforem do płukania ELISPOT i inkubowano przez 2-4 godz. z biotynylowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciw ludzkiemu IFN-z firmy MabTech (1 µg/ml). Płytki płukano po raz drugi i inkubowano przez 2-3 godz. ze sprzężoną kozią antybiotyną AP z Rockland, Inc. (1,33 µg/ml). Po końcowym przemyciu przez 7 minut dodawano roztwór substratu w postaci błękitu nitrozowego chlorku tetrazoliowego/5-bromo-4-chloro-3'indolilofosforanu soli p-toluidyny (NBT/BCIP chromagen). Chromagen odrzucono, a płytki przemyto wodą i suszono w ciemnym miejscu przez 24 godziny. Płytki skanowano i liczono na analizatorze Cellular Technologies Limited Immunospot Analyzer.

Test barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS)

Odpowiedzi limfocytów T CD4 plus i CD8 plus oszacowano ilościowo za pomocą połączonych testów wybarwiania cytokin wewnątrzkomórkowych stymulowanych peptydem (ICS). Pule peptydów zawierały 15 peptydów aminokwasowych nakładających się na 11 aminokwasów obejmujących SARS-CoV-2WA1/2020, B.1.617.2 (Delta) lub B.1.1 .529 (Omikron) Białka kolców (biochemikalia XXI wieku). 106 studzienek jednojądrzastych komórek krwi obwodowej ponownie zawieszono w 100 µl pożywki R10 uzupełnionej przeciwciałem monoklonalnym CD49d (1 µg/ml) i przeciwciałem monoklonalnym CD28 (1 µg/ml). Każdą próbkę oceniano próbnie (100 µl R10 plus 0,5% DMSO; kontrola tła), peptydami (2 µg/ml) i/lub 10 pg/ml octanu mirystynianu forbolu (PMA) i 1 µg/ml jonomycyny (Sigma- Aldrich) (100 µl; kontrola pozytywna) i inkubowano w 37°C przez 1 godz. Po inkubacji do każdego dołka dodano 0,25 µl GolgiStop i 0,25 µl GolgiPlug w 50 µl R10 i inkubowano w 37 stopniach przez 8 godzin, a następnie utrzymywano w 4 stopniach przez noc. Następnego dnia komórki przemywano dwukrotnie DPBS, barwiono wodnym żywym/martwym barwnikiem przez 10 minut, a następnie barwiono ustalonymi wcześniej mianami przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD279 (klon EH12.1, BB700), CD4 (klon L200, BV711), CD27 (klon M-T271, BUV563), CD8 (klon SK1, BUV805), CD45RA (klon 5H9, APC H7) przez 30 min. Następnie komórki przemyto dwukrotnie 2% buforem FBS/DPBS i inkubowano przez 15 min z 200 µl roztworu BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization. Komórki przemyto dwukrotnie 1X buforem Perm Wash (BD Perm/WashTM Buffer 10X w zestawie CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization rozcieńczonym wodą MilliQ i przepuszczono przez filtr 0,22 µm) i wybarwiono wewnątrzkomórkowo przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko IFN- (klon B27; BUV395) i CD3 (klon SP34.2, Alexa 700), przez 30 min. Komórki przemyto dwukrotnie buforem 1X Perm Wash i utrwalono 250 µl świeżo przygotowanego 1,5% formaldehydu. Utrwalone komórki przeniesiono do 96-dołkowej płytki okrągłodennej i analizowano w systemie BD FACSymphony™. Dane analizowano za pomocą FlowJo v9.9.

dodatek cistanche:poprawić odporność

Bibliografia

1. Cele S, Jackson L, Khan K i in. SARS-CoV-2 Omicron ma rozległy, ale niepełny wymyk Pfizer BNT162b2 wywołany neutralizacją i wymaga ACE2 do infekcji. medRxiv 2021.

2. Dan JM, Mateus J, Kato Y i in. Pamięć immunologiczna na SARS-CoV-2 oceniana do 8 miesięcy po zakażeniu. Nauka 2021;371.

3. Set A, Crotty S. Odporność adaptacyjna na SARS-CoV-2 i COVID-19. Komórka 2021;184: 861-80.

4. Goel RR, malarz MM, Apostolidis SA, et al. Szczepionki mRNA indukują trwałą pamięć immunologiczną na SARS-CoV-2 i niepokojące warianty. Nauka 2021; 374: abm0829.

5. McMahan K, Yu J, Mercado NB i in. Korelaty ochrony przed SARS-CoV-2 u makaków rezus. Natura 2021;590:630-4.

6. Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI i in. Cele odpowiedzi komórek T na koronawirusa SARS-CoV-2 u ludzi z chorobą COVID-19 i u osób nienarażonych. Komórka 2020;181:1489-501 e15.

7. Sadoff J, Gray G, Vandebosch A, et al. Bezpieczeństwo i skuteczność jednodawkowej szczepionki Ad26.COV2.S przeciwko Covid-19. N Engl J Med 2021;384:2187-201.

8. Polack FP, Thomas SJ, Kitchin N, et al. Bezpieczeństwo i skuteczność szczepionki BNT162b2 mRNA Covid-19. N Engl J Med 2020.

9. Collier AY, Yu J, McMahan K, et al. Kinetyka różnicowa odpowiedzi immunologicznych wywoływanych przez szczepionki przeciw Covid-19. N Engl J Med 2021;385:2010-2.

10. Falsey AR, Frenck RW, Jr., Walsh EE i in. SARS-CoV-2 Neutralizacja dawką szczepionki BNT162b2 3. N Engl J Med 2021.

11. Barouch DH, Stephenson KE, Sadoff J, et al. Trwałe humoralne i komórkowe odpowiedzi immunologiczne 8 miesięcy po szczepieniu Ad26.COV2.S. N Engl J Med 2021;385:951-3.

12. Alter G, Yu J, Liu J, et al. Immunogenność szczepionki Ad26.COV2.S przeciwko wariantom SARS-CoV-2 u ludzi. Natura 2021; 596: 268-72.

13. Poon MML, Rybkina K, Kato Y, et al. Zakażenie SARS-CoV-2 generuje u ludzi pamięć immunologiczną zlokalizowaną w tkankach. Immunologia naukowa 2021;6:eabl9105.

14. Vidal SJ, Collier AY, Yu J, et al. Korelaty neutralizacji wobec SARS-CoV-2 Warianty obaw we wczesnej surowicy pandemicznej. J Virol 2021;95:e0040421.

korzyść z dodatku cistanche:poprawić odporność