Sekwencjonowanie całego genomu w diagnostyce zaburzeń neurologicznej ekspansji powtórzeń w Wielkiej Brytanii: retrospektywna dokładność diagnostyczna i prospektywne badanie walidacji klinicznej

Po więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Streszczenie

Tło

Zaburzenia ekspansji powtórnej dotykają około 1 na 3000 osób i są klinicznie niejednorodnymi chorobami spowodowanymi ekspansją krótkich tandemowych powtórzeń DNA. Testy genetyczne są często specyficzne dla locus, co skutkuje niedodiagnozowaniem osób z nietypowymi obrazami klinicznymi, zwłaszcza u pacjentów pediatrycznych bez wcześniejszej pozytywnej historii rodzinnej. Sekwencjonowanie całego genomu jest coraz częściej stosowane jako test pierwszego rzutu w przypadku innych rzadkich zaburzeń genetycznych, a my postawiliśmy sobie za cel ocenę jego skuteczności w diagnostyce pacjentów zneurologicznapowtórzyć zaburzenia ekspansji.

Metody

Oceniliśmy retrospektywnie dokładność diagnostyczną sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia najczęstszych loci ekspansji powtórzeń związanych zneurologicznawyniki (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT i TBP) na podstawie próbek uzyskanych w ramach National Health Service w Anglii od pacjentów, u których podejrzewanoneurologicznazaburzenia; poprzednie wyniki testu PCR zastosowano jako wzorzec odniesienia. Dokładność kliniczna sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia ekspansji powtórzeń została zbadana prospektywnie u wcześniej przebadanych genetycznie i niezdiagnozowanych pacjentów zrekrutowanych w latach 2013–2017 do projektu 100 000 Genomes w Wielkiej Brytanii, u których podejrzewanoneurologicznazaburzenia (rodzinne lub wczesne postacie ataksji, neuropatii, porażenia spastycznego, otępienia, choroby neuronu ruchowego,parkinsonowskiruchzaburzenia, niepełnosprawność intelektualna lub zaburzenia nerwowo-mięśniowe). Jeśli powtórzono wywołanie ekspansji przy użyciu sekwencjonowania całego genomu, do potwierdzenia wyniku stosowano PCR.

Wyniki

Dokładność diagnostyczna sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia ekspansji powtórzeń została oceniona w porównaniu z 793 testami PCR wykonanymi wcześniej w ramach NHS u 4 04 pacjentów. Sekwencjonowanie całego genomu prawidłowo sklasyfikowało 215 z 221 alleli ekspandowanych i 1316 z 1321 alleli nieekspandowanych, wykazując 97,3% czułość (95% CI 94,2–99,0) i 99,6% swoistość (99,1–99). ·9) w 13 loci związanych z chorobą w porównaniu z wynikami testu PCR. W próbkach od 11 631 pacjentów w 100 000 Projekt Genomów, sekwencjonowanie całego genomu zidentyfikowało 81 powtórzeń ekspansji, które również przetestowano metodą PCR: 68 potwierdzono jako powtórzenia ekspansji w pełnym zakresie patogennym, 11 było nie -patogenne pośrednie ekspansje lub permutacje, a dwa były nierozszerzonymi powtórzeniami (16 procent fałszywego wykrywania).

Interpretacja

W naszym badaniu sekwencjonowanie całego genomu w celu wykrycia ekspansji powtórzeń wykazało wysoką czułość i swoistość, co doprowadziło do identyfikacjineurologicznapowtarzają się zaburzenia ekspansji u wcześniej niezdiagnozowanych pacjentów. Odkrycia te wspierają wdrożenie sekwencjonowania całego genomu w laboratoriach klinicznych w celu diagnozowania pacjentów, którzy mają:neurologicznaprezentacja zgodna z zaburzeniem powtórnej ekspansji.

Finansowanie

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research oraz Illumina.

Wstęp

Pomimo ostatnich postępów w naszym zrozumieniu genetycznej podstawy rzadkichneurologicznazaburzeń, do 70 procent pacjentów z takimi zaburzeniami pozostaje niezdiagnozowanych genetycznie.1–3 Częściowo wynika to z trudności technicznych związanych z testowaniem złożonych i powtarzalnych wariantów genetycznych, w tym powtórnych ekspansji; Szacuje się, że takie ekspansje dotykają około 1 na 3000 osób (załącznik p 1) i są główną przyczyną ponad 40 zaburzeń neurogenetycznych4, w tym choroby Huntingtona i zespołu łamliwego chromosomu X. Zaburzenia ekspansji powtórzeń są klinicznie i genetycznie niejednorodne, a ekspansja powtórzeń może być związana z różnymi chorobami. Na przykład ekspansje w C9orf72 mogą objawiać się albo jako stwardnienie zanikowe boczne albo otępienie czołowo-skroniowe.5 Powtarzające się ekspansje w różnych loci mogą również dawać podobne cechy fenotypowe, co utrudnia ich kliniczne rozróżnienie: powtórzenie ekspansji w co najmniej dziesięciu genach ataksji rdzeniowo-móżdżkowej, często obecnych w wieku dorosłym - ataksja o początku6, a także ataksja C9orf72 i AR mogą powodować chorobę neuronu ruchowego.7,8

Zaburzenia ekspansji powtórzeń są spowodowane wzrostem liczby powtarzających się krótkich tandemowych sekwencji DNA, a progi patogenności dla każdego zaburzenia są specyficzne dla locus. Wielkość ekspansji waha się od mniej niż 30 powtórzeń (np. w CACNA1A) do kilku tysięcy powtarzających się jednostek (np. w FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN, które mogą mieć rozmiar do 5 kb). Ekspansje powtórzeń wykazują niestabilność molekularną, co może prowadzić do zmian w wielkości powtórzeń (zwykle zwiększającej się długości) w kolejnych pokoleniach i tkankach.4 W tych warunkach wzrost liczby powtórzeń często prowadzi do wcześniejszego początku i poważniejszej choroby w kolejnych Pokolenia.4 Pediatryczny początek zaburzeń powtórnej ekspansji może objawiać się jako zespoły wielonarządowe bez specyficznych sygnatur fenotypowych9, a zatem dzieci z tymi zaburzeniami są bardziej narażone na niedodiagnozowanie, gdy w rodzinie nie występuje zaburzenie powtórnej ekspansji, niż gdy jest ono obecne.10– 12

Laboratoryjna ocena ekspansji powtórzeń jest zazwyczaj ograniczona do ukierunkowanej oceny molekularnej pojedynczego locus na podstawie podejrzenia diagnozy klinicznej przy użyciu metod opartych na PCR lub Southern blot,13 co może być kosztowne i czasochłonne. Dodatkowo, ze względu na zróżnicowane i nakładające się cechy fenotypowe tych zaburzeń, związane z chorobą loci ekspansji powtórzeń mogą pozostać niezbadane.14

Sekwencjonowanie całego genomu staje się narzędziem diagnostycznym pierwszego rzutu u pacjentów z rzadkimi chorobami15, ale do niedawna uważano, że ma ograniczone możliwości oceny loci zawierających ekspansje powtórzeń.16 Postępy w bioinformatyce umożliwiły jednak wykrywanie choroby -powodowanie ekspansji powtórzeń z danych sekwencjonowania nowej generacji.17-22 W tym miejscu przedstawiamy ocenę diagnostyczną podejścia do sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia ekspansji powtórzeń przy użyciu danych retrospektywnego PCR oraz jego walidację kliniczną u pacjentów w ramach projektu 100000 Genomów, którzy miał podejrzenie zaburzenia neurologicznego, niezdiagnozowanego w poprzednich badaniach genetycznych.

Metody

Projekt badania i uczestnicy

Ta ocena sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia ekspansji powtórzeń obejmowała zarówno ocenę dokładności diagnostycznej, jak i klinicznej. Dokładność diagnostyczna została oceniona na podstawie danych pochodzących od pacjentów, którzy zostali wcześniej przetestowani metodą PCR pod kątem powtórnych ekspansji, o których wiadomo, że powodują choroby neurologiczne.4 Pacjenci zostali zidentyfikowani z dwóch źródeł: projektu 100 000 Genomes oraz Laboratorium Genomicznego z siedzibą w szpitalach uniwersyteckich w Cambridge ( Cambridge, Wielka Brytania). W przypadku obu grup pacjentów testy PCR zostały przeprowadzone na próbkach pacjentów przez laboratoria Narodowej Służby Zdrowia (NHS) w ramach rutynowej oceny klinicznej: dla próbek w Projekcie 100000 Genomów testy PCR zostały wykonane przed rekrutacją do projektu przez Laboratorium Neurogenetyki Szpitala Uniwersyteckiego w Londynie (Londyn, Wielka Brytania); próbki z wydłużeniem powtórzeń potwierdzonym PCR uzyskano od pacjentów przebadanych przez Laboratorium Genomowe z siedzibą w Cambridge. Pacjenci z wynikami testów PCR-dodatnich i PCR-ujemnych dla zaburzeń ekspansji powtórnej zostali zidentyfikowani do włączenia do naszego badania za pomocą systemów dokumentacji laboratoryjnej; wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich próbki do zapewnienia jakości oraz do celów badawczych i szkoleniowych, w ramach optymalizacji i walidacji usług klinicznych.

Sekwencjonowanie całego genomu każdej próbki zostało wykonane w jednym z dwóch laboratoriów: Genomics England (Hinxton, UK) dla próbek projektu 100000 Genomów (n=254) oraz Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) dla próbek uzyskanych przez Laboratorium Genomowe z siedzibą w Cambridge (n=150). Ogólnie rzecz biorąc, ten zestaw danych został wykorzystany w części badania dotyczącej dokładności diagnostycznej i składał się z danych PCR i sekwencjonowania całego genomu od 404 pacjentów, obejmujących 13 loci, które reprezentują najczęstsze neurologiczne zaburzenia ekspansji powtórzeń: 11 loci związanych z ataksją i późną początek zaburzeń neurodegeneracyjnych (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 i FXN), jedno miejsce związane z niepełnosprawnością intelektualną (FMR1) i jedno miejsce związane z dystrofią miotoniczną (DMPK). Dla każdego locus dostępne były dane z testu PCR dla co najmniej jednego rozszerzonego allelu (załącznik p 24).

Dokładność kliniczną oceniano, badając zgodność powtórzeń ekspansji, wykrytych za pomocą sekwencjonowania całego genomu, z podejrzeniem diagnozy klinicznej po potwierdzeniu PCR u pacjentów z podejrzeniem genetycznych zaburzeń neurologicznych (rodzinne lub wczesne postacie ataksji, neuropatia, paraplegia spastyczna, demencja choroba neuronu ruchowego,parkinsonowskizaburzenia ruchu, niepełnosprawność intelektualna lub zaburzenia nerwowo-mięśniowe) rekrutowanych do projektu 100000 Genomów w latach 2013–2017. Projekt 100000 Genomów to brytyjski program mający na celu ocenę wartości sekwencjonowania całego genomu u pacjentów z niezaspokojonymi potrzebami diagnostycznymi w rzadkich chorobach i raku. Po uzyskaniu zgody etycznej na projekt 100000 Genomów przez Komisję Etyki Badań nad Wschodnią Anglią Cambridge South Research (nr ref. 14/EE/1112), w tym na potrzeby analizy danych i zwrotu wyników diagnostycznych pacjentom, pacjenci ci zostali zrekrutowani przez pracowników służby zdrowia i badaczy z 13 Genomic Medicine Centres w Anglii i zostali przyjęci do projektu, jeśli oni lub ich opiekun przedstawili pisemną zgodę na wykorzystanie ich próbek i danych w badaniach, w tym w tym badaniu. Badani i, jeśli to możliwe, inni członkowie rodziny, zostali zakwalifikowani zgodnie z kryteriami kwalifikacyjnymi określonymi dla określonych rzadkich chorób (załącznik str. 5–11). Pacjenci zostali zrekrutowani do projektu 100000 Genomów po przeprowadzeniu standardowych testów genetycznych w NHS, jak wskazano w kryteriach kwalifikacyjnych. Standaryzowane wyjściowe dane kliniczne zostały zarejestrowane przy użyciu Human Phenotyping Ontology (HPO)23 w porównaniu z modelami danych specyficznych dla choroby.24 Zgromadzono również stan chorobowy członków rodziny w odniesieniu do klinicznych wskazań probanta do badania.

Aby zidentyfikować przyczynowe ekspansje powtórzeń u pacjentów z genetycznie nierozpoznaną chorobą, przebadaliśmy pacjentów z podejrzeniem zaburzeń genetycznych zgodnych z chorobą powtórzeń ekspansji. Pacjenci zostali wybrani na podstawie zgodności ich choroby i warunków HPO z zaburzeniami związanymi z powtórną ekspansją. Dane pacjentów dotyczące sekwencjonowania całego genomu zostały przebadane w celu wyszukania ekspansji w poszczególnych zestawach powtórzeń przy użyciu czterech różnych paneli ekspansji powtórzeń zgodnie z ich charakterystyką kliniczną (załącznik p 5). Wybrane do włączenia do tych paneli ekspansje powtórzeń są najczęstszymi loci ekspansji powtórzeń powodujących choroby neurologiczne. Pacjenci z cechami klinicznymi potencjalnie kompatybilnymi z więcej niż jednym zaburzeniem ekspansji powtórnej byli testowani na wielu panelach. Jeśli powtórzono wywołanie ekspansji przy użyciu sekwencjonowania całego genomu, przeprowadzono badanie potwierdzające metodą PCR.

W przypadku każdego pacjenta z potwierdzonym rozszerzeniem liczby powtórzeń miejscowy lekarz został poinformowany o potencjalnym wyniku diagnostycznym i oceniono wpływ rozszerzenia liczby powtórzeń na cechy kliniczne pacjenta. W przypadku powtórnych rozszerzeń, które w pełni lub częściowo wyjaśniały cechy kliniczne pacjenta, wydano raport diagnostyczny zgodnie z lokalnymi standardowymi procedurami.

Procedury

W przypadku próbek historycznych NHS użytych w części naszego badania dotyczącej dokładności diagnostycznej, powtórzone ekspansje były wcześniej testowane przy użyciu amplifikacji PCR i analizy fragmentów. Southern blotting przeprowadzono dla dużych ekspansji C9orf72. W części naszego badania dotyczącej dokładności klinicznej powtórzenia ekspansji wykryte przez sekwencjonowanie całego genomu u pacjentów z projektu 100 000 Genomy zostały przetestowane metodą PCR w próbkach przechowywanych w laboratoriach genetycznych NHS. Dodatkowe szczegóły, w tym sekwencje starterów, znajdują się w załączniku (str. 2–3, 25–26).

DNA przygotowano do sekwencjonowania całego genomu za pomocą przygotowania biblioteki TruSeq DNA PCR-Free, a sekwencjonowanie sparowanych końców 150 pz lub 125 pz przeprowadzono na platformach HiSeq 2000 lub HiSeq X w wysokoprzepustowym ośrodku genomów dla Genomics England oraz w ICSL . Genomy zsekwencjonowano do średniej głębokości 35× (31× do 37×; dodatek str. 27). Genotypowanie krótkich powtórzeń tandemowych przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania ExpansionHunter w wersji 3.1.2.25,26 W skrócie, ExpansionHunter ponownie wyrównuje odczyty sekwencjonowania w ramach predefiniowanego zestawu krótkich powtórzeń tandemowych, aby oszacować rozmiar obu alleli od osoby (załącznik p 3).

Dane wyjściowe programu ExpansionHunter obejmują oszacowanie liczby powtarzających się elementów, całkowitego rozmiaru i limitu ufności dla każdego ocenianego miejsca. Wytyczne Association for Medical Pathology i College of American Pathologists zalecają wizualną kontrolę wywoływania wariantów podczas rutynowej oceny wariantów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.27

Jednak warianty krótkich powtórzeń tandemowych nie mogą być odpowiednio wizualizowane przez popularne narzędzia do wizualizacji, takie jak Integrative Genomics Viewer.28 Aby zbadać dane sekwencjonowania całego genomu leżące u podstaw każdego wywołania genotypu, zastosowano narzędzie do wizualizacji wykresu, które umożliwia bezpośrednią wizualizację haplotypów i odpowiadającego im pileupu odczytu genotypów ExpansionHunter (załącznik s. 3, 15). Wzrokowa kontrola grafu pileupu została przeprowadzona dla wszystkich wywołań krótkich powtórzeń tandemowych sekwencjonowania całego genomu, aby potwierdzić, że przewidywanie ExpansionHunter dla alleli było całkowicie zawarte w każdym odczycie (tj. sekwencja powtórzeń była krótsza niż długość odczytu sekwencjonowania); aby potwierdzić obecność ekspansji monoallelicznej lub biallelicznej; wykrywanie domniemanych połączeń fałszywie dodatnich; oraz do wykrywania alleli fałszywie ujemnych w rozwinięciach powtórzeń biallelicznych, takich jak FXN (załącznik str. 4, 16).

ExpansionHunter szacuje wielkość powtórzeń na podstawie danych sekwencjonowania całego genomu, analizując odczyty sekwencjonowania, które w całości lub częściowo zawierają krótkie powtórzenie tandemowe. Jeśli krótki allel powtórzenia tandemowego jest krótszy niż długość odczytu, ExpansionHunter przewiduje dokładny rozmiar; jeśli krótki allel powtórzeń tandemowych jest dłuższy niż długość odczytu, ExpansionHunter szacuje wielkość powtórzeń w CI, w zależności od składu sekwencji locus, głębokości sekwencjonowania i jakości sekwencjonowania.

Analiza statystyczna

Sklasyfikowaliśmy powtórzenia jako rozwinięte przez sekwencjonowanie całego genomu, jeśli rozmiar przewidywany przez ExpansionHunter był powyżej odcięcia premutacji lub nierozszerzony, jeśli przewidywany rozmiar był poniżej odcięcia (załącznik p 28).

Czułość i CI dla wykrywania ekspansji powtórzeń sekwencjonowania całego genomu obliczono jako proporcję alleli z wydłużonymi powtórzeniami wśród alleli wcześniej potwierdzonych PCR z wydłużonymi powtórzeniami. Swoistość oszacowano jako proporcję nieekspandowanych alleli wśród poprzednio testowanych nieekspandowanych powtórzeń metodą PCR. Pełny opis wzorów statystycznych znajduje się w załączniku (s. 1).

Aby porównać wielkości powtórzeń metodą PCR z oszacowaną wielkością powtórzeń przez sekwencjonowanie całego genomu, allele oznaczone ilościowo metodą PCR porównano z wielkościami powtórzeń przewidzianymi przez ExpansionHunter dla alleli krótszych niż długość odczytu we wszystkich 13 loci z krótkimi powtórzeniami tandemowymi. Zgodność obliczono na podstawie procentu wielkości powtórzeń przewidywanych przez ExpansionHunter, które były zgodne z wielkością oznaczoną ilościowo metodą PCR, biorąc pod uwagę błąd PCR plus lub minus jedno powtórzenie. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego R w wersji 3.6.3.

Rola źródła finansowania

Projekt badania, rekrutacja pacjentów, zbieranie danych i sekwencjonowanie były prowadzone przez pracowników Genomics England i naukowców akademickich. Pracownicy firmy Illumina przeprowadzili sekwencjonowanie 150 próbek pacjentów jako zaplanowany element badania dokładności diagnostycznej sekwencjonowania całego genomu i opracowali program ExpansionHunter. Pracownicy Genomics England, naukowcy akademiccy i współautorzy RTH, ED i MAE przeprowadzili analizę i interpretację powtórzeń ekspansji u pacjentów zrekrutowanych do 100 000 Projektu Genomów. Źródła finansowania nie odgrywały żadnej roli w interpretacji danych lub pisaniu raportu.

Wyniki

Dokładność diagnostyczna sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia ekspansji powtórzeń została oceniona względem 793 testów PCR wykonanych wcześniej w ramach NHS u 4 04 pacjentów (64 pacjentów przebadano dla więcej niż jednego powtórzenia; ryc. 1). Spośród tych testów 183 zaklasyfikowano jako mające rozszerzone powtórzenia, a 610 jako nieposiadające rozszerzonego powtórzenia przez PCR, dając łącznie 221 rozszerzonych i 1321 nierozszerzonych pojedynczych alleli w 13 loci choroby (załącznik str. 24, 28). Sekwencjonowanie całego genomu prawidłowo sklasyfikowało 215 z 221 alleli ekspandowanych i 1316 z 1321 alleli nieekspandowanych w porównaniu z wynikami testu PCR (załącznik str. 27, 29), wykazując początkową czułość 97,3 procent (95% CI 94,2–99). ·0) i swoistość 99,6 procent (99,1–99,9; tabela 1). Po wizualnej korekcie wszystkich połączeń na podstawie jakości odczytów czułość wzrosła do 99,1 procent (96,8–99,9), a swoistość do 100 procent (99,7–100; ryc. 2A, tabela 1). Wizualizacja alleli ekspandowanych umożliwiła wykrycie wyników fałszywie dodatnich i reklasyfikację wszystkich alleli fałszywie ujemnych w FXN, z których tylko jeden allel został poprawnie zaklasyfikowany jako ekspandowany w próbkach z ekspansją bialleliczną (załącznik str. 17, 18).

Długość powtórzeń oznaczono ilościowo za pomocą PCR w 509 testach PCR badając 945 alleli w 13 loci ekspansji powtórzeń. Korelacje między ExpansionHunter i PCR dla wielkości powtórzeń krótszych i większych niż długość odczytu sekwencjonowania (tj. 150 pz) pokazano w dodatku (załącznik str. 19). Wysoką zgodność zaobserwowano dla powtórzeń krótszych niż długość odczytu, przy 92,7% (836 z 902) zgodności pomiędzy PCR i ExpansionHunter. Zaobserwowano zmienność locus, z wysoką zgodnością między ExpansionHunter i PCR dla ATXN2, ATXN7, CACNA1A i HTT oraz niską zgodnością dla DMPK lub TBP (załącznik str. 30). Długości alleli większych niż długość odczytu zostały niedoszacowane przez ExpansionHuntera, co wpłynęło na dokładność wywołania w DMPK, FMR1 i FXN (ryc. 2B, załącznik str. 19, 31).

Chociaż firma ExpansionHunter była w stanie prawidłowo zidentyfikować duże rozszerzone allele w FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN (załącznik p 29), przewidywane szacunki wielkości były zwykle niższe niż te uzyskane przez PCR, ponieważ wielkość powtórzeń wzrosła w zakresie patogennym, co wpłynęło na umiejętność rozróżniania między dużymi i małymi rozwinięciami w DMPK, C9orf72 i FXN lub między pełnymi rozwinięciami i permutacjami w FMR1 (załącznik str. 31). Na przykład loci z długością powtórzeń ocenianą metodą PCR większą niż 200 powtórzeń w FMR1 i sklasyfikowane jako pełna mutacja miały średnią wielkość powtórzeń oszacowaną przez ExpansionHuntera na 92,6 (SD 17,8; dodatek p 31).

Aby przetestować zdolność ponownego wykrywania ekspansji za pomocą sekwencjonowania całego genomu w celu rozwiązania diagnozy wcześniej przetestowanych i niezdiagnozowanych genetycznie pacjentów, przetestowaliśmy 11 631 pacjentów z podejrzeniem genetycznego zaburzenia neurologicznego zrekrutowanych do projektu 100000 Genomy (rysunek 1). Dane z sekwencjonowania całego genomu zostały ocenione przy użyciu czterech różnych paneli powtórzeń, zgodnie z cechami klinicznymi pacjenta. Liczby pacjentów przebadanych za pomocą każdego z czterech paneli przedstawiono w tabeli 2.

Ogólnie rzecz biorąc, wykryliśmy i wizualnie potwierdziliśmy powtórne ekspansje w próbkach od 105 pacjentów (tabela 2, dodatek str. 20, 33). Spośród nich 81 próbek było dostępnych do testów potwierdzających metodą PCR, a 68 potwierdzono jako wykazujące powtarzalną ekspansję (0wydajność 6%): 45 (1,2%) z 3692 w panelu A, osiem ({{ {18}}·3 procent) z 2743 w panelu B, pięć (0,6 procent) z 860 w panelu C i dziesięć (0,1 procent) z 6731 w panelu D. Trzynaście z 81 połączeń rozszerzających nie zostały potwierdzone jako patogenne ekspansje powtórzeń (16 procent fałszywych odkryć). Spośród nich dwa były allelami nierozszerzonymi w ATXN1 i ATXN2, cztery były wywołaniami FMR1 o średniej wielkości (załącznik p 21), a siedem było permutacjami FMR1.

Szczegóły kliniczne 68 pacjentów z wydłużeniem powtórzeń potwierdzonym metodą PCR, w tym ich prezentacje kliniczne, zidentyfikowane wydłużenie powtórzeń i udział wydłużenia powtórzeń w cechach klinicznych pacjenta przedstawiono w tabeli 3; warunki HPO, wielkość powtórzeń oszacowana przez ExpansionHunter i to, czy wydano raport diagnostyczny, są wymienione w dodatku (str. 33).

Ekspansje zaobserwowano u pacjentów z szeroką gamą nakładających się objawów klinicznych badanych za pomocą panelu A (tabela 3, załącznik p 22), w tym rozszerzenie liczby powtórzeń ATXN2 u pacjenta z chorobą Parkinsona o wczesnym początku reagującą na lewodopę i postępującą ataksją móżdżkową w wywiadzie oraz ekspansje AR u czterech pacjentów z klinicznie zdiagnozowaną chorobą Charcota-Marie-Tootha, w tym jednego z genetycznie potwierdzoną neuropatią demielinizacyjną (tj. choroba Charcota-Marie-Tootha typu 1, pacjent 42; dodatek p 33). U pacjentów z patogennymi ekspansjami powtórzeń zaobserwowano szeroki zakres wcześniejszych diagnoz klinicznych.

Na przykład u siedmiu pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym lub inną chorobą neuronów ruchowych, ekspansje zidentyfikowano w AR (n=4) i C9orf72 (n=3). U pacjentów z podejrzeniem dziedzicznej ataksji zidentyfikowaliśmy ekspansje w loci, które nie były oceniane w ramach rutynowych prac diagnostycznych w ramach NHS w momencie rekrutacji, w tym ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP i HTT ( Tabela 3). Wykryliśmy również ekspansję powtórzeń u pacjentów z cechami klinicznymi zgodnymi z alternatywnymi zaburzeniami ekspansji powtórzeń, w tym ekspansję C9orf72 we wczesnym początku i rodzinnej chorobie Parkinsona (pacjent 24, Tabela 3) oraz powtórzenia ekspansji w zakresie zmniejszonej penetracji w HTT (38 powtórzeń). u dwóch sióstr z zaburzeniami ruchu, otępieniem, depresją i trudnościami w mowie (pacjenci 44 i 45), podkreślając wyzwanie diagnostyczne, jakie stanowią te zaburzenia ekspansji powtórnej.

Ośmioro dzieci przebadanych za pomocą panelu B miało duże ekspansje powtórzeń CAG (ryc. 3), z których siedmioro w pełni wyjaśniało cechy kliniczne pacjenta. Sześciu pacjentów nie miało wywiadu rodzinnego i nie zaproponowano im powtórnych testów rozszerzających w ramach oceny klinicznej w momencie rekrutacji (pacjenci 48–53; tabela 3, załącznik str. 33). Dwoje z tych dzieci miało duże ekspansje HTT (90-100 powtórzeń CAG). Warto zauważyć, że jedno dziecko odziedziczyło powtórkę od zdrowego rodzica bez historii choroby Huntingtona w rodzinie. Testy rodzinne są w toku, ale w rozszerzonej rodzinie zidentyfikowano allel o zmniejszonej penetracji, co wskazuje, że liczba powtórzeń powiększyła się o ponad 60 jednostek powtórzeń w jednym pokoleniu (pacjent 52). W chwili pisania tego tekstu nikt w rodzinie nie wykazywał żadnych oznak choroby Huntingtona, a rodzice otrzymują poradnictwo genetyczne i testy. Dwoje dzieci w wieku poniżej 5 lat miało duże powtórzenia ekspansji w ATXN7 i prezentowało złożoną wieloukładową chorobę. W przypadku jednego z tych dzieci (pacjent 50) ich rodzic wykazywał problemy z chodem 2 lata po zapisaniu się do projektu 100000 Genomów. Podobnie u dziewczynki w wieku 10 lat z niepełnosprawnością intelektualną stwierdzono 99-powtórną ekspansję ATXN2, pomimo faktu, że oboje rodzice zostali uznani za zdrowych, a u dziewczynki w wieku 18 lat z demencją stwierdzono { {19}}powtórz ekspansję w ATN1 (dodatek, str. 33).

Wykryto pięć ekspansji w DMPK (panel C), w tym u dziecka i matki z klinicznym rozpoznaniem dystrofii mięśniowej, u dwojga rodzeństwa z podejrzeniem miopatii dystalnej oraz u nastolatka z miopatią wrodzoną (pacjenci 54–58). Ekspansje FMR1 (panel D) wykryto u dziewięciu chłopców i jednej dziewczynki, a rozpoznanie zespołu łamliwego chromosomu X w pełni lub częściowo wyjaśniało występujące objawy kliniczne (pacjenci 59–68).

Dyskusja

Rozpoznanie zaburzeń powtarzającej się ekspansji stanowi wyzwanie w opiece zdrowotnej ze względu na niejednorodne i nakładające się cechy kliniczne oraz niespecyficzne objawy kliniczne, które mogą nasilać się wraz z wiekiem iw każdym kolejnym pokoleniu. Zaburzenia ekspansji powtórnej są jedną z najczęstszych przyczyn dziedzicznych chorób neurologicznych.4 Niemniej jednak pacjenci mogą być niedodiagnozowani, albo z powodu niewystarczających badań genetycznych, albo dlatego, że przyczynowe warianty genetyczne nie zostały jeszcze odkryte. Metody testowania są obecnie fragmentaryczne, a pacjenci mogą mieć przebadane nieprawidłowe locus ekspansji powtórzeń29 lub otrzymać test molekularny dla innej klasy wariantu ze względu na nakładanie się cech klinicznych z innymi neurologicznymi zaburzeniami genetycznymi.30

Sekwencjonowanie całego genomu było stosowane w wielu sytuacjach jako test diagnostyczny pierwszego rzutu w rzadkich zaburzeniach neurologicznych, ale wcześniej uważano, że ma niską zdolność wykrywania ekspansji powtórzeń.16 Opracowano kilka narzędzi do identyfikacji ekspansji powtórzeń z całego genomu sekwencjonowanie w środowisku badawczym,31 ale żadne z tych podejść nie zostało zastosowane do danych sekwencjonowania całego genomu zebranych od dużej liczby pacjentów w ramach jednej opieki zdrowotnej. Przedstawiamy dowody na to, że algorytm zaprojektowany do wykrywania ekspansji powtórzeń z sekwencjonowania całego genomu może wiarygodnie ocenić najczęstsze, powodujące chorobę ekspansje powtórzeń i rozwiązać wcześniej niezdiagnozowane genetycznie przypadki w dużej kohorcie pacjentów z zaburzeniami neurologicznymi. Nasze wyniki wskazują, że sekwencjonowanie całego genomu może rozróżniać allele nieekspandowane i ekspandowane z wysoką czułością i swoistością w 13 loci powtórzeń ekspansji (co można dodatkowo poprawić poprzez inspekcję wizualną), może dokładnie obliczyć wielkość alleli mniejszych niż długość odczytu i może nie docenić rozmiaru dużych rozszerzeń w FMR1, DMPK, FXN i C9orf72.

Kiedy wykrycie ekspansji powtórzeń przez sekwencjonowanie całego genomu zostało ocenione w porównaniu z pozytywnymi i negatywnymi wynikami uzyskanymi wcześniej w klinicznych laboratoriach diagnostycznych genomicznych przy użyciu metod „złotego standardu”, stwierdziliśmy minimalną czułość 97,3 procent i specyficzność 99,6 procent. Ponadto wykazaliśmy, że zarówno swoistość, jak i czułość można poprawić poprzez ręczną kurację pileupu odczytu, umożliwiając wykrywanie wyników fałszywie dodatnich i reklasyfikację alleli fałszywie ujemnych w próbkach z ekspansją bialleliczną. Spośród 6731 pacjentów przebadanych pod kątem FMR1 (panel D), przewidywano rozszerzenie 124 połączeń. Udało nam się wykluczyć 97 za pomocą oględzin jako prawdopodobnych wyników fałszywie dodatnich. Wskazuje to, że 1 na 54 testy sekwencjonowania całego genomu miałyby wywołanie FMR1, które należałoby sprawdzić wizualnie, aby odrzucić potencjalne zgłoszenie fałszywie dodatnie. Trwają prace nad ulepszeniem metody genotypowania ExpansionHunter, aby zmniejszyć liczbę fałszywie pozytywnych wywołań FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 powtórzeń) powoduje cięższą chorobę i ataksję rdzeniowo-móżdżkową typu 36 (NOP56), dla której ekspansje większe niż 650 powtórzeń są uważane za patogenne, a rozmiary powtórzeń 15-650 są uważane za pośrednie, a warianty o niepewnym znaczeniu.

Zidentyfikowano ponad 40 powtórzonych loci ekspansji; wiele z tych loci zostało zidentyfikowanych dopiero niedawno i jest obecnie związanych z wcześniej niewyjaśnionymi schorzeniami, w tym ataksją móżdżkową z neuropatią i zespołem arefleksji przedsionkowej (RFC1) 32 oraz padaczką miokloniczną (SAMD12). wybrane do naszego badania na podstawie dostępności próbek kontroli pozytywnej i negatywnej.

Przedstawione tu wyniki sugerują, że ExpansionHunter powinien być w stanie dokładnie klasyfikować allele nieekspandowane i ekspandowane w dowolnym locus ekspansji powtórzeń, jeśli allele nieekspandowane są mniejsze niż długość odczytu (tj. 150 pz). Chociaż większość powtarzających się loci ekspansji ma allele, które są mniejsze niż 150 pz, gdy nie są ekspandowane, niektóre loci, dla których wielkość nieekspandowanego allelu jest bliska 150 pz (np. NOTCH2NLC)34 mogą być trudniejsze do genotypowania przy użyciu tego podejścia. W przypadku loci, w których rozszerzone powtórzenie jest znacznie większe niż długość odczytu, sekwencjonowanie całego genomu może wykryć ekspansję patogenną (np. NOP56,35 RFC120,32). Pojawiające się technologie sekwencjonowania o długim czytaniu mogą oferować komplementarne podejścia podczas genotypowania dużych ekspansji.36

Ocena powtórnych ekspansji przy użyciu sekwencjonowania całego genomu u 11 631 niezdiagnozowanych pacjentów zrekrutowanych do 100 000 Projektu Genomów dała 68 pacjentów z wynikami wyjaśniającymi. Pacjenci zostali zrekrutowani do 100 000 Projektu Genomów po przeprowadzeniu standardowych testów genetycznych; w związku z tym odsetek powtórzeń zidentyfikowanych w tej kohorcie reprezentuje wzrost wydajności diagnostycznej w porównaniu ze standardowymi testami NHS, które obejmują testy specyficzne dla miejsca dla zaburzeń ekspansji powtórzeń, takich jak FXN lub DMPK. Warto zauważyć, że niektóre diagnozy nie były podejrzewane na podstawie cech klinicznych pacjenta, w tym sześciu pacjentów pediatrycznych, u których w rodzinie nie było znanej historii choroby powtórnej ekspansji. Średnie rozmiary powtórzeń ekspansji przewidywane przez sekwencjonowanie całego genomu u pacjentów pediatrycznych opisane w tym badaniu są znacznie większe niż średnia u dorosłych, co jest zgodne z oczekiwaniem, że większe ekspansje są związane z wcześniejszym i cięższym początkiem, nawet u dzieci. Potrzebne są dalsze prace, ale odkrycie to sugeruje, że zależna od wieku i powtórna, zależna od wielkości ocena patogenności może wspierać diagnozę pediatryczną poprzez zmniejszenie potencjalnego zagrożenia związanego z identyfikacją alleli ryzyka wystąpienia w wieku dorosłym, co prowadzi do niechcianych testów prognostycznych u dzieci.

Nasze odkrycia umożliwiają ustanowienie klinicznej procedury diagnostycznej dla sekwencjonowania całego genomu (załącznik str. 23). Proponujemy, aby inspekcję wizualną przeprowadzano dla wszystkich wywołań sklasyfikowanych jako ekspandowane w celu wykrycia fałszywie dodatnich oraz dla ekspansji biallelicznych, dla których wykryto tylko jeden ekspandowany allel (np. FXN). Zalecamy, aby laboratoria korzystały z ExpansionHunter do oceny obecności ekspansji bez przestrzegania szacowania wielkości i wykonywania potwierdzających testów PCR jako standardowego elementu przepływu pracy testowania.

Rzadkie choroby dziedziczne obejmują szeroki zakres cech klinicznych, co sprawia, że ​​testy genomiczne specyficzne dla locus są nieefektywne, żmudne i kosztowne. Przedstawiamy dowody na to, że sekwencjonowanie całego genomu na poziomie klinicznym z potencjałem do diagnozowania szeregu rzadkich chorób neurologicznych, zwykle prezentujących warianty z pojedynczą zasadą, indelem lub liczbą kopii, można teraz rozszerzyć w celu powtórzenia ekspansji. Ponieważ sekwencjonowanie całego genomu zapewnia pojedynczy test, który może zidentyfikować najczęstsze ekspansje powtórzeń, a także umożliwia jednoczesne testowanie mutacji punktowych i wariantów liczby kopii w genach związanych z tymi schorzeniami, oferuje możliwość identyfikacji większości pacjentów z tymi heterogenicznymi zaburzeniami u których nie zdiagnozowano za pomocą testów specyficznych dla locus. W erze pojawiających się terapii tych zaburzeń wczesne wykrywanie może stać się kluczowe.37 Wyniki te wspierają wdrożenie sekwencjonowania całego genomu w celu wykrywania ekspansji powtórzeń w klinicznych laboratoriach diagnostycznych, podejście, które zostało już uwzględnione w National Genomic NHS England Test Directory,38 do badania nierozpoznanej rzadkiej choroby neurologicznej.

Bibliografia

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H i in. Pułap diagnostyczny do sekwencjonowania egzomów w ataksji móżdżkowej i pokrewnych zaburzeniach neurologicznych. Mutacja Humu 2020; 41: 487-501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A i in. Dziedziczna paraplegia spastyczna w Grecji: charakterystyka wcześniej niezbadanej populacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Wydajność diagnostyczna ukierunkowanego panelu genów sekwencjonowania nowej generacji dla zaburzeń ruchowych o początku u dzieci: 3-letnie badanie kohortowe. Front Genet 2019; 10:1026.

4 Paulson H. Powtórz choroby ekspansji. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 otępienie czołowo-skroniowe i/lub stwardnienie zanikowe boczne. Seattle, WA: University of Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa. Nat Rev Dis Podkłady 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Neurogenetyka kliniczna: autosomalna dominująca ataksja rdzeniowo-móżdżkowa. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Rdzeniowy i opuszkowy zanik mięśni. W: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA i in., wyd. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Śmiertelna postać ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 7 z wczesnym początkiem w dzieciństwie. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A i in. Agregacja ataksyny-7 i ubikwitynacja w niemowlęcym SCA7 ze 180 powtórzeniami CAG. Annę Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 2 objawiająca się regresją poznawczą w dzieciństwie. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa o początku w dzieciństwie 3: dystonia języka jako wczesny objaw. Drżenie Inne Hiperkinetyczne Mov 2019; opublikowano w Internecie 13 września.

13 Ptak TD. Dystrofia miotoniczna typu 1. W: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA i in., wyd. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Częstość powtórzeń ekspansji SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS i C9orf72 u pacjentów z NZK, u których nie stwierdzono najczęstszych podtypów NZK. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K i in. Sekwencjonowanie całego genomu pacjentów z chorobami rzadkimi w narodowym systemie opieki zdrowotnej. Natura 2020; 583: 96-102.

16 Ashley EA. W kierunku medycyny precyzyjnej. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY i in. Przydatność diagnostyczna i kliniczna sekwencjonowania całego genomu w kohorcie niezdiagnozowanych chińskich rodzin z rzadkimi chorobami. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profilowanie krajobrazu całego genomu ekspansji powtórzeń tandemowych. Kwasy nukleinowe Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Wykrywanie ekspansji powtórzeń tandemowych w kohortach zsekwencjonowanych za pomocą krótkich danych sekwencjonowania. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF i in. Bioinformatyczna identyfikacja rozszerzonych powtórzeń: niereferencyjna ekspansja pentameru intronowego w RFC1 powoduje CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105:151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Warianty liczby kopii w klinicznym sekwencjonowaniu genomu: zastosowanie i interpretacja w przypadku chorób rzadkich i niezdiagnozowanych. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Wykrywanie w całym genomie tandemowych powtórzeń DNA, które ulegają ekspansji w autyzmie. Natura 2020; 5 86: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ontologia fenotypu człowieka: narzędzie do opisywania i analizy chorób dziedzicznych u ludzi. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomika Anglia. Modele danych klinicznych dotyczących rzadkich chorób. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (dostęp 4 sierpnia 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ i in. Wykrywanie ekspansji długich powtórzeń z danych sekwencji całego genomu wolnych od PCR. Genom Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: narzędzie oparte na wykresach sekwencji do analizy zmienności w krótkich regionach powtórzeń tandemowych. Bioinformatyka 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A i in. Standardy i wytyczne dotyczące walidacji rurociągów bioinformatycznych sekwencjonowania nowej generacji: wspólna rekomendacja Stowarzyszenia Patologii Molekularnej i Kolegium Patologów Amerykańskich. J Mol Diagn 2018; 20: 4-27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Przeglądarka genomiki integracyjnej. Nat Biotechnol 2011; 29:24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Jednorodność fenotypowa prezentacji podobnej do choroby Huntingtona w rodzinie SCA17. Neurologia 2006; 67: 1701-03.

30 Schneider SA, Choroba Birda T. Huntingtona, sobowtóry choroby Huntingtona i łagodna pląsawica dziedziczna: co nowego? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Ostatnie postępy w wykrywaniu powtórzeń ekspansji za pomocą krótkiego odczytu sekwencjonowania nowej generacji. F1000Res 2018; 7:736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Bialleliczna ekspansja powtórzenia intronowego w RFC1 jest częstą przyczyną ataksji o późnym początku. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Ekspansje intronowych powtórzeń TTTCA i TTTTA w łagodnej rodzinnej padaczce mioklonicznej dorosłych. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Niekodujące ekspansje powtórzeń CGG w neuronalnej chorobie inkluzyjnej wewnątrzjądrowej, miopatii około-gardłowo-dystalnej i chorobie nakładającej się. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Szybka diagnostyka ataksji rdzeniowo-móżdżkowej 36 w rodzinie trzypokoleniowej przy użyciu krótkich danych z sekwencjonowania całego genomu. Nieład Mov 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Długotrwałe sekwencjonowanie pojawiające się w genetyce medycznej. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Zaburzenia ekspansji powtórnej: mechanizmy i terapeutyki. Neuroterapeutyka 2019; 16:924-27.

38 Narodowy System Zdrowia. National Genomic Test Directory: kryteria testowania chorób rzadkich i dziedzicznych. Październik 2021.