Homozygotyczny Dab1−// jest potencjalną nową przyczyną autosomalnych recesywnych wrodzonych anomalii nerek i dróg moczowych myszy

edmund.chen@wecistanche.com

Wprowadzenie

Myszy z mutacją Yotari, uzyskane przez spontaniczne nabycie mutacji w genie Dab1, wykazują nieprawidłowości histologiczne w ośrodkowym układzie nerwowym [1,2], bardzo podobne do myszy reeler (reelin//), co sugeruje, że reelina i DAB1 należą do tego samego szlaku sygnałowego [1–4]. Aberracje w szlaku reelin/DAB1 są związane z różnymi zaburzeniami psychicznymi [5–7]. Co ciekawe, oprócz ośrodkowego układu nerwowego obecność DAB1 i białek reeliny została potwierdzona również w obwodowym układzie nerwowym i niektórych tkankach pozanerwowych. Obecność DAB1 stwierdzono u mysich podocytów [8] i płodu ludzkiegoNerki[9] podczas gdy ekspresja reeliny została zgłoszona podczas rozwoju myszy i płodu ludzkiego, a także w niektórych komórkach śródbłonka wzdłuż naczyń krwionośnych u dorosłych myszy [9–11]. Szlak kanoniczny reelina/DAB1 może wyzwalać różne białka niższego szczebla, w tym receptory NOTCH2, które odgrywają kluczową rolę w podejmowaniu decyzji o losie komórki i różnicowaniu podczasnerkarozwój [12–14]. Receptory NOTCH2 są wymagane do tworzenia proksymalnych kanalików i podocytów [13], ale po osiągnięciu dojrzewania nefronu szlak ten jest w większości wyciszony [15]. W warunkach ostrychchoroby nerek,zwiększona ekspresja NOTCH2 może potencjalnie przyczyniać się do regeneracji, podczas gdy trwała ekspresja jest przyczynowo związana ze zwłóknieniem śródmiąższowym i stwardnieniem kłębuszków nerkowych [15]. Regulacja w dół sygnalizacji NOTCH może znacznie zmniejszyć autofagię i spowodować upośledzenie różnicowania podocytów podczas rozwoju [16].

W związku z tym dysfunkcyjne podocyty odgrywają kluczową rolę w chorobie kłębuszków nerkowych, szczególnie w ludzkim idiopatycznym zespole nerczycowym [17,18] i w zespole nerczycowym o minimalnej zmianie (MCNS) [19]. W związku z tym autofagia utrzymuje homeostazę komórkową w normalnych warunkach fizjologicznych, podczas gdy w warunkach patologicznych może przejść w śmierć autofagiczną [20]. Szeroko stosowanym biomarkerem autofagii jest LC3B, białko strukturalne błon autofagosomalnych [21]. Złożony przesłuch między autofagią a apoptozą przyczynia się również do utrzymania równowagi homeostatycznej w odpowiedzi na mikrośrodowisko komórki. Powszechnie wiadomo, że liczba zdarzeń apoptotycznych wzrasta podczasnerkarozwój [22] i znacznie zmniejszają się po zakończeniu dojrzewania, z wyjątkiem warunkówuszkodzenie nerek[23]. Niezaprzeczalnie apoptoza jest złożonym mechanizmem regulowanym przez wzajemne oddziaływanie kilku szlaków, ale głównie fifinishes z aktywacją kaspazy3 (CASP3), której aktywacja jest jednym z najczęściej stosowanych markerów do wykrywania apoptozy [23].

W tym raporcie staraliśmy się przeanalizować, w jaki sposób funkcjonalne wyciszanie wpływów genu Dab1nerkamorfologia oraz ekspresja i lokalizacja reelin, NOTCH2, LC3B i rozszczepionych białek CASP3 u myszy poporodowychNerki. Zakładamy, że białka te ulegają ekspresji u myszy poporodowejnerkaa ich funkcjonalne wzajemne oddziaływanie przyczynia się do utrzymania ich struktury i funkcji. Ponadto, ponieważ obecność DAB1 została potwierdzona podczas płodu ludzkiegonerkarozwój [9], można domniemywać, że jego inaktywacja może powodować zaburzenia w szerokim spektrum wrodzonych anomaliinerkai dróg moczowych (CAKUT).

Słowa kluczowe:yotari; czynność nerek; poporodowy rozwój nerek; barwienie immunoflfluorescencyjne; transmisyjna mikroskopia elektronowa

CISTANCHE POPRAWI CZYNNOŚĆ NEREK/NEREK

Materiały i metody

Pobieranie próbekJako konwencjonalne mutanty Dab1 null użyliśmy myszy yotari (Dab1 /) opisanych wcześniej przez Howella i in. [24]. Starterami PCR stosowanymi do genotypowania myszy były yotari: GCCCTTCAGCATCACCATGCT i CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, dziki typ locus Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT i CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Myszy C57BL/6 N hodowano i grupowano w standardowych klatkach poliwęglanowych (w tym co najmniej po jednym z każdego genotypu) z ad libitum dostępem do żywności i wody w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ± 2 ◦C) z 12-godzinnym cyklem światła / ciemności. W dniach poporodowych 4, 11 i 14 (P4, P11 i P14) myszy były głęboko znieczulone pentobarbitalem i perfundowane przez 10 minut roztworem soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS, pH 7,2) i 4% paraformaldehydem (PFA) w 0,1 M PBS.Nerkiusunięto i spreparowano 4% PFA w 0,1 M PBS na noc do konwencjonalnych analiz histologicznych (hematoksylina-eozyna (H&E), barwienie immunohistochemiczne i immunoflfluorescencyjne) oraz w mieszaninie 2% PFA + 2,5% aldehydu glutarowego (GA) do badania mikroskopem elektronowym. Po fifiksacji tkanka została przygotowana do dalszego badania histologicznego, jak opisaliśmy wcześniej [25,26].

Barwienie immunoflfluorescencyjne i immunoperoksydazyPo deparafifinizacji i ponownym nawodnieniu sekcje ogrzewano przez 20 minut w buforze cytrynianowym 0,01 M (pH 6,0) w parowcu wodnym, a następnie schładzano do temperatury pokojowej. Bufor blokujący (ab 64226, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) był stosowany przez 30 minut, aby wykluczyć niespecyficzne zabarwienie. Sekcje inkubowano następnie w komorze wilgotności przez noc z przeciwciałami pierwotnymi (Tabela 1). Po przemyciu w PBS przeciwciała wtórne (Tabela 1) nakładano przez godzinę i ponownie przemywano w PBS. Następnie jądra barwiono 4060-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) przez 2 minuty, myto w PBS i przykrywano. Przeprowadziliśmy test preadsorpcji, aby każde pierwotne przeciwciało zostało użyte z odpowiednim peptydem i zastosowaliśmy ich kombinację do sekcji. Wyniki nie wykazały zabarwienia przeciwciałami. Ponadto przeprowadzono kontrole z pominięciem przeciwciała pierwotnego w celu określenia poziomów niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych.

W przypadku barwienia immunoperoksydazy królik poliklonalny anty-CASP3 (rozcieńczenia 1:100, ab13847, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) stosowano jako przeciwciało pierwotne przez godzinę w komorze wilgotności po obróbce odcinka 0,1% H2O2. Po przemyciu w PBS przeprowadzono wtórne wykrywanie za pomocą ogniwa i peroksydazy streptawidyny, każda przez pięć minut (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) i diaminobenzydyny (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), dokładnie kontrolowanych, aby uniknąć nadmiernego rozbarwienia tła. Jądra barwiono hematoksyliną, płukano w wodzie z kranu przez 10 minut, krótko odwodniono w rosnącej serii roztworów etanolu i przykrywano.

Przygotowanie tkanki do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)Po fifiksacji mieszaniną 2% PFA i 2,5% GA w 0,1 M PBS przez 2 h, próbki przemyto PBS i postfifiksowano w wodnym roztworze 2% tetrtlenku osmu przez 2 h. Wszystkie próbki zostały dwukrotnie przemyte w PBS, odwodnione w rosnących gatunkach etanolu i osadzone w Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, Wielka Brytania). Sekcje seryjne (grubość 70 nm) zostały wycięte na ultramikrotomie UCT Ultracut (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy) i zabarwione 1% octanem uranylu i cytrynianem ołowiu.

Pozyskiwanie i analiza danychAnalizę przeprowadzono za pomocą mikroskopu epiflfluorescencyjnego (Olympus BX51, Tokio, Japonia) wyposażonego w aparat cyfrowy DP71 (Olympus), transmisyjny mikroskop elektronowy JEM 1400 (JEOL, Tokio, Japonia) pracujący z napięciem 80 kV i sfotografowany za pomocą systemu kamer JEOL z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) i wreszcie mikroskopem jasnofipolowym (BX40, Olympus, Tokio, Japonia). Wszystkie analizowane obrazy zostały przetworzone za pomocą oprogramowania ImageJ i Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Na badaną grupę wykorzystaliśmy od trzech do czterech zwierząt. Wszystkie zebraneNerkizostały wycięte przy przekrojach o grubości 5 μm, a maksymalnienerkapodano długość określoną przy użyciu tych próbek. Średnie proksymalne zawiłe kanaliki (PCT), dystalne zawiłe kanaliki (DCT) i kłębuszki nerkowe określono przez uśrednienie 100 średnic struktury na analizowaną próbkę. Ponieważ segmenty nefronu mają nieregularne kształty, przyjęliśmy największą średnicę każdego badanego segmentu jako reprezentatywną. Intensywność barwienia oceniano półilatywnie w czterech stopniach: brak jakiejkolwiek reaktywności (( ), łagodna reaktywność (+), umiarkowana reaktywność (++) i silna reaktywność (+++) (Tabela 2). Liczba DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B i rozszczepionych komórek immunoreaktywnych CASP3 została policzona i wyrażona jako procent wszystkich komórek. Dla każdej próbki przeanalizowaliśmy dwadzieścia PCT, DCT i G przy powiększeniu obiektywnym ×40. Uśredniliśmy liczbę pozytywnych komórek na grupę. Każdy poziom zabarwienia jądrowego, cytoplazmatycznego lub błonowego został uznany za pozytywny. Trzech badaczy przeanalizowało obrazy niezależnie. Porozumienie międzybranżowe zostało przetestowane za pomocą analizy korelacji międzyklasowej, która dała współwydajną >0,75, co wskazuje na doskonałą zgodność [27].

Analiza statystycznaPrzeprowadzono dwuogoniasty test t w celu przeanalizowania różnic w średniej średnicy między PCT, DCT i G zwierząt typu dzikiego i jotari. Średnica została przedstawiona jako średnia ± odchylenia standardowego (SD). Poziom znaczenia ustalono na p< 0.05.="" a="" twoway="" anova="" test="" followed="" by="" tukey’s="" multiple="" comparison="" test="" was="" used="" to="" examine="" the="" differences="" in="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" between="" pct,="" dct,="" and="" glomeruli="" at="" all-time="" points.="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" the="" level="" of="" signifificance="" was="" set="" at="" p="">< 0.05.="" the="" analysis="" was="" performed="" in="" graphpad="" software="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

Wyniki

Barwienie hematoksyliny-eozyny (H&E) i pomiar średnicy nerekBarwienie H&E środkowych odcinkówNerkiwe wszystkich badanych punktach czasowych podkreśla małenerkafenotyp myszy yotari w porównaniu z typem dzikim (ryc. 1a). Przy średniej 4Pnerkaśrednica zwierząt yotari wynosiła około 55 μm niż około 75 μm. Ponadto różnica ta była zauważalna w późniejszych punktach czasowych ze względu na wolniejszy wzrostNerkiw yotari w porównaniu z postępującym wzrostemNerkiu zwierząt dzikich. Aby ustalić, czy zmniejszenie ogółemnerkarozmiar był spowodowany zmniejszeniem wielkości segmentu nefronu, uśredniliśmy średnicę PCT, DCT i G na grupę. Rzeczywiście, w grupie yotari wystąpił spadek średniej średnicy G, PCT i DCT w porównaniu z typem dzikim (ryc. 1b, p< 0.05).="" additionally,="" h&e="" staining="" revealed="" thinner="" cortex="" and="">nerkowywydłużenie miednicy u zwierząt yotari i lekko rozproszone rozszerzone DCT w 14P. Podstawowa struktura i wzór dojrzewania kłębuszkowego są takie same w obu badanych grupach zwierząt.

Opisowa analiza histologiczna na podstawie mikrofotografii TEMNa mikrofotografiach uzyskane przez TEM, kłębuszki u mysz typu dzikiego wykazały typowy wygląd wszystkich części bariery fifiltracyjnej, które normalnie były rozwinięte i rozpoznawalne (ryc. 2a). Podocyty, procesy stopy podocytów i pedicles, szczeliny fifiltracyjne, kłębuszkowe błony podstawne i światło kapilarne z fenestowanym śródbłonkiem były łatwe do odróżnienia (ryc. 2a). Z drugiej strony, w kłębuszkach u myszy yotari można zaobserwować postępujące uszkodzenie podocytów z wymazywaniem procesu stopy i brakiem szczelin fifiltracyjnych (ryc. 2b–d). Te zmiany ultrastrukturalne zaobserwowano u wszystkichNerkizbadał i zaangażował większość badanych kłębuszków nerkowych. Nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości w PCT lub DCT myszy yotari niż dzikich zwierząt (ryc. 2e–h). W PCT interfejsy komórkowe były słabo defifinowane z powodu nieregularności błon komórkowych i interdigitacji komórek z sąsiadami. Cytoplazma była obfita, zawierała dobrze odróżnione jądra, wydłużone mitochondria, podstawowe fałdy i wiele rurowych dołów między mikrokosmkami, które tworzyły granicę szczotki w błonie wierzchołkowej. Większe powiększenie ujawniło wierzchołkową powierzchnię komórek nabłonkowych PCT zawierających długie mikrokosmki, tworzące granicę pędzla i ciasne połączenia między granicami komórek świetlnych sąsiednich rurowych komórek nabłonkowych (ryc. 2e, f). Z drugiej strony, wierzchołkowa powierzchnia komórek nabłonkowych DCT zawierała kilka krótkich mikrokosmków i liczne pęcherzyki (ryc. 2g,h).

Ryc. 2. Transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) typu dzikiego i jotariNerki. Kłębuszki nerkowe dzikich zwierząt (a) wykazały normalnie rozwiniętą barierę fifiltracyjną z fenestowanym śródbłonkiem (E) kapilary (C), błoną podstawną (BM), podocytami (P) z pedicles (PE) i szczelinami fifiltracyjnymi (FS). WNerkizwierząt yotari, można zauważyć zatarcie pedicles i brak szczelin fifiltracyjnych (gwiazdki, b–d). Nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości w proksymalnych zawiłych kanalikach (PCT) lub dystalnych zawiłych kanalikach (DCT) myszy yotari w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego (e–h). W PCT cytoplazma była obfita, zawierając dobrze odróżnione jądra (N), wydłużone mitochondria (M), fałdy podstawy (BI) i wiele rurowych dołów (TP) między mikrokosmkami, które tworzyły granicę szczotki (BB) w błonie wierzchołkowej (e, f). Większe powiększenie ujawniło wierzchołkową powierzchnię komórek nabłonkowych PCT zawierających długie mikrokosmki, tworzące granicę szczotki i ciasne połączenia (TJ) między granicami komórek świetlnych sąsiednich komórek nabłonka kanalików (e, f). Z drugiej strony, wierzchołkowa powierzchnia komórek nabłonkowych DCT zawierająca kilka krótkich mikrokosmków i liczne pęcherzyki (g,h). Pasek skali w obrazach (a–d) i wstawkach (e–h) wynosi 1 μm; pasek skali na obrazach (e–h) wynosi 2 μm.

Lokalizacja i kolokalizacja Reelin i DAB1Reelina wykazywała słabą ekspresję z łagodną do umiarkowanej reaktywnością (Tabela 2) w kłębuszkach nerkowych i DCT wszystkich badanych zwierząt we wszystkich obserwowanych punktach czasowych (p< 0.05,="" figure 3a).="" only="" in="" the="" pct="" of="" yotari mice="" was="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" significantly="" higher="" than="" wild-type="" animals="">< 0.05,="" figure 3a).="" in="" the="" glomerular="" cells,="" the="" localization="" of="" staining="" was="" perinuclear,="" while="" in="" the="" pct="" and ="" dct,="" it="" was="" scattered="" throughout="" the="" cytoplasm="">

igure 4. Barwienie immunofluorescencyjne yotari poporodowychNerkiz markerem reelinowym (a) i podwójnym barwieniem immunofluorescencyjnym pourodzeniowego typu dzikiegoNerkiz DAB1 i markerami reelin (b). a,b) Barwienie JĄDROWEGO DNA DAPI połączyło się z DAB1, a immunofluorescencja reeliny jest pokazana równolegle (scalanie). Obserwowane punkty czasowe to P4, P11, P14. Ekspresja badanych markerów w kłębuszkach nerkowych (G), proksymalnych kanalikach zawiłych (PCT) i dystalnych kanalikach zawiłych (DCT) jest oznaczona strzałkami, podczas gdy gwiazdki wskazują ekspresję reeliny w macierzy zewnątrzkomórkowej (a). Wstawki pokazują najbardziej widoczne wyrażenie na obrazie. Barwienie jądrowe DAPI ujawniło słabą kolokalizację DAB1 i reeliny, głównie w DCT (grot strzały). Pasek skali wynosi 20 μm i odnosi się do wszystkich obrazów.

Prawie nie stwierdzono reaktywności immunologicznej DAB1 u kłębuszków nerkowych i PCT zwierząt typu dzikiego w P4, podczas gdy odsetek pozytywnych komórek o łagodnej reaktywności (Tabela 2) istotnie wzrósł przy P11 i P14 (p< 0.05,="" figure="" 3b).="" in="" the="" dct,="" dab1="" was="" expressed=""  mostly="" at="" the="" apical="" and="" lateral="" parts="" of="" cell="" membranes="" (figure="" 4b)="" with="" strong="" reactivity=""  (table="" 2).="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" previous="" structures,="" around="" 60%="" (figure="" 3b),="" especially="" in="" the="" macula="" densa="" (figure="" 4b).=""  there="" was="" almost="" no="" colocalization="" of="" the="" dab1="" and="" reelin="" except="" in="" the="" dct="" of="" wildtype="" animals="" at="" p14="" (arrowhead,="" figure="" 4b).=""  biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" figure="" 4.="" immunoflfluorescence="" staining="" of="" postnatal="">Nerkiz markerem reelinowym (a) i podwójnym barwieniem immunoflfluorescencyjnym pourodzeniowego typu dzikiegoNerkiz DAB1 i markerami reelin (b). a,b) Barwienie jądrowego DNA DAPI połączyło się z DAB1, a immunoflfluorescencja reeliny jest pokazana równolegle (połączenie). Obserwowane punkty czasowe to P4, P11, P14. Ekspresja badanych markerów w kłębuszkach nerkowych (G), proksymalnych kanalikach zawiłych (PCT) i dystalnych kanalikach zawiłych (DCT) jest oznaczona strzałkami, podczas gdy gwiazdki wskazują ekspresję reeliny w macierzy zewnątrzkomórkowej (a). Wstawki pokazują najbardziej widoczne wyrażenie na obrazie. Barwienie jądrowe DAPI ujawniło słabą kolokalizację DAB1 i reeliny, głównie w DCT (grot strzały). Pasek skali wynosi 20 μm i odnosi się do wszystkich obrazów. Prawie nie stwierdzono reaktywności immunologicznej DAB1 u kłębuszków nerkowych i PCT zwierząt typu dzikiego w P4, podczas gdy odsetek pozytywnych komórek o łagodnej reaktywności (Tabela 2) istotnie wzrósł przy P11 i P14 (p< 0.05,="" figure="" 3b).="" in="" the="" dct,="" dab1="" was="" expressed="" mostly="" at="" the="" apical="" and="" lateral="" parts="" of="" cell="" membranes="" (figure="" 4b)="" with="" strong="" reactivity="" (table="" 2).="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" signifificantly="" higher="" than="" in="" previous="" structures,="" around="" 60%="" (figure="" 3b),="" especially="" in="" the="" macula="" densa="" (figure="" 4b).="" there="" was="" almost="" no="" colocalization="" of="" the="" dab1="" and="" reelin="" except="" in="" the="" dct="" of="" wild-type="" animals="" at="" p14="" (arrowhead,="" figure="">

Przestrzenne i czasowe wzorce ekspresji NOTCH2 i LC3BOdsetek komórek NOTCH2-dodatnich wynosił mniej niż 20% w kłębuszkach obu genotypów zwierzęcych we wszystkich obserwowanych punktach czasowych. Tylko przy P14 odsetek pozytywnych komórek był istotnie wyższy w kłębuszkach u zwierząt yotari niż u zwierząt typu dzikiego (p< 0.05,=""  figure="" 3c).="" the="" staining="" intensity="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2),="" mostly="" located="" perinuclearly="" (figure="" 5a–f).="" in="" the="" pct="" and="" dct="" of="" both="" animal="" genotypes="" percentage="" of="" positive="" cells="" increased="" through="" time.="" at="" p14,="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" significantly=""  higher="" in="" pct="" and="" dct="" of="" yotari="" animals="" than="" pct="" and="" dct="" of="" wild-type="" animals="" (p=""><  0.05,="" figure="" 3c).="" signal="" intensity="" at="" all="" observed="" time="" points="" was="" mild="" to="" moderate="" (table=""  2)="" and="" scattered="" throughout="" the="" cytoplasm="" (figure="" 5a–f).=""  figure="" 5.="" immunofluorescence="" staining="" of="" postnatal="" wild-type="" and="" yotari="">Nerkimarkerami NOTCH2 i LC3B oraz barwienie immunoperoksydazy rozszczepionym markerem kaspazy3 (CASP3). a–f)  Barwienie JĄDROWEGO DNA DAPI jest połączone z NOTCH2 i LC3B. Obserwowane punkty czasowe to P4, P11, P14. Ekspresja markerów NOTCH2 i LC3B w kłębuszkach nerkowych (G), proksymalnych kanalikach zawiłych (PCT) i dystalnych kanalikach splotowych (DCT) jest oznaczona strzałkami. Szczególnie silną reaktywność LC3B można zaobserwować w kapsułce Bowmana rozkładających się kłębuszków nerkowych (gwiazdka, e).  Wstawki pokazują najbardziej widoczne wyrażenie na obrazie. CASP3 był słabo wyrażony we wszystkich obserwowanych punktach czasowych. Jedyna znacząca ekspresja była w kłębuszkach nerkowych myszy yotari na P14 (strzałki). Pasek skali wynosi 20 μm i odnosi się do wszystkich obrazów.  Biomolekuły 2021, 11, 609 9 z 14 3,4. Przestrzenne i czasowe wzorce ekspresji NOTCH2 i LC3B Odsetek komórek NOTCH2-dodatnich wynosił mniej niż 20% w kłębuszkach nerkowych obu genotypów zwierzęcych we wszystkich obserwowanych punktach czasowych. Tylko przy P14 procent komórek dodatnich był znacznie wyższy w kłębuszkach u zwierząt yotari niż u zwierząt typu dzikiego (p< 0.05,="" figure="" 3c).="" the="" staining="" intensity="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2),="" mostly="" located="" perinuclearly="" (figure="" 5a–f).="" in="" the="" pct="" and="" dct="" of="" both="" animal="" genotypes="" percentage="" of="" positive="" cells="" increased="" through="" time.="" at="" p14,="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" signifificantly="" higher="" in="" pct="" and="" dct="" of="" yotari="" animals="" than="" pct="" and="" dct="" of="" wild-type="" animals="" (p="">< 0.05,="" figure="" 3c).="" signal="" intensity="" at="" all="" observed="" time="" points="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2)="" and="" scattered="" throughout="" the="" cytoplasm="" (figure="">

Ryc. 5. Barwienie immunoflfluorescencyjne pourodzeniowego typu dzikiego i yotariNerkimarkerami NOTCH2 i LC3B oraz barwienie immunoperoksydazy rozszczepionym markerem kaspazy3 (CASP3). a–f) Barwienie JĄDROWEGO DNA DAPI jest połączone z NOTCH2 i LC3B. Obserwowane punkty czasowe to P4, P11, P14. Ekspresja markerów NOTCH2 i LC3B w kłębuszkach nerkowych (G), proksymalnych kanalikach zawiłych (PCT) i dystalnych kanalikach splotowych (DCT) jest oznaczona strzałkami. Szczególnie silną reaktywność LC3B można zaobserwować w kapsułce Bowmana rozkładających się kłębuszków nerkowych (gwiazdka, e). Wstawki pokazują najbardziej widoczne wyrażenie na obrazie. CASP3 był słabo wyrażony we wszystkich obserwowanych punktach czasowych. Jedyna znacząca ekspresja była w kłębuszkach nerkowych myszy yotari na P14 (strzałki). Pasek skali wynosi 20 μm i odnosi się do wszystkich obrazów.

W kłębuszkach nerkowych i DCT obu genotypów zwierzęcych odsetek komórek LC3B-dodatnich wzrastał w czasie (p< 0.05,="" figure="" 3d).="" at="" p11="" and="" p14,="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" signifificantly="" higher="" in="" the="" glomeruli="" of="" yotari="" animals="" than="" the="" glomeruli="" of="" wild-type="" animals="" (p="">< 0.05,="" figure="" 3d).="" in="" the="" glomeruli="" of="" yotari="" animals="" staining="" intensity="" was="" mostly="" moderate="" to="" strong="" (table="" 2)="" located="" in="" the="" perinuclear="" and="" nuclear="" space="" (figure="" 5a–f),="" at="" all="" observed="" time="" points,="" while="" in="" the="" glomeruli="" of="" wild-type="" mice,="" the="" intensity="" was="" mostly="" moderate="" (table="" 2).="" pct="" of="" yotari="" and="" wild-type="" animals="" contained="" around="" 20%="" of="" positive="" cells="" at="" all="" observed="" time="" points="" (p="">< 0.05,="" figure="">

Rozszczepione wyrażenie CASP-3Nie było prawie żadnej ekspresji aktywowanego CASP-3 wNerkidzikich zwierząt we wszystkich zaobserwowanych punktach czasowych. W PCT i DCT myszy yotari kilka pojedynczych komórek było CASP-3-dodatnich (ryc. 3e). Tylko w kłębuszkach nerkowych yotari w P14 (ryc. 5e) odsetek pozytywnych komórek znacznie wzrósł w porównaniu zNerkimyszy typu dzikiego (p< 0.05,="" figure="">

Dyskusja

Nerkamorfogeneza i rozwój to złożone procesy precyzyjnie koordynowane poprzez wzajemne oddziaływanie dużej liczby genów. Wrodzone anomalienerkai dróg moczowych (CAKUT) są najczęstszą wadą wrodzoną, która stanowi 23% wszystkich takich wad i stanowi główną przyczynę schyłkowego etapuChoroba nereku dzieci [28,29]. Zaburzenia pojedynczego genu mogą być głównym źródłem CAKUT, a do tej pory mutacja w ponad 20 genach została zidentyfikowana jako przyczyna CAKUT [30]. Jak nasza poprzednia praca wykazała świetną ekspresję DAB1 podczas normalnego płodu ludzkiegonerka[9], założyliśmy, że DAB1 może odgrywać znaczącą rolę podczas występowania ssakównerkarozwój. Aby udowodnić naszą hipotezę, zbadaliśmynerkamorfologia i wzorce ekspresji reeliny, NOTCH2, LC3B i aktywowanych białek CASP3 u myszy nokautujących Dab1.

CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK /NEREK

Przecinanie myszy yotariNerkiujawnił cieńszą korę i znacznie mniejszą średniąnerkaoraz średnic PCT, DCT i G w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. Spadeknerkarozmiar spowodowany niewystarczającym wyposażeniem nefronu jest znany jakonerkowyhipoplazja, jedno z najczęstszych zaburzeń CAKUT, które predysponuje nadciśnienie tętnicze u dorosłych i przewlekłą chorobę nerek [31]. Ponadto mikrofotografie uchwycone za pomocą TEM ujawniły, że myszy yotari wykazywały wyraźne uszkodzenie podocytów z wymazywaniem procesu stopy i brakiem szczelin fifiltracyjnych. Po urazie podocyty przechodzą proces wymazywania, w którym tracą swoją strukturę, co prowadzi do zmniejszenia ich funkcji bariery fifiltracyjnej [32]. Wszystkie formy zespołu nerczycowego, a także ogniskowa segmentowa stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS), charakteryzują się defektami w strukturze lub funkcji podocytów [33].

Nasze obecne badanie wykazało najwyższą ekspresję DAB1 w wierzchołkowych i bocznych częściach błon komórkowych DCT, podczas gdy REELIN był głównie rozproszony w cytoplazmie PCT. W badanych punktach czasowych nie zaobserwowano zmian morfologicznych w kanalikach myszy yotari, ale konieczne są dalsze badania w celu wyjaśnienia roli DAB1 w przedziałach kanalikowo-śródmiąższowych. Sporadycznie występowała kolokalizacja białek DAB1 i REELIN, głównie w DCT. Te fifindingi są zgodne z naszą poprzednią pracą dotyczącą ekspresji tych dwóch białek podczas płodu ludzkiegonerkarozwój [9]. Może to sugerować, że DAB1 i reelin pełnią podobne role u ludzi i myszy.Nerkipoprzez aktywację niektórych szlaków w dół rzeki, takich jak kaskady sygnalizacyjne Crk, MAPK i PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Nasze dane ujawniły również zwiększoną ekspresję reeliny w kłębuszkach u myszy yotari. Co ciekawe, poprzednie badania wykazały, że fosforylacji DAB1 i zwiększonej ekspresji reeliny w kłębuszkach nerkowych towarzyszy nadciśnienie, białkomocz i uszkodzenie podocytów u szczurów z ang II [10].

Ponadto barwienie immunofluorescencyjne ujawniło zwiększoną ekspresję receptorów NOTCH2 w kłębuszkach nerkowych myszy jodurynowych P14. Powszechnie wiadomo, że ekspresja NOTCH2 jest regulowana w dół po osiągnięciu dojrzewania nefronów, z wyjątkiem warunkówurazy nerek,takich jak nefropatia cukrzycowa i FSGS [15,37]. Myszy z zespołem nerczycowym wywołanym adriamycyną również wykazywały zwiększoną ekspresję aktywowanego NOTCH2, który łagodzi zwłóknienie [38]. W badanych punktach czasowych nie zauważyliśmy zwiększonego zwłóknienia, ale pozostaje wyjaśnić dokładną rolę wyrażonego NOTCH2 w jodatrze pourodzeniowymNerki.Konieczna byłaby dalsza obserwacja, czy zmiany zwłóknieniowe występują w późniejszych stadiach. Istnieją już jednak pewne fifindingi, które sugerują, że krótkoterminowy efekt zwiększonej aktywacji NOTCH2 jest związany z silnym przeżyciem dla uszkodzonych podocytów, który jest tracony w modelach długoterminowych, takich jak nefropatia cukrzycowa [39].

Wyższa ekspresja LC3B w kłębuszkach u myszy P11 i P14 yotari prawdopodobnie ponownie spowodowała akumulację autofagosomów w podocytach. Aby wyraźnie pokazać, że autofagia została przyspieszona. Konieczne jest przeanalizowanie stosunku ekspresji białek LC3-II i LC3-I. W normalnych warunkach autofagia jest niezbędna do normalnegoNerek[40], szczególnie u podocytów. Ze względu na ograniczoną zdolność do podziału i wymiany komórek, wykazują wysoki podstawowy poziom autofagii [41]. Pomimo tych fifindingów, zwiększenie ekspresji LC3B odnotowano w kilku chorobach kłębuszków nerkowych [42-44], głównie w związku z wymazywaniem procesu stopy i rozwojem zespołu nerczycowego, jak widać u myszy warunkowego nokautu receptora proreniny [45,46]. Wszystkie te badania sugerują ochronną rolę wzmocnionej autofagii w stanach patologicznych, dodatkowo wspieraną przez fifindingi nefropatii indukowanej adriamycyną, gdzie autofagia jest aktywowana w celu ochrony przed uszkodzeniem podocytów [43], a także w zależnej od wieku chorobie kłębuszków nerkowych, gdzie opóźnia postępujący spadek funkcjonalnyNerek[40]. Analiza człowiekanerkabiopsje wykazały również dowody na zwiększoną autofagię w związku z wymazywaniem procesu stopy w kilku chorobach kłębuszków nerkowych, w tym w zespole nerczycowym o minimalnej zmianie (MCNS), który jest jedną z najczęstszych przyczyn idiopatycznego zespołu nerczycowego [19]. W stanach nefropatii cukrzycowej i ostrych indukowanych lipopolisacharydamiuszkodzenie nerek,nasilenie autofagii niektórymi lekami poprzez hamowanie szlaku PI3K/AKT/mTOR poprawia czynność nerek [47,48]. Wszystkie te fifindingi sugerują, że autofagia ma niezbędną rolę cytoprotekcyjną w adaptacji stresu wuszkodzenie nerek, a jego modulacja może być obiecującą strategią terapeutyczną, chociaż w pewnych okolicznościach autofagia może być również szkodliwa i prowadzić do śmierci komórki.

CISTANCHE POPRAWI NIEWYDOLNOŚĆ NEREK/NEREK

Z wyjątkiem zwiększenia autofagii, podwyższony poziom apoptozy można również zaobserwować u kłębuszków u myszy P14 yotari. Autofagia zwykle zapobiega apoptozie, ale w szczególnych okolicznościach patologicznych może również mieć odwrotny wpływ na przeżycie komórek poprzez zwiększenie i promowanie apoptozy [42]. Po urodzeniu apoptoza wNerkijest znacznie zmniejszona, z wyjątkiem warunkówuszkodzenie nerek,takie jak idiopatyczny zespół nerczycowy, w którym przyczynia się do rozwoju choroby [23]. potencjalna nowa przyczyna autosomalnych recesywnych wrodzonych anomaliinerkai dróg moczowych. Jednak główna rola DAB1 podczasnerkarozwój pozostaje niejasny. Ponadto myszy te wykazywały nieprawidłowości w procesie stóp i podwyższony poziom reeliny, NOTCH2, LC3B i rozszczepionych białek CASP3 w kłębuszkach nerkowych, które mogą prowadzić do urazów kłębuszków nerkowych, takich jak zespół nerczycowy, który w korelacji z hipoplazją może być potencjalną przyczyną śmierci tych zwierząt w okresie odsadzenia. Aby potwierdzić tę hipotezę, konieczne jest dostarczenie dodatkowych informacji dotyczących ciśnienia krwi i innych parametrów kliniczno-laboratoryjnych, takich jak poziomy kreatyniny w surowicy, albuminy i białek.