Zerumbone, tropikalny seskwiterpen imbiru Zingiber Officinale Roscoe, osłabia melanogenezę indukowaną przez MSH ​​w komórkach B16F10, część 1

Abstrakcyjny:Wykazano, że zerumbone (ZER), aktywny składnik rodziny Zingiberaceae, wykazuje kilka aktywności biologicznych, takich jak działanie przeciwzapalne, przeciwalergiczne, przeciwdrobnoustrojowe i przeciwnowotworowe; jednak nie badano go pod kątem właściwości przeciwmelanogennych. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że ZER i Zingiber są ekstraktami lekarskimi (ZO), które znacząco osłabiają akumulację melaniny w mysich melanogennych komórkach B16F10 stymulowanych hormonem stymulującym melanocyty (-MSH). Ponadto, aby wyjaśnić mechanizm molekularny, dzięki któremu ZER hamuje gromadzenie się melaniny, przeanalizowaliśmy ekspresję czynnika transkrypcyjnego związanego z melanogenezą, czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (MITF) i jego genów docelowych, takich jak tyrozynaza, białko związane z tyrozynazą 1 ( TYRP1) i białko 2 związane z tyrozynazą (TYRP2) w komórkach B16F10, które są stymulowane przez -MSH. Tutaj odkryliśmy, że ZER hamuje ekspresję genów melanogennych za pośrednictwem MITF po stymulacji -MSH. Dodatkowo komórki traktowane różnymi stężeniami zerumbonu i ZO wykazywały zwiększoną fosforylację kinaz 1 i 2 regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2), które biorą udział w mechanizmie degradacji MITF. Farmakologiczne hamowanie ERK1/2 przy użyciu U0126 wystarczająco odwróciło antymelanogenne działanie ZER, co sugeruje, że zwiększona fosforylacja ERK1/2 jest wymagana dla jego aktywności przeciwmelanogennej. Podsumowując, wyniki te sugerują, że ekstrakty ZER i ZO mogą być stosowane jako składniki aktywne w kosmetykach wybielających skórę ze względu na ich działanie antymelanogenne.

Według odpowiednich badań cistanche jest pospolitym ziołem znanym jako „cudowne zioło, które przedłuża życie”. Jego głównym składnikiem jestcistanozyd, który ma różne efekty, takie jakprzeciwutleniacz,przeciwzapalnyi promocji funkcji odpornościowych. Mechanizm pomiędzyCistancheIWybielanie skórypolega na działaniu przeciwutleniającym cistancheglikozydy. Melanina w ludzkiej skórze jest wytwarzana przez utlenianie tyrozyny katalizowane przeztyrozynaza, a reakcja utleniania wymaga udziału tlenu, więc wolne rodniki tlenowe w organizmie stają się ważnym czynnikiem wpływającym na produkcję melaniny. Cistanche zawiera cistanozyd, który jest przeciwutleniaczem i może w ten sposób zmniejszać wytwarzanie wolnych rodników w organizmiehamowanie produkcji melaniny.

Kliknij Jak korzystać z Cistanche

Po więcej informacji:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Słowa kluczowe:zumba; Zingiber officinal Roscoe; melanogeneza; MITF; ERK1/2

1. Wstęp

Melanogeneza, produkcja melaniny przez melanocyty naskórka, jest stymulowana przez hormon stymulujący melanocyty (-MSH), który jest wydzielany z keratynocytów pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (UV) [1,2]. Czynnik komórek macierzystych (SCF) jest kolejnym czynnikiem melanogennym, który ściśle kontroluje migrację, proliferację i różnicowanie melanocytów w celu utrzymania melanogenezy skóry po urodzeniu [3]. Czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią (MITF), który jest melanogennym czynnikiem transkrypcyjnym, jest aktywowany przez szlak sygnałowy cAMP-PKA-CREB (cykliczny adenozynomonofosforan-białkowa kinaza A-cAMP element wiążący element odpowiedzi białko) po stymulacji -MSH przez receptor melanokortyny 1 (MC1R) w błonach cytoplazmatycznych melanocytów naskórka [4]. Wiadomo, że kilka substancji chemicznych, takich jak forskolina i IBMX (3-izobutyl-1-metyloksantyna), aktywuje szlak sygnałowy cAMP-PKA-CREB, prowadząc do indukcji melanogenezy [5]. Kilka badań wykazało, że podtrzymywana aktywacja regulowanych zewnątrzkomórkowo kinaz 1 i 2 (ERK1/2), która bierze udział w molekularnym mechanizmie onkogenezy, promuje fosforylację MITF w Ser73 i jej późniejszą degradację poprzez proteolizę zależną od ubikwityny [6,7]. ]. Rzeczywiście, doniesiono, że U0126, selektywny inhibitor szlaku ERK1/2, zwiększa ekspresję MITF i aktywność tyrozynazy, prowadząc do produkcji melaniny [6]. Stabilizowany i aktywowany MITF zwiększa ekspresję genów melanogennych, takich jak tyrozynaza, białko 1 związane z tyrozynazą (TYRP1) i białko 2 związane z tyrozynazą (TYRP2). Przemiana tyrozyny do 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (L-DOPA), która jest początkowym etapem melanogenezy, jest katalizowana przez tyrozynazę. Białka związane z tyrozynazą (TRP) katalizują dalsze reakcje utleniania i tautomeryzacji [8]. Po syntezie melaniny dojrzała melanina jest transportowana z melanocytów naskórka do cytoplazmy podstawnych keratynocytów w celu ochrony komórek przed promieniowaniem UV [2].

Nienormalnie zwiększona melanogeneza powoduje wiele rodzajów chorób skóry, takich jak rak skóry, ostuda i piegi [4]; w związku z tym małe cząsteczki lub produkty naturalne, których celem jest aktywność katalityczna tyrozynazy lub regulatory szlaków sygnałowych w melanogenezie, w tym ERK1/2 lub transkrypcja genów melanogennych za pośrednictwem MITF, zostały zidentyfikowane jako składniki aktywne do wykorzystania w kosmetykach przemysł. Kilka małych cząsteczek, takich jak kwas kojowy, arbutyna i niacynamid, jest szeroko stosowanych jako składniki kosmetyków ze względu na ich działanie antymelanogenne. Jednak doniesienia wykazały, że kwas kojowy powoduje wiele skutków ubocznych, w tym cytotoksyczność, zapalenie skóry, raka skóry i raka wątrobowokomórkowego, ze względu na jego działanie genotoksyczne [9]. Chociaż arbutyna wyizolowana z rośliny mącznicy lekarskiej była stosowana w leczeniu zaburzeń hiperpigmentacyjnych, ostatnio jej stosowanie jako składnika kosmetycznego zostało ograniczone ze względu na kilka skutków ubocznych [9]. Istnieją doniesienia, że ​​niacynamid ma działanie przeciwmelanogenne, a działanie to realizowane jest poprzez hamowanie transferu melanosomów z melanocytów do otaczających keratynocytów [10]. W związku z tym był powszechnie stosowany jako związek wybielający skórę w przemyśle kosmetycznym. Aby przezwyciężyć ograniczenia znanych środków wybielających skórę, które mają kilka skutków ubocznych, ważne jest opracowanie bezpiecznych składników wybielających skórę pochodzących z naturalnych źródeł. Na przykład -tujaplicyna, linderanolid B, 4-butylorezorcynol i plumbagina zostały zidentyfikowane jako związki przeciwmelanogenne ze względu na ich działanie hamujące tyrozynazę [4,11]. Nobiletyna, witaferyna A, sesamol i chaetocyna wykazują właściwości antymelanogenne poprzez modulację pośrednich sygnałów w szlaku melanogenezy [11].

Zerumbone (ZER) jest produktem naturalnym, który jest izolowany z lotnych olejków eterycznych roślin należących do rodziny Zingiberaceae, takich jak Zingiber zerumbet Smith i Zingiber officinal Roscoe [12]. Kilka badań wykazało, że ZER ma szeroki zakres aktywności biologicznych, w tym działanie przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutleniające, przeciwcukrzycowe, przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, przeciwalergiczne i przeciwangiogenne [12]. Co ciekawe, wykazano, że ZER wywiera działanie ochronne przed uszkodzeniami oksydacyjnymi keratynocytów skóry wywołanymi promieniowaniem ultrafioletowym A (UVA), dzięki swojej zdolności do wychwytywania reaktywnych form tlenu (ROS) poprzez aktywację jądrowego czynnika E{{8} }czynnik powiązany{9}} (Nrf2) [1,13]. Sugeruje to, że ZER może być stosowany jako dodatek funkcjonalny w kosmetykach do pielęgnacji skóry. Jednak szczegółowy mechanizm antymelanogennych właściwości działania ZER nie został jeszcze zbadany.

W niniejszym badaniu zbadano hamujące działanie ekstraktu ZER i Zingiber officinal (ZO) na melanogenezę stymulowaną przez -MSH i ich podstawowe mechanizmy. Tutaj pokazujemy, że ZER znacząco hamuje melanogenezę indukowaną przez -MSH poprzez regulację w górę fosforylacji ERK1 / 2 i hamowanie ekspresji genów melanogennych za pośrednictwem MITF.

2. Wyniki

2.1. Zerumbone (ZER) hamuje melanogenezę indukowaną przez MSH ​​w mysich komórkach czerniaka B16F10

Aby zbadać antymelanogenne działanie zerumbonu (ZER), wstępnie oceniliśmy jego cytotoksyczność zarówno w komórkach B16F10, jak i HaCaT. Struktura chemiczna ZER jest pokazana na rycinie 1A. Zaobserwowano, że ZER w stężeniach powyżej 20 µM wykazywał silne działanie cytotoksyczne, podczas gdy przy stężeniach poniżej 20 µM ZER nie wykazywał cytotoksyczności w obu liniach komórkowych (Figura 1B). Następnie zbadaliśmy hamujący wpływ ZER na akumulację i wydzielanie melaniny wywołane przez hormon stymulujący melanocyty (-MSH) w komórkach B16F10. Wykazano, że ZER silnie hamuje wewnątrzkomórkową akumulację melaniny indukowaną przez -MSH i jej wydzielanie do pożywki hodowlanej (Figura 1C, D). Ponadto stwierdziliśmy, że ZER osłabia melanogenezę skuteczniej niż 1 mM arbutyna lub 0,2 mM kwas kojowy, dobrze znane aktywne składniki kosmetyków wybielających skórę (Rysunek 1D). Aby wyjaśnić, czy ZER jest wystarczający do zahamowania melanogenezy w komórkach ludzkich, użyliśmy ludzkich komórek czerniaka G361 wytwarzających melaninę. Jak pokazano na rycinie 1E, ZER znacznie zmniejsza zawartość poza- i wewnątrzkomórkowej melaniny indukowanej przez czynnik komórek macierzystych (SCF). Wyniki te potwierdzają antymelanogenną aktywność ZER w melanogennych mysich komórkach B16F10 i ludzkich G361.

2.2. Zerumbone hamuje ekspresję genów czynnika transkrypcyjnego melanogenezy, MITF i jego docelowych genów w ludzkich komórkach czerniaka G361 

Doniesiono, że sygnalizacja endoteliny -1 i SCF odgrywa zasadniczą rolę w melanogenezie w ludzkich melanocytach i kilku podtypach czerniaka [3,14–16]. W tym badaniu odkryliśmy, że ZER hamuje melanogenezę po bodźcach melanogennych, -MSH i SCF, w mysich komórkach czerniaka B16F10 i ludzkim G361 (ryc. 1).

W ten sposób zmierzyliśmy zmiany w poziomach ekspresji genów i białek związanych z melanogenezą po stymulacji SCF w ludzkich komórkach czerniaka G361. Stwierdziliśmy, że ZER osłabia indukowaną przez SCF ekspresję białka MITF i tyrozynazy odpowiednio 2–4 godziny i 24–48 godzin po stymulacji SCF (ryc. 2A). Ponadto ekspresja genów genów związanych z melanogenezą, takich jak MITF, tyrozynaza i białko 1 związane z tyrozynazą (TYRP1) została stłumiona w komórkach G361 traktowanych ZER (ryc. 2B, C). Wyniki te ujawniły szczytowy czas ekspresji genów związanych z melanogenezą po stymulacji SCF; maksymalną indukcję mRNA MITF obserwowano w ciągu 1–2 godzin, a poziomy mRNA tyrozynazy i TYRP1 osiągały maksimum 24–48 godzin po stymulacji SCF.

2.3. Zerumbone hamuje ekspresję melanogennych genów i enzymów w mysich komórkach B16F10

Aby zbadać mechanizm molekularny, za pomocą którego ZER hamuje melanogenezę, zmierzyliśmy ekspresję genów czynnika transkrypcyjnego melanogenezy, MITF i jego genów docelowych, takich jak białko 1 związane z tyrozynazą (TYRP1), tyrozynaza i białko 2 związane z tyrozynazą (TYRP2) w przypadku braku lub obecności ZER. Ponieważ szczytowy czas ekspresji genów związanych z melanogenezą po stymulacji SCF i -MSH jest znany odpowiednio dla ludzkich komórek czerniaka G361 (ryc. 2) i mysich B16F10 [4], dalej mierzyliśmy ekspresję MITF, tyrozynazy, TYRP1 i TYRP2 w mysich komórkach czerniaka B16F10 traktowanych ZER po 2 godzinach lub 48 godzinach inkubacji z -MSH. Figura 3A pokazuje, że ZER jest wystarczający do osłabienia indukowanej przez -MSH ekspresji MITF, TYRP1, TYRP2 i tyrozynazy w komórkach B16F10. Podobnie poziomy ekspresji białek MITF, tyrozynazy i TYRP2 zostały obniżone po leczeniu ZER. Fosforylacja CREB za pośrednictwem kinazy białkowej A (PKA) jest głównym szlakiem sygnałowym zwiększającym MITF na poziomie transkrypcji po stymulacji -MSH [4]. Dlatego tutaj przeanalizowaliśmy, czy zmniejszona fosforylacja CREB przez ZER może pośredniczyć w supresji MITF. Stwierdziliśmy, że na fosforylację CREB indukowaną przez -MSH nie miało wpływu traktowanie ZER, co sugeruje, że ZER hamuje ekspresję MITF indukowaną przez -MSH niezależnie od osi szlaku sygnałowego PKA-CREB (Figura 3B). Ponieważ tyrozynaza jest enzymem ograniczającym szybkość, który reguluje syntezę melaniny [2,4,11], dalej analizowaliśmy wewnątrzkomórkowe poziomy białka tyrozynazy i jej aktywność enzymatyczną po leczeniu arbutyną, kwasem kojowym i ZER. Figura 3C pokazuje, że ZER wystarczająco zmniejsza poziomy białka tyrozynazy indukowanej -MSH w komórkach B16F10. Ponadto Rycina 3D ujawnia, że ​​10 µM ZER skuteczniej hamuje utlenianie L-DOPA niż inhibitory tyrozynazy, arbutyna i kwas kojowy, co sugeruje, że utlenianie L-DOPA do dopachinonu poprzez aktywność enzymatyczną tyrozynazy jest tłumione w komórkach traktowanych ZER . Wyniki te pokazują, że ZER osłabia melanogenezę, w której pośredniczy -MSH, poprzez tłumienie ekspresji genów MITF, czynnika transkrypcyjnego związanego z melanogenezą i jego genów docelowych.

2.4. Anty-melanogenne działanie Zerumbone polega na fosforylacji ERK1/2

Wiadomo, że aktywacja kinazy białkowej B (AKT) i kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2) przez czynniki wzrostu lub bodźce melanogenne hamuje melanogenezę poprzez zmniejszoną ekspresję MITF i jego docelowych genów [11]. Fosforylacja MITF w Ser73 i Ser409 w odpowiedzi na szlak sygnałowy ERK1/2 promuje jego zależną od proteasomu degradację [17,18]. Dlatego zbadaliśmy, czy ZER reguluje fosforylację ERK1 / 2 w mysich komórkach czerniaka B16F10 i G361. Zwiększoną fosforylację ERK1/2 (p-ERK1/2), ale nie całkowitą ERK1/2 (T-ERK1/2) obserwowano po leczeniu ZER w sposób zależny od czasu i dawki (ryc. 4A, B). Co ciekawe, zaobserwowano gwałtowny wzrost fosforylacji ERK1 / 2 w ciągu 10–30 minut i 1–2 godzin po leczeniu ZER w mysich komórkach czerniaka B16F10 i ludzkim G361 (ryc. 4A). Jednak fosforylacji AKT i MEK nie zaobserwowano po leczeniu ZER, co sugeruje, że fosforylacja ERK1 / 2 indukowana przez ZER może tłumić MITF (Figura 4B). Ponieważ fosforylacja ERK1/2 sprzyja fosforylacji i degradacji MITF w proteasomach [17,18], zbadaliśmy, czy inhibitor proteasomu zapobiega redukcji MITF przez ZER. Tłumienia MITF przez ZER nie zaobserwowano w obecności MG132, potwierdzając, że ZER zmniejsza ekspresję MITF poprzez degradację proteasomów (Figura 4C). Następnie zbadaliśmy, czy ZER fosforyluje MITF w Ser73, który jest docelową resztą ERK1/2. Aby wykryć ufosforylowany MITF, komórki eksponowano na -MSH i MG132. Tutaj odkryliśmy, że fosforylowany MITF (Ser73) był znacząco zwiększony przez ZER w obecności -MSH i MG132 (ryc. 4D). U0126, selektywny inhibitor kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) [19], znosi fosforylację MITF indukowaną przez ZER (ryc. 4D). Ponadto, całkowite poziomy białka MITF w lizatach całych komórek (WCL) nie zostały zmienione przez ZER i U0126 w obecności MG132 (Figura 4D). Wyniki te wskazują, że fosforylacja MITF (Ser73) za pośrednictwem ERK1/{67}} i degradacja proteasomów jest kluczowym mechanizmem w tłumieniu MITF za pośrednictwem ZER. Ponadto Figura 4E pokazuje, że U0126 znacząco przywrócił zmniejszone poziomy białka MITF w komórkach traktowanych ZER. Konsekwentnie, zmniejszona zawartość melaniny wewnątrzkomórkowej przez ZER została przywrócona przez U0126 do około 40 procent (ryc. 4F), co sugeruje, że aktywacja ERK1 / 2 jest wymagana do antymelanogennego działania ZER.

2.5. Anty-melanogenne działanie ekstraktów Zingiber Officinale (ZO).

ZER to fitochemikalia pochodzące z kilku gatunków roślin z rodziny Zingiberaceae, takich jak Zingiber zerumbet i Zingiber officinal [12]. Tak więc początkowo zmierzyliśmy żywotność komórek pod nieobecność lub w obecności ekstraktu ZO w komórkach B16F10 i HaCaT. Figura 5A pokazuje, że żywotność komórek nie została zmieniona przez traktowanie ekstraktem ZO. Następnie przeanalizowaliśmy antymelanogenne działanie ekstraktu Zingiber officinal (ZO). Ponieważ ekspresja MITF i jego docelowych genów melanogennych została zmniejszona przez ZER poprzez aktywowany szlak sygnałowy ERK1 / 2 (ryc. 2 i 3), sprawdziliśmy, czy ekstrakt ZO hamuje indukowaną przez -MSH ekspresję MITF i jego docelowych białek melanogennych w komórkach B16F10. Podobnie do antymelanogennego działania ZER, MITF, tyrozynaza i TYRP2 indukowane przez -MSH były znacznie zmniejszone przez ekstrakt ZO w sposób zależny od dawki (ryc. 5B). Co ciekawe, fosforylacja ERK1 / 2 była również zwiększona w komórkach traktowanych ekstraktem ZO (ryc. 5B). Ekspresja MITF i jego docelowych genów, takich jak tyrozynaza, TYRP1 i TYRP2, była znacznie zmniejszona po traktowaniu ekstraktem 5 µg/µl ZO (Figura 5C). Co więcej, zarówno zewnątrzkomórkowa, jak i wewnątrzkomórkowa zawartość melaniny została znacznie zmniejszona do około 40 procent po traktowaniu ekstraktem 5 µg/µl ZO (ryc. 5D). Ponadto zaobserwowano zmniejszoną aktywność tyrozynazy w komórkach traktowanych ekstraktem ZO (ryc. 5E). Wyniki te sugerują, że ekstrakt Zingiber officinal (ZO) hamuje melanogenezę poprzez osłabianie ekspresji genów melanogennych za pośrednictwem MITF.

Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501