Granulat Yishen Qingli Heluo w leczeniu przewlekłej choroby nerek: analiza farmakologii sieciowej i walidacja eksperymentalna
Dec 07, 2023
Tło:Przewlekłą chorobę nerek(CKD) jest uważana za globalny problem zdrowia publicznego charakteryzujący się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Granulat Yishen Qingli Heluo (YQHG) jest przedstawicielemtradycyjna chińska Medycyna(TCM) lekarstwo naleczenie kliniczne PChN. Celem tego badania jest zbadanie mechanizmu YQHG w przewlekłej chorobie nerek poprzez farmakologię sieciową i walidację eksperymentalną.
Metody:Tradycyjne systemy medycyny chińskiejDo przeglądu aktywnych związków YQHG wykorzystano bazę danych farmakologii (TCMSP) i eksplorację szeroko zakrojonej literatury. Aby uzyskać odpowiednie cele YQHG i CKD, wykorzystaliśmy wiele narzędzi bioinformatycznych i internetowych baz danych. Cele przecięcia pomiędzy YQHG i CKD uznano za cele kandydujące. Skonstruowano i zwizualizowano sieci interakcji związek-cel, zioło-kandydat oraz białko-białko na potrzeby analiz topologicznych. Przeprowadzono analizy wzbogacania GO i KEGG w celu określenia procesów biologicznych i szlaków sygnalizacyjnych. Do weryfikacji wiarygodności farmakologii sieciowej wykorzystano dokowanie molekularne. Na koniec przeprowadzono ocenę farmakologiczną w celu zbadania mechanizmu YQHG przeciwko PChN w modelu nefrektomii 5/6.
Wyniki:Przeanalizowano siedemdziesiąt dziewięć potencjalnych celów, dziesięć podstawowych procesów biologicznych i jeden kluczowy szlak sygnalizacyjny (p53). Na podstawie sieci H-CT uznano PTGS2 za kluczowy cel. Dokowanie molekularne wykazało, że kwercetyna, kemferol i luteolina to trzy kluczowe związki o najlepszej aktywności wiążącej. Ponadto IL6 i kwercetyna mogą tworzyć stabilny kompleks o wysokim powinowactwie wiązania (-7,29 kcal/mol). Doświadczenia in vivo wykazały, że YQHG poprawia czynność nerek i zwłóknienie u 5/6 szczurów po nefrektomii. Ponadto w tkance nerek zaobserwowano zmniejszoną ekspresję PTGS2, IL6 i zwiększoną ekspresję p53. Warto zauważyć, że mikrobiota jelitowa szczurów leczonych YQHG została przekształcona, co charakteryzowało się zmniejszonym stosunkiem Firmicutes/Bacteroidota.
Wniosek: Nasze wyniki przewidziały i zweryfikowały potencjalne cele YQHGPChNz holistycznego punktu widzenia i zapewnił cenny kierunek dalszych badań nad YQHG.
Słowa kluczowe:Granulat Yishen Qingli Heluo, farmakologia sieciowa,przewlekłą chorobę nerek, Nefrektomia 5/6, mikroflora jelitowa
Wstęp
Przewlekłą chorobę nerek(CKD) jest coraz częściej uznawana za globalny problem zdrowia publicznego charakteryzujący się wysoką zachorowalnością (8724 na 100000 osób) i śmiertelnością (15,9 na 100000 osób).1 Czynniki ryzyka i ścieżki chorób, które prowadzić do upośledzenia czynności nerek są zróżnicowane i słabo wyjaśnione. W związku z tym dostępnych jest niewiele strategii opóźniających postęp PChN, przy czym większość obecnych strategii leczenia koncentruje się na zmniejszaniu białkomoczu oraz obniżaniu ciśnienia krwi i kwasu moczowego. Na przykład inhibitory układu renina-angiotensyna są głównymi lekami terapeutycznymi w leczeniu PChN pod względem zmniejszania białkomoczu i ochrony czynności nerek.2,3 Jednak w badaniu wykazano, że leki te mogą nie zapobiegać chorobie nerek.progresja PChNDoschyłkowa choroba nerek(ESRD);4 ponadto mogą powodować szereg skutków ubocznych, takich jak zwiększenie stężenia potasu i kreatyniny w surowicy oraz ryzyko raka.5-8 Obecnie liczba osób otrzymujących terapię nerkozastępczą przekroczyła 2,6 miliona i oczekuje się, że będzie nadal rosnąć do 2030 r. liczba ta podwoi się do 5,4 miliona na całym świecie.9 Kiedy CKD przejdzie do ESRD, będzie to nie tylko obciążenie ekonomiczne dla pacjentów, ale także w ogromnym stopniu wpłynie na jakość ich życia. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zbadania potencjalnych leków terapeutycznych do zapobiegania i leczenia PChN w tej dziedzinie.
Tradycyjną medycynę chińską (TCM) uznano za potencjalną opcję leczenia PChN ze względu na jej udowodnioną skuteczność, szeroki zakres zastosowań i niewielką liczbę skutków ubocznych. Wiele przypadków wykazało, że zioła TCM są uważane za alternatywne źródło opóźnienia postępu PChN ze względu na konwencjonalne doświadczenie i właściwości wielocelowe.10–12 Granulat Yishen Qingli Heluo (YQHG) został niezależnie opracowany przez Szpital Medycyny Chińskiej prowincji Jiangsu jako Środek TCM do klinicznego leczenia PChN. Badania kliniczne wykazały, że YQHG może złagodzić objawy kliniczne i obniżyć poziom kreatyniny w surowicy (Scr). Co więcej, YQHG może również opóźnić progresję CKD3 do CKD4.13,14 Nasze poprzednie badanie wykazało, że YQHG może łagodzić uszkodzenie nerek poprzez regulację autofagii, apoptozy i odpowiedzi zapalnej.15 Jednak większość badań dotyczących ziarnistości skupiała się głównie na niektórych klasycznych szlaków sygnalizacyjnych, takich jak MAPK, TGF i szlaki pokrewne, co wynikało z braku kompleksowości. Ze względu na brak w przeszłości skutecznych, systematycznych metod, badania nad skutecznymi związkami, celami i odpowiadającymi im mechanizmami farmakologicznymi YQHG przeciwko PChN są ograniczone. Dlatego też badania skupiły się na mechanizmie monomeru lub związku aktywnego YQHG w leczeniu PChN. Jednak YQHG jest jak wyrafinowana orkiestra różnych instrumentów. Wciąż wymaga zbadania, w jaki sposób te 10 ziół współdziała ze sobą, tworząc doskonały repertuar. Dlatego ważne jest znalezienie nowych sposobów kompleksowego zrozumienia mechanizmów YQHG przeciwko PChN. Farmakologia sieciowa to najnowocześniejsza metodologia, którą po raz pierwszy zaproponował Hopkins.16 Metoda ta jest zgodna z holistycznym spojrzeniem na TCM. W ostatnich latach jest szeroko stosowana w celu wyjaśnienia mechanizmów TCM w leczeniu chorób przewlekłych, w tym PChN.17–19
W tym badaniu po raz pierwszy zastosowaliśmy podejście farmakologii sieciowej jako narzędzie do badania aktywnych związków YQHG i badania podstawowego mechanizmu działania w leczeniu PChN. Następnie zastosowano dokowanie molekularne w celu sprawdzenia wiarygodności farmakologii sieciowej. Ponadto zweryfikowaliśmy potencjał nefroprotekcyjny YQHG i kluczowe ekspresje docelowe u 5/6 szczurów po nefrektomii. Warto zauważyć, że poprzednie badania wykazały, że mikroflora jelitowa odgrywa ważną rolę w terapeutycznym działaniu TCM.20–22 Mikroflora jelitowa może zmienić skład chemiczny ziół TCM, powodując, że będzie ono miało inną biodostępność, aktywność biologiczną lub toksyczność niż prekursor. Zioła TCM mogą również zmieniać różnorodność i skład mikroflory jelitowej, aby złagodzić powiązane choroby.23 Dlatego też sekwencjonowanie 16S rRNA wykorzystuje się do analizy związku między ziołami TCM, przewlekłą chorobą nerek i profilem mikroflory jelitowej, co kładzie podwaliny pod dalsze badania nad YQHG. Szczegóły procesu analizy tego badania przedstawiono na rysunku 1.
Materiały i metody
Analizy farmakologiczne sieci
Pozyskiwanie związków aktywnych i powiązanych celów w YQHG Związki każdego zioła w YQHG uzyskano z bazy danych TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) i z szeroko zakrojonej literatury. Związki przefiltrowano przez system oceny ADME, w którym głównymi parametrami były biodostępność po podaniu doustnym (OB) i podobieństwo do leku (DL). OB większe lub równe 30% i DL większe lub równe 0,18 to wartości progowe metody filtrowania ADME zalecanej przez bazę danych TCMSP.24 TCMSP, STITCH (http://stitch.embl.de /), bazy danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) i Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) wykorzystano do identyfikacji celów odpowiadających każdemu aktywnemu związkowi w YQHG . Do standaryzacji wyników wykorzystano bazę danych Uniprot (https://www.uniprot.org/).
Połowy potencjalnych celów YQHG w leczeniu CKD Cele związane z CKD uzyskano z GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (http://www.omim.org/), DisGeNET (https:// www.disgenet.org/), bazy danych TTD (http://db.idrblab.net/ttd/) i MalaCards (https://www.malacards.org/). Wszystkie zebrane cele CKD i YQHG zostały połączone po standaryzacji w bazie danych Uniprot.
Kandydackie cele YQHG przeciwko CKD zostały zidentyfikowane przez platformę Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/web Tools/Venn/), a wyniki wykorzystano do dalszej analizy.
Budowa sieci
(1) Compound-target (C-T) network of YQHG: The data of active compounds and their corresponding targets were imported into Cytoscape software (v3.6.0, Boston, MA, USA) to construct the C-T interaction network. The degree centrality, betweenness centrality, and closeness centrality were evaluated by the Network Analyzer plug-in of Cytoscape software. According to the three topological parameters of each node, the key active compound of YQHG was selected and analyzed. (2) Herb-Candidate target (H-CT) network of YQHG: The data of 10 herbs and candidate targets were imported into Cytoscape software to construct the H-CT interaction network. The pie chart was used to indicate the herb to which the candidate target (represented by circular nodes) belonged. (3) Protein-protein interaction (PPI) network of candidate targets: The visualization of PPI network was obtained by combining the STRING database (https://string-db.org/) and Cytoscape software. The species were limited to Homo sapiens, and the PPI confidence score>0.9 to parametr filtrujący zalecany w bazie danych STRING.25 Węzły i krawędzie reprezentują odpowiednio potencjalne cele i interakcje białko-białko w sieci PPI. W tym badaniu wybrano podstawowe białka docelowe i zidentyfikowano je za pomocą parametru „Stopień”. Stopień wykorzystano do oceny ważności topologicznej węzłów w sieci, która została obliczona za pomocą wtyczki Network Analyzer do oprogramowania Cytoscape.
Analiza wzbogacania ścieżki GO i KEGG
Aby zbadać kluczowe warunki procesu biologicznego GO i krytycznych szlaków sygnalizacyjnych potencjalnych celów, do analizy wzbogacenia GO i KEGG wykorzystano pakiet R (clusterProfiler, wersja 4.1.0).26 Skorygowana wartość P<0.05 was considered statistically significant.
Dokowanie molekularne
W badaniu dokowania molekularnego wykorzystano oprogramowanie Autodock Vina 1.1.2 do określenia trybu wiązania i interakcji pomiędzy kluczowymi związkami aktywnymi YQHG i białkami koncentrującymi zidentyfikowanymi na podstawie analiz PPI i analizatora sieci. Podejście to obejmowało następujące główne etapy: (1) Przygotowanie cząsteczki liganda. Struktury 3D związków aktywnych pobrano w formacie mol2 z bazy danych TCMSP. Do otwarcia cząsteczki ligandu, dodania wodoru, ładunku gasteigera, wykrycia pierwiastka ligandu, wyszukania i zdefiniowania wiązania obrotowego i na koniec zapisania go w formacie pdbqt wykorzystano narzędzie AutodockTools 1.5.6. (2) Przygotowanie cząsteczki receptora. Struktury 3D białek koncentracyjnych pobrano z RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org). Do przesłania białka wykorzystano program AutodockTools 1.5.6. Po dodaniu wszystkich atomów wodoru, obliczeniu ładunku Gasteigera i połączeniu niepolarnego wodoru definiuje się go jako receptor i zapisuje w formacie pdbqt. (3) Ustawianie parametrów dokowania. Narzędzie AutoGrid do ustawiania parametrów skrzynki dokującej (współrzędne XYZ i rozmiar siatki). Aby zwiększyć dokładność obliczeń, wartość kompletności została ustalona na 20. (4) Wykonanie i wynik. Do dokowania półelastycznego wykorzystano oprogramowanie Autodock Vina 1.1.2, a jako ostateczną konfigurację dokowania wybrano najlepszą konfigurację. (5) Analiza i wizualizacja. Do analizy trybu dokowania wybrano konformację o najlepszym powinowactwie wiązania. Powinowactwo wiązania białka było mniejsze niż -5 kcal/mol, co sugeruje, że białko wykazywało pewną aktywność wiązania ze związkiem.27 Wyniki dokowania związku i białka o najlepszej konformacji analizowano i wizualizowano za pomocą oprogramowania PyMol.
Przygotowanie YQHG
YQHG (numer partii 20051031) składał się z 10 pojedynczych granulek TCM: Angelicae Sinensis Radix (Danggui, DG), Achyranthis Bidentatae Radix (Niuxi, NX), Centella Asiatica (L.) Urban (Jixuecao, JXC), Polygonati Rhizoma (Huangjing, HJ), Smilacis Glabrae Rhixoma (Tufuling, TFL), Radix Rhei Et Rhizome (Dahuang, DH), Pyrrosiae Folium (Shiwei, SW), Hedysarum Multijugum Maxim (Huangqi, HQ), Serissa Japonica (Thunb.) Thunb (Liuyuexue, LYX ), Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix (Huzhang, HZ), który został wyprodukowany przez Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. (Wuxi, Jiangsu, Chiny). Stosunki pojedynczej granulki TCM do odpowiedniego surowego leku podano w Tabeli 1. Autentyczność wszystkich powyższych granulek potwierdził profesor Wei Sun (Uniwersytet Medycyny Chińskiej w Nanjing, Nanjing, Jiangsu, Chiny). W tym badaniu do obliczenia dawek YQHG u szczurów zastosowano format dawkowania leku oparty na masie ciała (na kg).28 Obliczona przy masie ciała dorosłego człowieka wynoszącej 70 kg, równoważna dawka kliniczna przeliczona na szczury wyniosła 2,8 g/kg, co stanowiło stosowany jako średnia dawka YQHG. Niska dawka i wysoka dawka w tym badaniu stanowiły odpowiednio połowę i dwukrotnie średnią dawkę YQHG. Przeprowadzono UHPLC-MS w celu potwierdzenia stabilności i skuteczności ekstraktu YQHG.
Budowa Nefrektomii 5/6 i Administracji YQHG
Samce szczurów Sprague Dawley (SD) (nr 20210312Aazz0619000112, 6–8 tygodni, 200–230 g) dostarczyła firma Vital River Experimental Animal Co., Ltd. (Zhejiang, Chiny). Szczury trzymano w wolnym od specyficznych patogenów ośrodku doświadczalnym dla zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nanjing. W szczególności szczury trzymano w plastikowych klatkach i zapewniano im wystarczającą ilość standardowego pożywienia i wody. Warunki środowiskowe w pomieszczeniu, w którym hodowano szczury, obejmowały temperaturę (22 ± 2 stopnie), wilgotność (50 ± 10%) i 12/12-godzinny cykl światło/ciemność. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nanjing [numer zezwolenia 202101A047]. Wytyczne dotyczące dobrostanu zwierząt laboratoryjnych to Wytyczne dla zwierząt laboratoryjnych dotyczące etycznej oceny dobrostanu zwierząt (GB/T 35892–2018). Wszystkie operacje przeprowadzono w odpowiednim znieczuleniu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
PChN wywołano u 24 szczurów poprzez dwuetapową nefrektomię 5/6, jak opisano wcześniej.29 Procedura obu operacji była następująca: ablację 2/3 miąższu lewej nerki (omijając wnękę nerki), a następnie szybkie umieszczenie na powierzchnię nacięcia nałóż żelatynową gąbkę, aby zatamować krwawienie na 4–5 minut. Tydzień później wykonano prawostronną jednostronną nefrektomię. Szypułkę nerki podwiązano sterylnym szwem 3–0, a następnie wycięto prawą nerkę. Jamę brzuszną przepłukano 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby uniknąć pooperacyjnego zrostu brzucha po dwóch operacjach chirurgicznych. Indukcję i utrzymanie znieczulenia (zużycie izofluranu wynosiło odpowiednio 6 ml/h i 3 ml/h) podczas operacji przeprowadzono za pomocą urządzenia do znieczulania gryzoni (Yuyan-ABS). Jako kontrolę wykorzystano sześć szczurów, które przeszły pozorowaną operację. Szczury z CKD losowo podzielono na cztery grupy (n=6 w każdej grupie). Podgrupy i dzienne dawki substancji pobieranych przez sondę były następujące: I) Grupa modelowa (woda sterylna); II grupa niskodawkowa YQHG (1,4 g/kg YQHG); III) Średnia dawka YQHG (2,8 g/kg YQHG); IV) Wysoka dawka YQHG (5,6 g/kg YQHG). Podczas eksperymentu wszystkie szczury ważono dwa razy w tygodniu i odpowiednio dostosowywano dawki leku. Na koniec doświadczenia pobrano próbki moczu i kału od szczurów przed uśmierceniem. Do dalszych badań pobrano próbki krwi i tkanki nerek.
Odczynniki
Zestawy do oznaczania ilościowego białka Scr, azotu mocznikowego we krwi (BUN) i moczu (C011-2-1, C013-2-1, C035-2-1) zakupiono od Nanjing Jiancheng Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Chiny). Zestaw IL-6 ELISA (bsk00042) zakupiono od Nanjing Jinyibai Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Chiny). Zestaw do oznaczania stężenia białka BCA (PC0020) otrzymano od Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Pekin, Chiny). Przeciwciało anty-PTGS2 (ab179800), przeciwciało anty-p53 (ab227655), przeciwciało anty-GAPDH (ab181602) i kozie anty-królicze IgG H&L (HRP) (ab6721) zakupiono od Abcam (Cambridge, Wielka Brytania).
Scr, BUN i 24-godzinna ocena ilościowa białka w moczu
Poziomy białek Scr, BUN i 24-godzinnego moczu mierzono przy użyciu zestawów do oznaczania ilościowego białka Scr, BUN i moczu zgodnie z instrukcją. Wśród nich przeprowadzono oznaczenie ilościowe białka w moczu poprzez 24-godzinne zbieranie moczu w klatkach metabolicznych w dniu poprzedzającym uśmiercenie szczurów. Wzór jest następujący: Białko w moczu (mg/24h)=stężenie białka w moczu (mg/l)×24h objętość moczu (l).
Ocena histopatologiczna tkanek nerek
Nerki szczurów przepłukano wstępnie schłodzonym PBS (Solarbio), a następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie (biosharp). Z tkanki nerkowej zatopionej w parafinie wycięto skrawki (4 μm) i wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) lub trichromem Massona (Masson) (Solarbio). Obrazy z mikroskopu świetlnego wykonano przy użyciu cyfrowego skanera slajdów (specyfikacja typu: Pannoramic DESK, P-MIDI, P250; Firma: 3D HISTECH; Kraj: Węgry; Oprogramowanie do skanowania: Pannoramic Scanner). Etapy obliczania powierzchni zwłóknienia kłębuszkowego i kanalikowo-śródmiąższowego były następujące: Przede wszystkim za pomocą oprogramowania CaseViewer 2.4 wybrano obszar kłębuszkowy (cewkowo-śródmiąższowy) do obrazowania 40×. Spróbuj wypełnić chusteczką całe pole widzenia i upewnij się, że światło tła każdego obrazu jest spójne. Po drugie, oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0 przeprowadziło analizę obrazu, ustawiło piksel jako jednostkę standardową i dla każdego przekroju wybrano dwa pola widzenia. Na koniec oceniano obszar zwłóknienia, to znaczy procent obszaru zwłóknienia (%)=obszar zwłóknienia kłębuszkowego (cewkowo-śródmiąższowego)/obszar kłębuszkowy (cewkowo-śródmiąższowy) × 100%.
Analiza mikrobioty jelitowej
Kał wszystkich szczurów w pięciu grupach (Sham, Model, LD YQHG, MD YQHG, HD YQHG) zebrano do analizy mikroflory jelitowej. Cztery główne etapy sekwencjonowania mikroflory jelitowej były następujące: I) Ekstrakcja genomowego DNA: Całkowity DNA z kału ekstrahowano za pomocą zestawu EZNA® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) zgodnie z protokołami producenta. Stężenie i czystość DNA monitorowano na 1% żelu agarozowym. II) Amplifikacja PCR: Region V3-V4 genu 16S rRNA amplifikowano przy użyciu specyficznego startera (338F_806R) z kodem kreskowym. Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu do polimerazy DNA TransStart Fastpfu. III) Kwantyfikacja, mieszanie i oczyszczanie produktów PCR: Zapoznaj się ze wstępnymi wynikami ilościowego elektroforezy, do wykrycia i oznaczenia ilościowego produktów PCR zastosowano zestaw QuantiFluor™ -ST Assay Kit (Promega), a następnie zmieszano w odpowiednich proporcjach zgodnie z wymogami sekwencjonowania każdą próbkę. Następnie mieszaninę produktów PCR oczyszczono za pomocą zestawu do ekstrakcji żelowej GeneJET (Thermo Fisher Scientific). IV) Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie: Profilowanie przeprowadzono na platformie MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, Kalifornia). Do filtrowania danych sekwencjonowania 16S rRNA zastosowano szybką regulację długości krótkich odczytów (FLASH, wersja 1.2.11). Operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) wybrano przy 97% odcięciu podobieństwa, a oczyszczone amplikony sekwencjonowano na platformie Illumina MiSeq w Majorbio Biopharm Technology Co. Ltd. (Szanghaj, Chiny) zgodnie ze standardowymi protokołami.
Western Blot i ELISA
Całkowite białko z zamrożonych próbek nerek ekstrahowano buforem do lizy RIPA (Beyotime) zawierającym 1% PMSF (Beyotime). Stężenie białka oznaczono za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białka BCA (Solarbio) zgodnie z instrukcją. Białka rozdzielono w żelach SDS-PAGE i przeniesiono na membrany PVDF (Solarbio). Po zablokowaniu 5% BSA (Solarbio) membrany inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi PTGS2 (1:1000), p53 (1:1000), GAPDH (1:10 000) w temperaturze 4 stopni nocny. Następnie membrany przemyto TBST (Solarbio) i inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej z kozim anty-króliczym IgG H&L (HRP) (1:20 000). Błony inkubowano za pomocą zestawu do wykrywania ultraczułego ECL (Proteintech) przez 1–2 minuty, a następnie wykrywano w systemie obrazowania żelowego BIO-RAD ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, Kalifornia, USA). Wartości szarości pasm białkowych analizowano przy użyciu oprogramowania Image Lab (Bio-Rad).
Do tkanki nerkowej dodano PBS (1 ml/0,1 g), a elektrohomogenizowaną próbkę odwirowano w celu zebrania supernatantu. Następnie, zgodnie z instrukcją, do wykrycia ekspresji IL-6 zastosowano szczurzy zestaw ELISA IL-6.
Analiza statystyczna
Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SEM. Do analizy statystycznej i konstrukcji obrazu wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, Kalifornia, USA). Połączyliśmy wykresy QQ (rysunek uzupełniający 1) z testem Shapiro – Wilka, aby ocenić normalność danych. W przypadku danych o rozkładzie normalnym zastosowano jednokierunkową analizę ANOVA, a następnie test Tukeya. W przypadku danych o rozkładzie normalnym zastosowano test Kruskala – Wallisa, a następnie nieparametryczny test sumy rang Wilcoxona. P<0.05 was considered statistically significant.
Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kup więcej szczegółów specyfikacji:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
POBIERZ NATURALNY ORGANICZNY EKSTRAKT Z CISTANCHE Z 25% ECHINAKOZYDEM I 9% AKTEOZYDEM NA ZAKAŻENIE NEREK
