Biwalentna, żywa, atenuowana szczepionka przeciwko wirusowi grypy chroni przed dryfującymi izolatami klinicznymi H1N2 i H3N2 u świń, część 1

Abstrakcyjny:

Wirusy grypy A (IAV) mogą powodować wysoce zaraźliwe choroby układu oddechowego u wielu gatunków ssaków. U świń IAV powodują wysoką zachorowalność i niską śmiertelność w podatnych populacjach, co może mieć znaczący wpływ na finanse i produkcję. Mogą również stwarzać możliwości mutacji i reasortacji genów, tworząc szczepy grypy o potencjale pandemicznym. Dlatego bardzo ważne jest zapobieganie i kontrolowanie zakażenia grypą u świń, a głównym sposobem na to jest szczepienie.

Wirus grypy A jest powszechną chorobą zakaźną układu oddechowego, która jest wysoce zaraźliwa i podatna na wiele osób. Szczególnie u osób z osłabionym układem odpornościowym wirusy grypy typu A mogą powodować poważniejsze problemy zdrowotne. Dlatego bardzo ważne jest utrzymanie wystarczającej odporności, aby zapobiec zakażeniu wirusem grypy A.

Układ odpornościowy naszego organizmu jest pierwszą linią obrony przed wirusami i bakteriami atakującymi organizm. Podstawową funkcją układu odpornościowego jest opieranie się inwazji patogenów poprzez białe krwinki, limfocyty i przeciwciała, aby utrzymać zdrowie organizmu. Dlatego dobra funkcja immunologiczna jest ważnym środkiem ochronnym chroniącym nas przed różnymi chorobami zakaźnymi.

Jednocześnie niektóre zdrowe nawyki życiowe mogą również pomóc wzmocnić odporność. Takich jak utrzymywanie odpowiedniego snu, umiarkowane ćwiczenia, zbilansowana dieta, zmniejszanie stresu i tak dalej. Te nawyki życiowe mogą promować produkcję hormonów i czynników odpornościowych w organizmie, wzmacniając nasz układ odpornościowy.

Oprócz swoich pozytywnych działań możesz również zwiększyć odporność swojego organizmu poprzez szczepienie. Obecnie istnieje szczepionka przeciwko wirusowi grypy A, która może skutecznie zapobiegać zakażeniu wirusem grypy i zmniejszać ryzyko zachorowania poprzez szczepienie. Szczególnie w przypadku grup wrażliwych, takich jak osoby starsze, dzieci i kobiety w ciąży, należy zwrócić większą uwagę na szczepienia.

Należy zauważyć, że odporność naszego organizmu nie jest statyczna, ale zmienia się wraz z czynnikami takimi jak wiek i środowisko. Dlatego zawsze musimy zwracać uwagę i dostosowywać nasz styl życia, aby zachować dobrą odporność.

Podsumowując, odpowiednia odporność jest ważnym środkiem zapobiegania zakażeniu wirusem grypy A. Poprzez dostosowanie schematów zdrowotnych, takich jak sen, ćwiczenia i dieta, a także szczepienia, możemy sprawić, że nasze ciała będą zdrowsze i bardziej odporne na ataki wirusów. Widać, że musimy poprawić odporność. Cistanche może znacznie poprawić odporność. Polisacharydy w mięsie mogą regulować odpowiedź immunologiczną ludzkiego układu odpornościowego, poprawiać odporność komórek odpornościowych na stres i wzmacniać działanie bakteriobójcze komórek odpornościowych.

Kliknij zalety Cistanche Tubulosa

Podtypy IAV najbardziej rozpowszechnione u świń na całym świecie to H1N1, H1N2 i H3N2; jednak różnorodność genetyczna tych wirusów może się znacznie różnić w zależności od regionu. Wcześniej opracowaliśmy zależną od elastazy, żywą, atenuowaną szczepionkę biwalentną, wykorzystując dwa izolaty kanadyjskiego wirusa świńskiej grypy typu A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] i A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2 ) [SD69], który chronił przed szczepami homologicznymi. W tym badaniu wykazaliśmy, że ta szczepionka rozszerza ochronę u świń na bardziej aktualne, dryfujące niehomologiczne szczepy H1N2 i H3N2, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] i A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

Szczepionka wywołała silną odpowiedź immunologiczną w surowicy i płucach oraz zmniejszyła replikację wirusa, jak również patologię płuc związaną z tymi szczepami. Dlatego ta dwuwartościowa szczepionka pozostaje silnym kandydatem, który byłby korzystny dla rynku szczepionek przeciwko świńskiej grypie w Ameryce Północnej.

Słowa kluczowe:

Grypa; szczepionka; wieprz.

1. Wstęp

Wirusy grypy typu A (IAV) są znaczącym patogenem wielu gatunków, w tym świń. Infekcja może powodować wysoce zakaźne choroby układu oddechowego u świń [1]. Zakażenie grypą u świń prowadzi do łagodnej choroby z bardzo niską śmiertelnością, ale zachorowalność w stadzie może sięgać 100 procent [2].

Powoduje to straty ekonomiczne dla rolników z powodu zmniejszonego przyrostu masy zakażonych świń, obniżonej wydajności produkcyjnej i niepowodzeń reprodukcyjnych u macior [3,4].

Koinfekcja grypy innymi patogenami układu oddechowego świń może również prowadzić do rozwoju zespołu chorób układu oddechowego świń, a w konsekwencji do zwiększonej śmiertelności i strat ekonomicznych [5].

Ponadto świnie są podatne na zakażenie ptasimi i ludzkimi IAV, jak również świńskimi IAV (swIAV) ze względu na obecność zarówno ptasich, jak i ssaczych wiązań kwasu sialowego galaktozy w ich drogach oddechowych [6].

Umożliwia to reasortację w przypadku koinfekcji wieloma szczepami, co może prowadzić do produkcji nowych szczepów o potencjale pandemicznym [4,7]. Ponieważ ludzie mają podobne rozmieszczenie wiązań galaktozy kwasu sialowego w drogach oddechowych, możliwe są dwukierunkowe zdarzenia rozprzestrzeniania się między ludźmi a świniami.

Pierwsze znane zdarzenie miało miejsce podczas pandemii grypy w 1918 r., kiedy IAV został wprowadzony do świń od ludzi [8]. Linia ta pozostawała stabilna w populacjach świń do lat 90. XX wieku, kiedy ludzkie i ptasie szczepy H3N2 uległy reasortacji z krążącą linią H1N1, tworząc podwójne i potrójne reasortowane szczepy podtypów H1N1, H1N2 i H3N2 [8,9].

Nowo opracowana kaseta potrójnego reasortantu genu (TRIG) doprowadziła do okresu gwałtownej dywersyfikacji IAV u świń w Ameryce Północnej [10]. Ta kaseta TRIG jest bardzo stabilna i ułatwia zastępowanie różnych kombinacji HA i NA [5].

Od 2005 roku wiele szczepów z tą wewnętrzną kasetą TRIG sparowaną z ludzkimi genami HA i NA rozprzestrzeniło się w stadach świń w USA [9]. Kolejne znaczące zdarzenie zewnętrzne miało miejsce w 2009 r., kiedy szczep H1N1 pochodzenia świńskiego (H1N1pdm2009) rozprzestrzenił się na ludzi, prowadząc do pandemii grypy w 2009 r. [11]. Transmisja z człowieka na świnię (odwrócona choroba odzwierzęca) ludzkiej pandemii H1N1 IAV (H1pdm) została wielokrotnie zarejestrowana u świń w Ameryce Północnej, co doprowadziło do ustanowienia nowej linii i nowych reasortacji swIAV [8,10,12].
W sumie u północnoamerykańskich świń zarejestrowano siedem różnych antygenowo kladów wirusów H1 i cztery odrębne klady wirusów H3 [5]. Niedawno program nadzoru swIAV w Azji zidentyfikował dominującego eurazjatyckiego wirusa podobnego do ptasiego (EA) reasortant genotypu 4 (G4), z H1pdm i potrójnymi reasortantowymi genami wewnętrznymi.

Ten wirus G4 został zmierzony u 10,4 procent przebadanych pracowników świń i przedstawia markery potencjału pandemicznego, ze zdolnością do przenoszenia na ludzi i inną antygenowością niż obecnie krążące ludzkie wirusy [7]. Dlatego bardzo ważne jest, aby zapobiegać i kontrolować infekcję grypą u świń zarówno z punktu widzenia przemysłu trzody chlewnej, jak i zdrowia publicznego, a głównym sposobem na to są szczepienia [4].

W USA najpowszechniejszym typem szczepionki jest cały inaktywowany wirus (WIV), ale zatwierdzono również szczepionkę zawierającą wektor RNA wykazujący ekspresję HA oraz NS1-żywą szczepionkę z atenuowanym wirusem grypy (LAIV) [4]. . Podtypy IAV najbardziej rozpowszechnione u świń na całym świecie, w tym w Ameryce Północnej, to H1N1, H1N2 i H3N2 [13].

Różnorodność genetyczna tych wirusów może jednak znacznie różnić się w zależności od regionu i istnieją różnice w ewolucji genetycznej swIAV w Kanadzie i USA, szczególnie w przypadku wirusów podtypu H1 [12]. Nadzór prowadzony w Kanadzie w latach 2009-2016 wykazał, że genetyczne klady H1, które dominowały w USA, H1g (1A.3.3.3) i H1d{11}} (1B.2.2), nie zostały wykryte w Kanadzie, a Wirusy H1 w Kanadzie bardzo różniły się od tych z USA [12].

Zidentyfikowano nowy klad H1 (H1a{2}}) w Kanadzie, który rozpoczął się w Manitobie i przeszedł szybki wzrost, zanim rozprzestrzenił się na cały kraj i do USA. Jeśli chodzi o wirusy H3, udokumentowano sześć linii H3 u świń amerykańskich (IV-A do IV-F), a trzy z nich stwierdzono u świń kanadyjskich (IV-B, IV-C i IV-E) [12]. ].

Podkreśla to znaczenie regionalnego nadzoru i świadomości krążących szczepów w celu informowania o skutecznych programach szczepień i wskazuje, że szczepionki zaprojektowane w oparciu o IAV krążące u świń amerykańskich mogą nie chronić kanadyjskich świń [12].

Wcześniej szczepionkę biwalentną stworzono przy użyciu dwóch kanadyjskich izolatów swIAV, A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] i A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), które są przedstawicielami wirusa H{{ 9}} grupy antygenowej i nowej grupy antygenowej H3 z zachodniej Kanady (klaster świń IV-E), odpowiednio [14]. Ta nowa szczepionka to szczepionka z żywym atenuowanym wirusem, wytworzona przy użyciu zależnych od elastazy form SD191 i SD69, SD191-R342V i SD69-K345V. Badania wykazały, że chroni on zarówno przed SD191, jak i SD69, a także heterologicznym szczepem H1N2 A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2), który również został wyizolowany z zachodniej Kanady [14].

Od tego czasu krążące szczepy swIAV nadal dryfują. Nowsze izolaty kliniczne od świń w zachodniej Kanadzie zostały zebrane i wyizolowane z próbek terenowych w Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] jest członkiem grupy antygenowej H -3, ale ma pięć podstawień aminokwasowych z 54 kluczowych miejsc antygenowych H1 w porównaniu z SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] jest członkiem klastra IV-E, ale dryfował, obejmując dwa podstawienia aminokwasów z sześciu kluczowych miejsc antygenowych H3 [17].

W tym badaniu oceniliśmy, czy dwuwartościowy LAIV zależny od elastazy wytrzymałby nowe izolaty kliniczne i możemy stwierdzić, że chroni świnie po prowokacji obecnie krążącymi szczepami swIAV SD467 (H1N2) i SD435 (H3N2).
2. Materiały i metody

2.1. Komórki i wirusy

Komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK) (ATCC, #CRL{1}}) utrzymywano w pożywce Minimal Essential Medium (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA) zawierającej 10 procent płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada 16000-044) i trzymano w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] i A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV wyizolowano z próbek terenowych w Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon , SK, Kanada.

Wirusy szczepionkowe SD191-R342V i SD{2}} K345V zostały uratowane, jak opisano wcześniej [14]. Wszystkie wirusy hodowano w komórkach MDCK w obecności 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) z 1 µg/ml L-[(toluenu{ {11}}sulfonamid)-2-fenylo]etylochlorometyloketon (TPCK)-trypsyna (wirusy WT) lub 0,5 µg/ml ludzkiej elastazy neutrofili (wirusy zależne od elastazy) (Sigma-Aldrich, E8140).

2.2. Projekt próbny na zwierzętach

Dwadzieścia cztery czterotygodniowe świnie swIAV-ujemne uzyskano z Prairie Swine Centre Inc. (Saskatoon, SK, Kanada). Te świnie wybrano losowo i podzielono na cztery grupy po siedem świń na grupę szczepioną i pięć świń na grupę szczepioną pozornie.

Przydział do grupy opisano na rycinie 1A.

Grupy te trzymano w oddzielnych pomieszczeniach w oparciu o grupy szczepień (grupy A plus B i C plus D trzymane razem) i pozwolono na aklimatyzację przez siedem dni przed zakażeniem. W wieku pięciu tygodni (dzień 0), jak również w wieku ośmiu tygodni (dzień 21), świnie z grup A i B zostały zaszczepione dotchawicznie 4 ml MEM, podczas gdy grupy C i D zostały zaszczepione ze szczepionką biwalentną zawierającą 1 × 106 PFU każdego SD191-R342V i SD69-K345V w 4 ml MEM.

Dziesięć dni później (dzień 31) świnie poddano prowokacji MEM (pozorna) lub 1 x 106 PFU albo SD435-WT (H3N2) albo SD467-WT (H1N2). Świnie monitorowano przez pięć dni po prowokacji, codziennie mierzono temperaturę w odbycie i pobierano wymazy z nosa z obu nozdrzy w dniach 1, 3 i 5. Surowicę pobierano po pierwszym (dzień 20) i drugim (dzień 30) szczepieniu dla test neutralizacji wirusa w surowicy (SVN) i test immunoenzymatyczny (ELISA).

W dniu 5 po prowokacji wszystkie świnie humanitarnie uśmiercono, a płuca wyekstrahowano i oceniono pod kątem obecności makroskopowych zmian charakterystycznych dla swIAV. Pobrano również próbki tkanki płucnej w celu izolacji wirusa (ryc. 1B).

2.3. Oświadczenie dotyczące etyki

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet Opieki nad Zwierzętami (UACC) i Radę ds. Etyki Badań nad Zwierzętami (AREB) Uniwersytetu Saskatchewan. Niniejszy protokół został zatwierdzony 12 listopada 2021 r. (Protokół stosowania przez zwierzęta nr 20190064). Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie ze standardami wymaganymi przez Canadian Council of Animal Care (CCAC) przy Vaccine and Infectious Disease Organization (VIDO), University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada.

2.4. Próbowanie

Wymazy z nosa z każdego nozdrza umieszczono w 1 ml MEM zawierającej 1 x antybiotyk przeciwgrzybiczy (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada, 15240-062) i zamrożono w temperaturze -80°C do czasu wykonania qRT-PCR. Wszystkie świnie humanitarnie uśmiercono przez dożylne podanie etanolu (240 mg/ml pentobarbitalu sodu; 2 ml na 4,5 kg). Po eutanazji płuca usunięto w całości w celu określenia zarówno procentu fioletowo-czerwonych, twardych zmian, jak i zapalenia płuc.

Procenty określono na podstawie masy płatów płucnych oraz całkowitej objętości płuca [18]. Próbki płuc pobrano również z prawego płata wierzchołkowego, sercowego i przeponowego w celu miareczkowania wirusa. Te próbki płuc zmieszano w równych objętościach 10% wag./obj. MEM zawierającej 1x antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy do miareczkowania.

Rycina 1. Grupowanie świń i projekt badania do oceny skuteczności ochronnej dwuwartościowego LAIV wobec nowych izolatów klinicznych. Świnie (n=5 dla grup MEM/MEM i n=7 dla grup biwalentnych/dwuwalentnych) szczepiono dotchawiczo 4 ml MEM lub szczepionką biwalentną złożoną z 1 × 106 PFU każdego SD191-R342V i SD69-K345V w dniach 0 i 21.

W dniu 31 świnie poddano prowokacji dotchawiczej MEM lub 1 × 106 PFU SD435 (H3N2) lub SD467 (H1N2). (A) Harmonogram immunizacji, prowokacji i pobierania próbek do tego badania na zwierzętach. Dwadzieścia cztery czterotygodniowe świnie swIAV-ujemne pozwolono na aklimatyzację przez siedem dni przed zakażeniem. W wieku pięciu tygodni (dzień 0) oraz w wieku ośmiu tygodni (dzień 21) świnie z grup A i B zaszczepiono dotchawiczo pozornie 4 ml MEM, podczas gdy grupy C i D zaszczepiono szczepionką biwalentną zawierające 1 × 106 PFU każdego SD191-R342V i SD69-K345V w 4 ml MEM.

Dziesięć dni później (dzień 31) świnie poddano prowokacji MEM (pozorna) lub 1 x 106 PFU albo SD435-WT (H3N2) albo SD467-WT (H1N2). Świnie monitorowano przez pięć dni po prowokacji, codziennie mierzono temperaturę w odbycie i pobierano wymazy z nosa z obu nozdrzy w dniach 1, 3 i 5.

Surowicę zebrano po pierwszym (dzień 20) i drugim (dzień 30) szczepieniu. W dniu 5 po prowokacji (dzień 36) wszystkie świnie humanitarnie uśmiercono i płuca pobrano do oceny. (B) Utworzono za pomocą BioRender.com.

For more information:1950477648nn@gmail.com