Część 1 Niejednorodność fibroblastów i trzeciorzędowe tkanki limfoidalne w nerkach

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Abstrakcyjny

Fibroblasty znajdują się w różnych narządach i wspierają strukturę tkanek i homeostazę w warunkach fizjologicznych. Zmiany fenotypowe fibroblastów leżą u podstaw rozwoju różnych stanów patologicznych, w tym zwłóknienia narządów. Ostatnie postępy w biologii pojedynczej komórki ujawniły, że fibroblasty składają się z heterogenicznych subpopulacji o odrębnych fenotypach, które wywierają zarówno korzystny, jak i szkodliwy wpływ na narządy gospodarza w sposób zależny od kontekstu. wnerka, zmiany fenotypowe rezydujących fibroblastów wywołują powszechne stany patologiczneprzewlekłą chorobę nerek(PChN), takie jak niedokrwistość nerek i utrata naczyń włosowatych okołokanalikowych. Dodatkowo, w wieku kontuzjowanymnerki, fibroblasty zapewniają funkcjonalne i strukturalne wsparcie dla trzeciorzędowych tkanek limfoidalnych (TLT), które służą jako ektopowe miejsce nabytych reakcji immunologicznych w różnych kontekstach klinicznych. TLT są ściśle związane ze starzeniem się i postępem PChN, a etapy rozwoju TLT odzwierciedlają ciężkość uszkodzenia nerek. W niniejszym przeglądzie opisujemy aktualne rozumienie heterogeniczności fibroblastów zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, ze szczególnym uwzględnieniem udziału fibroblastów w tworzeniu TLT wnerka. Analiza heterogenicznych cech fibroblastów zapewni obiecującą opcję terapeutyczną dla stanów patologicznych związanych z fibroblastami, w tym tworzenia TLT.

SŁOWA KLUCZOWEchronicznynerkachoroba, fibroblast, zwłóknienie, miofibroblast, trzeciorzędowa tkanka limfoidalna

Kliknij, abydawkowanie cistanche tubulosa w przypadku choroby nerek

1|WPROWADZANIE

W przeszłości identyfikacja komórek w tkance opierała się na wyglądzie morfologicznym pod uważną obserwacją mikroskopową. Postępy w biologii molekularnej doprowadziły do ​​odkrycia markerów molekularnych specyficznych dla każdego typu komórek, które można wykorzystać do klasyfikacji komórek, co znacząco przyczyniło się do zbadania różnych mechanizmów biologicznych. Ostatnie postępy w analizie multiomicznej pojedynczych komórek ujawniły niejednorodne cechy populacji komórek w bezprecedensowej rozdzielczości i radykalnie zrekonstruowały nasze rozumienie zjawisk biologicznych. Każda kategoria komórek obejmuje różne subpopulacje o odrębnych funkcjach, które charakteryzują mikrośrodowisko specyficzne dla tkanki zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym. Dziedzina badań nad fibroblastami nie jest wyjątkiem i zgromadzono ogromne dowody sugerujące ich niejednorodną charakterystykę.

Fibroblasty to komórki o kształcie wrzeciona zlokalizowane w przestrzeniach śródmiąższowych różnych narządów, gdzie syntetyzują kilka białek strukturalnych, takich jak kolageny i fibronektyny, w celu uporządkowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i utrzymania homeostazy narządów1. , fibroblasty odgrywają specyficzne dla narządów role we współpracy z innymi rezydentnymi komórkami. Na przykład subpopulacja rezydujących fibroblastów wnerkawytwarza erytropoetynę (EPO), główny regulator erytropoezy. Ostatnie badania wykazały, że fibroblasty w różnych narządach wykazują dużą niejednorodność funkcjonalną. W warunkach patologicznych dochodzi do dramatycznych zmian fenotypowych fibroblastów, które znacząco przyczyniają się do rozwoju dysfunkcji narządów. Fibroblasty przechodzą transdyferencjację w miofibroblasty i promują postęp włóknienia narządów, które jest przejawem nieprzystosowawczej naprawy po urazie.2 W nerkach fibroblasty odgrywają kluczową rolę w rozwoju i progresjiprzewlekłą chorobę nerek(PChN), która charakteryzuje się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością na całym świecie, nawet w epoce nowożytnej.3 Fibroblasty są przyczyną wielu stanów patologicznych związanych z PChN, takich jak zwłóknienie nerek i niedokrwistość nerek, niezależnie od etiologii PChN. Ponadto fibroblasty odgrywają również wieloaspektowe role w sposób zależny od kontekstu. Na przykład w starszych, uszkodzonych nerkach fibroblasty odgrywają kluczową rolę w tworzeniu trzeciorzędowej tkanki limfoidalnej (TLT), indukowalnej ektopowej tkanki limfoidalnej wywołanej przewlekłym stanem zapalnym.4 Wyjaśnienie indywidualnych cech fibroblastów pozwoli wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw fibroblastów stany patologiczne i ułatwiają rozwój skutecznych terapii.

W tym przeglądzie najpierw opisujemy niejednorodność fibroblastów pod kątem ich pochodzenia i funkcji w warunkach fizjologicznych. Następnie omówiono funkcjonalną heterogeniczność fibroblastów w różnych stanach patologicznych, w tym zwłóknienie narządów, oraz ich interakcje z innymi typami komórek i otaczającym mikrośrodowiskiem. Szczególny nacisk kładzie się na rezydentne fibroblasty wnerkaoraz ich wpływ na progresję PChN. Na koniec omówiony zostanie wkład fibroblastów w tworzenie TLT i jego znaczenie kliniczne.

2|CHARAKTERYSTYKA FIBROBLASTY

2.1|Charakterystyka i funkcje fibroblastów w warunkach fizjologicznych

Fibroblasty są na ogół identyfikowane na podstawie ich morfologii, lokalizacji i ekspresji markerów reprezentatywnych, takich jak PDGFR i CD73.1. Te markery nie są jednak całkowicie specyficzne dla fibroblastów, więc brak markerów dla innych linii komórkowych (np. CD45 dla komórek krwiotwórczych ) jest często wykorzystywany do identyfikacji fibroblastów. W warunkach fizjologicznych fibroblasty przyczyniają się do utrzymania prawidłowej struktury tkanki poprzez wspomaganie obrotu ECM. Oprócz tych funkcji rezydentne fibroblasty odgrywają również role specyficzne dla tkanek. Na przykład w sercu, gdzie fibroblasty stanowią największą populację komórek, fibroblasty wyczuwają rozciąganie mechaniczne i wchodzą w interakcję z miocytami poprzez połączenie szczelinowe, co umożliwia odpowiednie przewodzenie elektryczne i utrzymanie prawidłowej czynności serca.⁵Dodatkowo ubytek fibroblastów w szpiku kostnym i mięśniach szkieletowych prowadzi do anemii i wyniszczenia6, co sugeruje ich znaczenie w prawidłowej homeostazie tkanek w różnych narządach.

Thenerkajest wyjątkowym narządem, ponieważ wiele typów komórek znajduje się blisko siebie i funkcjonuje harmonijnie, pełniąc funkcje specyficzne dla nerek, takie jak usuwanie produktów przemiany materii i utrzymywanie równowagi płynów ustrojowych. Fibroblasty zapewniają wsparcie strukturalne dla nefronów, podstawowej jednostki funkcjonalnej nerki, i mają bezpośrednią interakcję z innymi komórkami zasiedlającymi nerki, takimi jak komórki kanalików proksymalnych. Rdzeń zewnętrzny wytwarza EPO w odpowiedzi na niedotlenienie, co stymuluje erytropoezę w szpiku kostnym.8 Komórki wytwarzające EPO mają morfologię dendrytyczną podobną do neuronów i wyrażają markery neuronalne, takie jak białko 2 związane z mikrotubulami (MAP2) i polipeptyd światła neurofilamentowego (NFL) .8 Co ciekawe, w warunkach ciężkiej anemii prawie wszystkie rezydentne fibroblasty, w tym te w korze zewnętrznej, wytwarzają EPO, co sugeruje wysoką plastyczność funkcji fibroblastów.9 Lokalizacja komórek wytwarzających EPO jest w ostrym kontraście z innymi hematopoetycznymi czynnikami wzrostu , takie jak czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów, które są syntetyzowane w pobliżu ich komórek docelowych i zabawne działanie w sposób parakrynny. Jednym z wyjaśnień tej rozbieżności jest to, że fizjologiczne stężenie tlenu w nerkach jest niższe niż w innych narządach, a przepływ krwi przez nerki odpowiada za około 20 procent pojemności minutowej serca, co czyni nerkę idealnym biologicznym czujnikiem hipoksji.10 Nerki mogą również natychmiast wykrywać stan płynu w okolicy przyszpikowej i regulować objętość zewnątrzkomórkową, dostosowując wielkość reabsorpcji sodu. Wraz z produkcją EPO, nerki mogą ustawić objętość osocza i masę czerwonych krwinek na korzystnym poziomie, służąc jako „krytometr”.^11,12Ponadto fibroblasty w rdzeniu nerki wyrażają COX1 i COX2, które są kluczowymi enzymami syntezy prostaglandyn (PG).¹³ W warunkach fizjologicznych PG pełnią wiele funkcji wnerka, takich jak regulacja przepływu krwi przez nerki i uwalnianie reniny. Ogólnie rzecz biorąc, fibroblasty rezydujące w nerkach przyczyniają się do utrzymania homeostazy nerek za pomocą kilku mechanizmów.

2.2|Pochodzenie fibroblastów

Pochodzenie rozwojowe fibroblastów jest niejednorodne. wnerka, wcześniej wykazaliśmy, że rezydentne fibroblasty w korze nerkowej i rdzeniu zewnętrznym pochodzą z komórek zewnątrznerkowych znakowanych białkiem mieliny zero (P0)-Cre.¹⁴ W fazie embrionalnej P0 ulega ekspresji na nerwowych komórkach grzebienia.¹⁵ P0-Komórki oznaczone linią Cre migrują z grzebienia nerwowego do embrionunerkaw embrionalnym dniu 13,5 i są zlokalizowane wraz z zewnętrzną torebką i moczowodem nerki. U dorosłychnerka, P0-znakowane komórki linii Cre są obserwowane w tkance śródmiąższowej nerek i wykazują ekspresję markerów fibroblastów, takich jak PDGFR i CD73. Co ciekawe, większość fibroblastów wytwarzających EPO jest również znakowana genetycznie przez P0-Cre, zgodnie z ich cechami fenotypów podobnych do neuronów opisanych powyżej.⁸ Wyniki te są również poparte obserwacją, że głównym źródłem EPO w pierwotnej erytropoezie są nerwowe i nerwowe komórki grzebienia.¹⁶

W przeciwieństwie do tego, rezydujące fibroblasty w wewnętrznym rdzeniu nerki są znakowane linią Wnt4-Cre,¹⁷ ilustrujący regionalną heterogeniczność pochodzenia fibroblastów wnerka. W rozwoju nerek ekspresję Wnt4 obserwuje się w nefronach składających się i zrębie rdzenia kręgowego.18,19 Wnt4 reguluje różnicowanie komórek zrębu rdzenia kręgowego do komórek mięśni gładkich,²⁰ jak również przejście mezenchymalne do nabłonka i tubulogeneza.19 Rzeczywiście, zubożenie Wnt4 osłabia ekspresję aktyny mięśni gładkich (SMA) w rdzeniowych komórkach zrębu.²⁰

W połączeniu z różnym pochodzeniem fibroblastów w korze i rdzeniu nerki, zgłoszono również kilka różnic fenotypowych między fibroblastami korowymi i rdzeniowymi. Na przykład, podczas gdy fibroblasty korowe wykazują ekspresję ekto-5'-nukleotydazy (5'NT), większość fibroblastów rdzeniastych nie wykazuje ekspresji.²¹ W analizie ultrastrukturalnej fibroblasty korowe wykazują tendencję do wykazywania struktury dendrytycznej do interakcji z sąsiednimi komórkami, podczas gdy fibroblasty rdzeniaste zawierają kropelki lipidów.7,22 Co ciekawe, te kropelki lipidów pojawiają się również w fibroblastach korowych szczura z niedokrwistością.nerki.²¹ Potrzebne są dalsze badania, aby ustalić, czy te różnice fenotypowe są związane z różnicami funkcjonalnymi między fibroblastami korowymi i rdzeniowymi.

2.3|Pericyty i fibroblasty

Pericyty to komórki ścienne, które otaczają komórki śródbłonka naczyniowego i kontrolują mikrokrążenie. Tradycyjnie pericyty definiuje się głównie na podstawie ich anatomicznej lokalizacji, ich morfologii i typowej ekspresji markerów.²³ Pericyty mają wspólne cechy z rezydującymi fibroblastami, takie jak ich mezenchymalne pochodzenie i morfologia. Pericyty wyrażają te same markery komórkowe, co rezydentne fibroblasty, takie jak PDGFR. Chociaż do identyfikacji pericytów wykorzystano kilka markerów, takich jak NG-2, nie są one całkowicie specyficzne dla pericytów i nie ma określonego markera, który całkowicie odróżniałby pericyty od fibroblastów. Rzeczywiście, skuteczność śledzenia perycytów nerkowych przez NG-2 jest stosunkowo niska.24 Chociaż różnice w lokalizacji anatomicznej w warunkach fizjologicznych częściowo pomagają w różnicowaniu perycytów od rezydentnych fibroblastów, niektóre rezydentne fibroblasty również znajdują się w obszarze okołonaczyniowym. („fibroblasty okołonaczyniowe”), więc odróżnienie perycytów od fibroblastów na podstawie lokalizacji anatomicznej nie jest wystarczające.

Podobnie jak fibroblasty, pochodzenie pericytów jest niejednorodne. Podczas gdy pericyty w ośrodkowym układzie nerwowym i grasicy pochodzą z grzebienia nerwowego pochodzącego z ektodermy, pericyty w sercu i płucach pochodzą z mezotelium.²³ W nerkach pericyty pochodzą od FoxD1-dodatnich progenitorów mezenchymalnych kory mózgowej.²⁵ Komórki FoxD1 plus pochodzą oryginalnie od Osr1-dodatnich nefrogennych pośrednich progenitorów mezodermy w fazie embrionalnej.^26,27Komórki FoxD1 plus służą jako mezenchymalne komórki progenitorowe i różnicują się do kilku typów komórek, takich jak pericyty, fibroblasty, komórki mięśni gładkich naczyń i komórki mezangialne.²⁷ Co ciekawe, populacje komórek zrębowych znakowanych linią FoxD1-Cre w dużej mierze pokrywają się z komórkami znakowanymi linią genetyczną P0-Cre, z wyjątkiem rdzenia wewnętrznego.^14,25,27Potwierdza to obserwacja, że ​​migrujące komórki grzebienia nerwowego w fazie embrionalnej wyrażają FoxD1,²⁸oraz P0-znakowane komórki linii Cre wchodzące do embrionunerkaprzejściowo wyrazić FoxD1.¹⁴ Konsekwentnie, komórki wytwarzające EPO są również znakowane linią przez FoxD1-Cre.²⁹ W związku z tym istnieje duże nakładanie się populacji komórek zdefiniowanych jako „fibroblasty” i „perycyty” i jako takie, pericyty i fibroblasty były często omawiane jako całość. W tym przeglądzie używamy terminu „fibroblasty/perycyty”, aby zdefiniować populację komórek obejmującą zarówno fibroblasty, jak i pericyty. Wkład FoxD1 plus mezenchymalnych prekursorów w pulę miofibroblastów i rozwój zwłóknienia zostanie omówiony w następnej sekcji.

Chociaż trudno było odróżnić pericyty od fibroblastów, ostatnie badanie, w którym przeprowadzono scRNAseq fibroblastów i komórek ściennych (komórek mięśni gładkich naczyń i perycytów) w narządach mięśniowych, pozwala nam zrozumieć ich różnice na poziomie transkrypcji.³⁰ Muhl i wsp. wykonali scRNAseq komórek pochodzących z serca, mięśnia szkieletowego, okrężnicy i pęcherza myszy. Chociaż każdy typ komórki wykazuje zależną od narządów heterogeniczność transkrypcyjną, zidentyfikowano 90 podzbiorów genów nakładających się we wszystkich czterech narządach, które można wykorzystać do rozróżnienia perycytów od fibroblastów. Chociaż powszechne markery fibroblastów obejmują wiele genów ECM (np. Col1a1), CD34 i PDGFR, markery komórek ściennych obejmują Mcam, Tagln i Notch3. Chociaż żaden pojedynczy marker nie może całkowicie zdefiniować każdego typu komórek, kombinacja tych markerów skutecznie odróżnia pericyty od fibroblastów. Co ciekawe, pericyty wykazują specyficzną narządową lokalizację i ekspresję markerów w porównaniu z fibroblastami. Na przykład, chociaż pericyty okrężnicy są zlokalizowane w wierzchołku podnabłonkowych pętli włośniczkowych z silną ekspresją PDGFR i NG-2, pericyty pęcherza zamiast tego wykazują ekspresję SMA. Odmienne profile transkrypcyjne perycytów mogą wyjaśniać funkcjonalne różnice perycytów między różnymi narządami.

3|MYOFIBROBL A ST: POCHODZENIE, FUNKCJA, HETEROGENICZNOŚĆ I POWIĄZANE STANY PATOLOGICZNE

Zwłóknienie jest ostatnim powszechnym objawem dyshomeostazy narządów i jest definiowane jako nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej ze zniekształconą architekturą tkanek. Rozwój zwłóknienia jest regulowany przez skomplikowaną równowagę między syntezą macierzy zewnątrzkomórkowej a jej degradacją.31 Raz rozwinięte zwłóknienie wiąże się ze złym rokowaniem w różnych narządach, w tym wnerkai jest uważany za wiarygodny predyktor pogorszenia funkcji narządów. W nerkach zwłóknienie rozwija się jednocześnie z niedokrwistością nerkową i utratą włośniczek okołokanalikowych, które są cechami charakterystycznymi PChN. W rozwoju zwłóknienia miofibroblasty pojawiają się de novo po uszkodzeniu i aktywnie proliferują i syntetyzują komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej (ryc. 1).

3.1|Pochodzenie miofibroblastów

W ciągu ostatniej dekady zaproponowano kilka źródeł komórkowych jako kandydatów na prekursory miofibroblastów. Badania wykazały, że większość miofibroblastów pochodzi z rezydentnych fibroblastów, zarówno wnerkai inne narządy (np. serce).^14,32,33wnerka, Rezydentne fibroblasty znakowane linią P0-Cre ulegają transdyferencjacji w miofibroblasty po uszkodzeniu, z jednoczesną utratą produkcji EPO.¹⁴ Konsekwentnie miofibroblasty są uszkodzonenerkisą również oznaczone rodowodem przez FoxD1-Cre.²⁵ Wyniki te zostały potwierdzone w kolejnym badaniu z wykorzystaniem myszy EPO-Cre z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO), głównym doświadczalnym modelem zwłóknienia nerek in vivo.⁹ W miofibroblastach aktywowana jest sygnalizacja NFκB i Smad, które leżą u podstaw przemiany fenotypowej miofibroblastów i zmniejszonej produkcji EPO. Co ciekawe, produkcja EPO w miofibroblastach zostaje przywrócona przez podawanie środków neuroprotekcyjnych, takich jak deksametazon i neurotrofiny,¹⁴ lub cofania UUO,⁹ ilustrujący wysoką funkcjonalną plastyczność miofibroblastów.

W przeciwieństwie do miofibroblastów korowych, miofibroblasty rdzeniaste pochodzą z Wnt4 oraz fibroblastów rezydujących w rdzeniu wewnętrznym.¹⁷ Niedawna analiza transkrypcji pojedynczej komórki również potwierdza możliwość, że (mio)fibroblasty korowe i rdzeniowe mogą wykazywać różne fenotypy. snRNAseq u myszynerkaModele uszkodzeń ujawniły, że subpopulacje fibroblastów są podzielone na cztery grupy według ich korowego lub rdzeniowego miejsca pochodzenia.³⁴ Co ciekawe, fibroblasty korowe przejściowo wyrażają Acta2 i Col1a1 tylko w ostrej fazie IRI, podczas gdy fibroblasty rdzeniaste wykazują przedłużoną ekspresję tych markerów miofibroblastów, nawet 6 tygodni po IRI. Te różnice fenotypowe między miofibroblastami korowymi a miofibroblastami rdzeniowymi mogą wynikać z różnego pochodzenia fibroblastów, jak opisano powyżej.

Niedawno opublikowane kompleksowe badanie dostarczyło przekonujących dowodów, że większość miofibroblastów pochodzi z rezydujących fibroblastów/perycytów nie tylko w nerkach mysich, ale także w nerkach ludzkich. Kuppe i wsp. przeanalizowali zwłóknienie u ludzi i myszynerkiprzez scRNAseq z bardzo wysoką rozdzielczością.35 Większość miofibroblastów różni się od fibroblastów i perycytów, z niewielkim udziałem innych typów komórek, takich jak odróżnicowane komórki kanalików proksymalnych. W tym badaniu miofibroblasty zdefiniowano jako komórki wyrażające najwięcej genów ECM, zamiast ekspresji SMA, i okazało się, że miofibroblasty są skuteczniej znakowane przez periostynę (Postn). Co ciekawe, przejście fibroblastów/perycytów do miofibroblastów charakteryzuje się wczesną ekspresją genów związanych z zatrzymaniem cyklu komórkowego, takich jak białko aktywatora -1 (AP1). Po ekspresji AP1 następuje ekspresja integryn i TGF, które są głównymi czynnikami napędzającymi zwłóknienie nerek. Zidentyfikowali również Nkd2 jako marker selekcyjny dla dojrzałych miofibroblastów. Ekspresja Nkd2 jest dodatnio skorelowana z ekspresją Postn i ECM, ale ujemnie z genami związanymi z fibroblastami i perycytami. Powalenie Nkd2 włączonenerkaorganoidy tłumiły ekspresję Col1a1, co sugeruje, że Nkd2 może odgrywać rolę w rozwoju zwłóknienia. Chociaż potrzebna jest dalsza walidacja in vivo, istnieje możliwość, że Nkd2 może służyć jako cel terapeutyczny dla zwłóknienia nerek.

Chociaż udział fibroblastów/perycytów w puli miofibroblastów jest najbardziej znaczący, doniesiono również o udziale fibrocytów. Fibrocyty to komórki pochodzące ze szpiku kostnego z dodatnimi markerami krwiotwórczymi, które produkują kolagen i składniki ECM. Fibrocyty migrują donerkajako pre-zróżnicowane komórki wytwarzające kolagen i przyczyniają się do rozwoju zwłóknienia w nerkach.³⁶ Wczesne badania wykazały sprzeczne wyniki dotyczące ogólnego udziału fibrocytów w miofibroblastach,^24,37głównie ze względu na różnice w wiarygodności reporterów transgenicznych. Ostatnie badania wykorzystujące modele parabiozy i scRNAseq wykazały, że większość miofibroblastów pochodzi z fibroblastów/perycytów, ale nie z komórek pochodzących z linii krwiotwórczych.³⁸ scRNAseq człowiekanerkarównież ujawniły podobne wyniki,³⁵ co sugeruje, że udział fibrocytów w puli miofibroblastów jest stosunkowo niewielki w porównaniu z fibroblastami/perycytami.

W poprzednim badaniu twierdzono, że komórki nabłonkowe przekształcają się w miofibroblasty poprzez przejście z nabłonka do mezenchymów (EMT),³⁹ głównie na podstawie kolokalizacji markerów nabłonkowych i mezenchymalnych. Szczegółowe badania śledzenia losu komórek zakwestionowały jednak główny wkład EMT in vivo i wykazały, że EMT stanowi tylko niewielką część puli miofibroblastów, jeśli w ogóle.^24,25,35Przejście śródbłonka do mezenchymów (EndoMT) to kolejny proces biologiczny, w którym komórki śródbłonka ulegają transdyferencjacji w miofibroblasty. Chociaż niektóre badania wykazały, że EndoMT przyczynia się do zwłóknienia nerek,^40-42wkład EndoMT w ogólnej populacji miofibroblastów wydaje się być mniej istotny niż fibroblasty/perycyty lub fibrocyty.^24,35

3.2|Redefinicja miofibroblastów

Tradycyjnie miofibroblasty definiowano jako komórki posiadające cechy zarówno fibroblastów, jak i komórek mięśni gładkich oraz wyrażające białko kurczliwe SMA.1 Jednak kilka badań sugeruje, że oprócz fibroblastów, miofibroblasty również wykazują wysoką heterogeniczność, a SMA jest niespójnym markerem dla miofibroblastów . Jak wcześniej opisano, w niedawno przeprowadzonej analizie scRNAseq włóknistychnerki, miofibroblasty zdefiniowano jako komórki o największej ekspresji ECM, a Postn wykorzystano do identyfikacji miofibroblastów zamiast SMA.³⁵Rzeczywiście, Sun i wsp. wykorzystali myszy z podwójnym reporterem Col-EGF/SMA-RFP i wykazali, że tylko niewielka część komórek wytwarzających kolagen wyraża SMA w modelach zwłóknienia nerek i płuc.⁴³ Inne badanie wykazało również, że komórki mięśni gładkich i pericyty wyrażają wyższy poziom SMA niż my-fibroblasty, co czyni SMA niespójnym markerem dla miofibroblastów, przynajmniej w zwłóknieniu płuc.⁴⁴ Co ciekawe, miofibroblasty są podzielone na pięć klastrów przez scRNAseq, a analiza pseudoczasowa sugeruje, że każdy z nich reprezentuje różne etapy przejścia my-fibroblastów z fibroblastów.35 Konieczne są dalsze badania walidacyjne, aby potwierdzić funkcjonalną heterogeniczność różnych podtypów fibroblastów.

3.3|Funkcjonalna heterogeniczność (mio)fibroblastów

W warunkach patologicznych fibroblasty nabywają różne fenotypy i odgrywają różne role w zależności od ich mikrośrodowiska i kontekstu klinicznego. W płucach zgłoszono wysoką funkcjonalną niejednorodność rezydujących fibroblastów, która poprzez różne mechanizmy przyczynia się do zwłóknienia płuc.44-46 Istnieją odrębne subpopulacje fibroblastów płucnych rezydujących w różnych lokalizacjach anatomicznych (fibroblasty pęcherzykowe, przydanki i okołooskrzelowe), a każdy z nich wykazuje inne profile transkrypcyjne w scRNAseq.44 Wśród nich, na podstawie ekspresji kolagenowych powtórzeń potrójnej helisy zawierających 1 (Cthrc1), zidentyfikowano unikalną subpopulację fibroblastów o wysokiej produkcji ECM. Fibroblasty Cthrc1-dodatnie różnią się od fibroblastów pęcherzykowych i są obserwowane głównie w ogniskach fibroblastycznych, centralnym miejscu fibrogenezy. Wykazują dużą zdolność migracji i kolonizacji po transferze dotchawiczym, co sugeruje ich patologiczne funkcje. Wyniki te wskazują, że różne subpopulacje fibroblastów zajmują różne lokalizacje anatomiczne w płucu, a Cthrc1 oznacza szkodliwe fibroblasty o wysokiej ekspresji ECM. Inne badanie wykazało, że zmiany fenotypowe starszych miofibroblastów w płucach leżą u podstaw upośledzonej zdolności do ustępowania zwłóknienia płuc u osób w podeszłym wieku.47 Starzejące się miofibroblasty wykazują wyższą ekspresję oksydazy NADPH 4 (Nox4), podczas gdy czynnik 2 związany z NFE2- (Nrf2 ), który jest głównym regulatorem odpowiedzi na stres antyoksydacyjny, jest regulowany w dół. Brak równowagi redoks między Nox4 i Nrf2 powoduje nabycie fenotypów antyapoptotycznych i starzejących się w starych fibroblastach, co sprzyja trwałemu zwłóknieniu. Rzeczywiście, blokada aktywności Nox4 in vivo przez siRNA lub inhibitor drobnocząsteczkowy przywraca zdolność do usuwania zwłóknienia u starszych myszy, ze zmniejszonymi fenotypami starzenia i przeciwdziałania apoptozie w miofibroblastach.

Unikalny fenotyp fibroblastów jest również opisywany w chorobie związanej z IgG4- (IgG4-RD), która charakteryzuje się dodatnim naciekiem IgG4-komórkami plazmatycznymi i włóknieniem stomijnym.48 Chociaż większość pacjentów Ponieważ IgG4-RD dobrze reagują na leczenie glikokortykoidami, uzasadnienie odpowiedzi terapeutycznej było niejasne. Wykazaliśmy, że ekspresja receptora glukokortykoidowego (GR) jest znacząco podwyższona w zaatakowanych narządach pacjentów, takich jak gruczoły podżuchwowe, przestrzeń zaotrzewnowa inerki.49 Co ciekawe, GR ulega ekspresji głównie na fibroblastach oraz leukocytach zaatakowanego narządu, co częściowo wyjaśnia, dlaczego podawanie glikokortykoidów osłabia rozwój zwłóknienia w IgG4-RD. Chociaż wkład fibroblastów w rozwój IgG4-RD wymaga dalszej walidacji, wyniki te stanowią przykład funkcjonalnej heterogeniczności fibroblastów w rozwoju różnych stanów patologicznych.

3.4|Niedokrwistość nerek i utrata naczyń włosowatych okołokanalikowych: dwa powszechne stany patologiczne spowodowane dysfunkcją fibroblastów w nerkach

Zwłóknienie jest ostatnią powszechną ścieżką PChN, niezależnie od jej etiologii. Rzeczywiście, zwłóknienie w korze nerkowej jest uważane za najlepszy histologiczny predyktor dysfunkcji nerek w PChN.50 Jest to częściowo spowodowane tym, że zwłóknienie jest ściśle związane z innymi stanami patologicznymi powszechnymi w PChN, takimi jak niedokrwistość nerek i utrata włośniczek okołokanalikowych. Kilka czynników wyzwala przejście fibroblastów do miofibroblastów i rozwój zwłóknienia w nerkach, takich jak uszkodzenie kanalików proksymalnych.51,52 Jak opisano w poprzednim rozdziale, fibroblasty/perycyty wytwarzające EPO ulegają transdyferencjacji w miofibroblasty w odpowiedzi na uszkodzenie, z jednoczesną utratą produkcji EPO .14,29 Wytwarzanie EPO jest indukowane w stanie hipoksji i regulowane przez czynniki indukowane hipoksją (HIF). W warunkach normoksycznych HIF są szybko hydroksylowane przez białka zawierające domenę hydroksylazy prolilowej HIF (PHD), które promują proteasomalną degradację HIF. wnerka, aktywacja HIF przez dr hab. inhibicja przywraca produkcję EPO w miofibroblastach, a oś PHD2-HIF2 jest główną kaskadą regulatorową.53 Co ciekawe, produkcja EPO w fibroblastach znakowanych linią FoxD1-Cre jest podwyższona przez inaktywację PHD2, ale nie przez inaktywację PHD1 lub PHD3, co sugeruje, że wytwarzanie EPO w tych komórkach jest regulowane przez unikalne mechanizmy.⁵³ Chociaż obecną standardową terapią anemii nerek jest podawanie rekombinowanej ludzkiej EPO (rhEPO), podawanie egzogennej rhEPO wiąże się z kilkoma działaniami niepożądanymi, takimi jak nadciśnienie i zdarzenia zakrzepowe.^54,55Aby przezwyciężyć te wady rhEPO, dr inż. Inhibitory, które regulują w górę geny wywołane hipoksją, w tym EPO, zostały opracowane i wykorzystane do leczenia anemii nerek.⁵⁶ Chociaż wymagane są dalsze badania dotyczące długotrwałych negatywnych skutków doktora. inhibitory, ukierunkowane na miofibroblasty w celu indukowania endogennej produkcji EPO mogą być obiecującą i korzystną strategią terapeutyczną w anemii nerek w CKD.

Utrata włośniczek okołokanalikowych i rozrzedzenie naczyń włosowatych również rozwijają się w połączeniu ze zwłóknieniem, a u podstaw tych objawów leży funkcjonalna zmiana perycytów.^57-59wnerka, naczynia włosowate okołokanalikowe otoczone są perycytami, które wspierają strukturę i funkcjonowanie naczyń włosowatych w warunkach fizjologicznych. Po urazie te pericyty odrywają się od naczyń włosowatych okołokanalikowych i migrują do uszkodzonych kanalików.^53,60 W tym procesie naczynia włosowate okołokanalikowe tracą mechaniczne wsparcie perycytów, co prowadzi do|201 ARAI i in. regresja kapilarna i rozrzedzenie.^57,58W modelu UUO apoptoza komórek śródbłonka i utrata naczyń włosowatych okołokanalikowych rozwijają się wraz z postępem zwłóknienia.⁶¹ Ponadto naczynia włosowate okołokanalikowe zwłóknienianerkiwykazują nieprawidłowości morfologiczne, takie jak tworzenie kaweoli i wakuolizacja, a ich przepuszczalność jest podwyższona, co jest widoczne w zwiększonym wynaczynieniu w obrazowaniu mikroskopowym dwufotonowym.⁶² Rzeczywiście, zmniejszony dopływ krwi do nerek wywołany utratą i rozrzedzeniem okołokanalikowych naczyń włosowatych jest wykrywany w mysich modelach CKD za pomocą tomografii mikrokomputerowej z kontrastem. 63 Wraz z rozwojem zwłóknienia i względnym niedoborem EPO, utrata naczyń włosowatych okołokanalikowych przyczynia się do zmniejszenia dopływu tlenu do kanalików nerkowych i tkanki śródmiąższowej, które zaostrzają uszkodzenie nerek i tworzą błędne koło progresji PChN.⁶⁴

4|NIEPRAWIDŁOWOŚĆ FUNKCJONALNA FIBROBLASTY POZA WŁÓKNIENIEM

Ostatnie badania wykorzystujące analizę scRNAseq ujawniły fenotypową niejednorodność fibroblastów w stanach patologicznych w różnych narządach iw konsekwencji wykazały wszechstronne funkcje fibroblastów. Fibroblasty nie tylko wywierają szkodliwe działanie, ale także pełnią korzystne funkcje w sposób zależny od kontekstu. W tej sekcji dokonujemy przeglądu aktualnego zrozumienia różnych funkcji fibroblastów, innych niż rozwój zwłóknienia.

4.1|Funkcje zapalne

Fibroblasty sprzyjają zapaleniu tkanek w kilku kontekstach.⁶⁵ Na przykład, w mysim modelu zawału mięśnia sercowego, rezydujące fibroblasty prowadzą nie tylko do zwłóknienia serca, ale także miejscowego zapalenia do pogorszenia czynności serca. Po zawale mięśnia sercowego fibroblasty sercowe w obszarze zwłóknienia zwiększają poziom Sox9,^66,67który jest czynnikiem transkrypcyjnym odpowiedzialnym za odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej w chondrocytach.⁶⁸ Swoista dla fibroblastów delecja Sox9 in vivo łagodzi zapalenie serca i zwłóknienie w fazie przewlekłej po zawale mięśnia sercowego, prowadząc do złagodzenia dysfunkcji lewej komory i bliznowacenia mięśnia sercowego. Badanie RNAseq tkanki bliznowatej serca ujawniło, że delecja Sox9 w fibroblastach obniża poziom genów prozapalnych, takich jak IL-6, a także genów kolagenowych. ChIPseq na chondrocytach ssaków ujawnił, że niektóre z tych genów prozapalnych są bezpośrednio wiązane przez Sox9 w uszkodzeniu wzmacniającym.69 Podsumowując, chociaż sygnały poprzedzające regulację w górę SOX9 powinny być dalej badane, odkrycia te sugerują, że Sox9 w fibroblastach sercowych reguluje zarówno zwłóknienie, jak i stan zapalny po zawał mięśnia sercowego i może być uważany za nowy cel terapeutyczny.

Prozapalne fenotypy subpopulacji fibroblastów były również intensywnie badane w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS). Croft i wsp. zbadali mysie modele ustępowania i uporczywego zapalenia stawów i wykazali, że białko aktywujące fibroblasty-a (FAPa)-dodatnie fibroblasty gromadzą się w stawie objętym stanem zapalnym.70 Usunięcie FAPa i fibroblastów łagodzi miejscowy stan zapalny i deformację stawu, co sugeruje ich patologiczne funkcje. Co ciekawe, FAPa plus fibroblasty są podzielone na dwie odrębne subpopulacje przez scRNAseq: FAPa plus THY1 plus fibroblasty i FAPa plus THY1- fibroblasty. FAPa plus THY1 plus fibroblasty są zlokalizowane w warstwie podściółki maziowej, podczas gdy fibroblasty FAPa plus THY1- znajdują się w warstwie błony maziowej. Oprócz różnicy przestrzennej te fibroblasty są funkcjonalnie odrębne; adopcyjny transfer FAPa plus THY1 plus fibroblastów do stawu wywołuje ostre miejscowe zapalenie ze zwiększoną infiltracją leukocytów, podczas gdy transfer fibroblastów FAPa plus THY1- powoduje zwiększoną aktywność osteoklastów i deformację stawu bez pogarszania stanu zapalnego. Te funkcjonalnie odrębne fibroblasty obserwuje się również w stawach ludzkich z RZS. Rzeczywiście, FAPa plus THY1 plus fibroblasty są bardziej obfite w stawach pacjentów z RZS niż pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA),70 co stanowi przykład ich zapalnej sygnatury. W innym badaniu zbadano ludzką tkankę maziową za pomocą masowych RNAseq i scRNA-seq i zidentyfikowano trzy główne podzbiory fibroblastów o różnej ekspresji białek powierzchniowych.⁷¹ Wśród nich fibroblasty Pdpn plus THY1 plus CD34− rozszerzają się w strefie okołonaczyniowej zapalnej błony maziowej i są dodatnio skorelowane z nasileniem zapalenia błony maziowej w RZS. Fibroblasty Pdpn plus THY1 plus CD34− wykazują wysoki profil migracji i proliferacji in vitro. Co ciekawe, większość z tych fibroblastów Pdpn plus THY1 plus CD34- wyraża kadherynę-11, która leży u podstaw patologicznych cech mysich fibroblastów maziowych.72 Zbadano również leżący u podstaw mechanizm regulacji prozapalnych fibroblastów w RZS. Wei i wsp. ujawnili, że sygnalizacja Notch3 reguluje różnicowanie THY1 plus sublimujących fibroblastów, które leżą u podstaw zapalenia błony maziowej RA.73 Ubytek genetyczny lub farmakologiczna blokada sygnalizacji Notch3 łagodzi zapalenie stawów i erozję kości w mysim modelu RZS. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te wskazują, że ukierunkowane na fibroblasty zapalne mogą być obiecującą strategią terapeutyczną w RZS.

Fibroblasty działają również jako wrodzone komórki odpornościowe. Pericyty/fibroblasty wyrażają kilka receptorów rozpoznających wzorce, takich jak receptory Toll-podobne (TLR) i promują lokalną kaskadę zapalną. Leaf i wsp. wykazali, że pericyty nerek wyczuwają wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP) uwalniane z uszkodzonych komórek w sposób zależny od TLR i MyD88-.74 W taki sam sposób, jak klasyczne komórki odpornościowe, pericyty aktywują inflamasom NLRP3, co prowadzi do wydzielania IL-1 i IL-18. Odkrycia te pokazują, że śródmiąższowa lokalizacja perycytów/fibroblastów umożliwia im natychmiastowe wyczuwanie początkowego uszkodzenia i działanie jako propagator miejscowego zapalenia. Innym mechanizmem propagacji zapalenia miejscowego jest przyżyciowa obserwacja mikroskopowa, która ujawniła, że ​​pericyty zmieniają swoją morfologię podczas zapalenia i tworzą luki między sąsiednimi perycytami, co ułatwia migrację neutrofili i pełzanie.⁷⁵

Fibroblasty przyczyniają się również do tworzenia TLT w starzejących się uszkodzonych nerkach.4,76 Poprzez wydzielanie homeostatycznych chemokin, takich jak CXCL13 i CCL19, fibroblasty rezydujące w TLT rekrutują 202|ARAI i in. limfocyty i zapewniają funkcjonalne rusztowanie dla TLT, jak omówiono w następnym rozdziale.

4.2|Regulacja progresji guza

W mikrośrodowisku guza (TME) fibroblasty związane z rakiem (CAF) stanowią największy komponent komórkowy w zrębie TME i odgrywają ważną rolę w patogenezie raka.⁷⁷ CAF promują progresję raka poprzez wiele mechanizmów, takich jak przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej oraz wydzielanie czynników wzrostu i cytokin prozapalnych. CAF regulują również rekrutację komórek odpornościowych i tłumią przeciwnowotworową reakcję immunologiczną.^77,78CAFs wykazują dużą różnorodność funkcjonalną i regionalną w zależności od ich organów rezydujących. Na przykład w gruczolakoraku przewodowym trzustki (PDAC) identyfikuje się dwa odrębne podtypy CAF: jeden podzbiór CAF przylega do komórek nowotworowych o podwyższonej ekspresji SMA, podczas gdy drugi podzbiór znajduje się z dala od komórek nowotworowych i wydziela zapalne cytokiny, takie jak IL-6.⁷⁹W raku piersi CAFs dzieli się na trzy subpopulacje w zależności od ich pochodzenia, z których każda ma niezależne zdolności prognostyczne.80 Co ciekawe, badania sugerują, że te heterogeniczne subpopulacje CAF można podzielić na dwa funkcjonalnie odrębne podtypy: CAF promujące raka (pCAFs). ) i CAF ograniczające raka (rCAFs).77,81 Istnienie rCAFs zasugerowała obserwacja, że ​​ubytek genetyczny lub interwencja funkcjonalna proliferujących CAF nie hamuje, ale raczej sprzyja progresji nowotworu.^82-84Chociaż specyficzny marker dla rCAF nie został jeszcze określony, ostatnie badanie wykazało, że rCAF w PDAC charakteryzuje się ekspresją Mifflin,⁸⁵które po raz pierwszy zidentyfikowano jako białko zakotwiczone w glikozylofosfatydyloinozytolu, specyficznie oznaczające mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste.86 U pacjentów z PDAC naciek Meflin plus CAF jest dodatnio skorelowany z korzystnymi wynikami. W analizie podskórnego modelu ksenoprzeszczepu myszy, indukowany lentiwirusem transfer mefliny do komórek zrębu guza osłabił wzrost guza i naciek SMA plus CAF. Podścielisko guzów myszy z nokautem Mifflin wykazuje prostsze i szersze struktury kolagenowe, a poziom ekspresji Mifflin w ludzkim PDAC jest związany ze zmienionymi strukturami kolagenu. Biorąc pod uwagę, że progresja nowotworu jest ściśle związana z przebudową macierzy,87 wyniki te sugerują, że Meflin plus CAF hamują progresję nowotworu poprzez hamowanie przebudowy kolagenu. Chociaż potrzebne są dalsze badania nad mechanizmem leżącym u podstaw rozwoju Meflin plus CAF, regulacja rCAF może być nową strategią terapeutyczną w terapii przeciwnowotworowej.

4.3|Funkcje regeneracyjne

Chociaż szkodliwe działanie fibroblastów wzbudziło zainteresowanie badaczy, jak opisano w poprzedniej sekcji, fibroblasty promują również regenerację tkanek po uszkodzeniu. Rzeczywiście, hamowanie funkcji fibroblastów niekoniecznie prowadzi do lepszych wyników. Na przykład usunięcie Postn i miofibroblastów w sercu utrudnia odpowiednie tworzenie blizn, prowadząc do pęknięcia komory i wyższej śmiertelności.³²

Ostatnie badania wykazały, że w uszkodzeniu i naprawie tkanek specyficzna subpopulacja fibroblastów wywiera działanie regeneracyjne w wielu mechanizmach. W skórze fibroblasty dzielą się na dwie kategorie według lokalizacji: fibroblasty brodawkowate w górnej skórze właściwej i fibroblasty siateczkowate w dolnej skórze właściwej. . W przeciwieństwie do tego, fibroblasty brodawkowate, które są rekrutowane w późniejszym momencie po urazie, przyczyniają się do regeneracji mieszków włosowych. Odkrycia te wskazują, że przestrzennie i funkcjonalnie odmienne podtypy fibroblastów w skoordynowany sposób przyczyniają się do regeneracji ran skóry. Niedawna analiza scRNAseq wykazała również, że fibroblasty w ranach skóry wykazują dużą niejednorodność i można je podzielić na dwanaście podgrup.89 Analiza pseudoczasu i prędkości RNA wykazała, że ​​niektóre z tych klastrów reprezentują stany różnicowania w kierunku fenotypów kurczliwych, podczas gdy inne nabywają fenotypów regeneracyjnych. Co ciekawe, zidentyfikowano unikalną subpopulację fibroblastów skóry wyspecjalizowanych w naprawie tkanek po urazach. Po uszkodzeniu skóry fibroblasty znajdujące się w powięzi, która jest galaretowatą błoniastą strukturą oddzielającą skórę od sztywnej struktury znajdującej się poniżej, wznoszą się na powierzchnię skóry. prowizoryczna macierz. Większość z tych „fibroblastów powięzi” jest znakowana przez engrailed 1 (En1), który po raz pierwszy zidentyfikowano jako marker fibroblastów komórek linii w skórze grzbietowej myszy.⁹¹ Ilość fibroblastów powięziowych w ranie jest dodatnio skorelowana z głębokością blizny. Rzeczywiście, genetyczne zubożenie fibroblastów powięzi zapobiega kierowaniu macierzy do rany i prowadzi do wadliwego bliznowacenia. Wszczepienie nieprzepuszczalnego filmu pod skórę zapobiega migracji fibroblastów powięzi i powoduje powstanie otwartej blizny. Opisano również udział innego unikalnego podzbioru fibroblastów, komórek prekursorowych adipocytów (APS); AP wchodzą w interakcję z CD301b plus makrofagi i przyczyniają się do regeneracji skóry po urazie.⁹² Podsumowując, odkrycia te sugerują, że heterogeniczne subpopulacje fibroblastów o wyspecjalizowanych funkcjach przyczyniają się do regeneracji skóry po urazie.

Te „regeneracyjne fibroblasty” są również obserwowane wnerka. Obserwacje ultramikroskopowe ujawniły, że miofibroblasty migrują wokół uszkodzonych kanalików i wspierają je strukturalnie w modelu uszkodzenia nerek, co sugeruje, że miofibroblasty mogą ułatwiać regenerację komórek kanalików.93 Wykorzystując myszy P0-Cre: DTR, którym podaje się toksynę błonicy (DT) zuboża P0-znakowane rezydualne fibroblasty linii Cre w nerkach, wykazaliśmy, że zubożenie fibroblastów we wczesnej fazie uszkodzenia osłabia regenerację kanalików i nasila uszkodzenie nerek.⁹⁴ Co ciekawe, w odpowiedzi na uszkodzenie fibroblasty zwiększają ekspresję dehydrogenazy retinaldehydowej 2 (RALDH2), enzymu ograniczającego szybkość syntezy kwasu retinowego. Receptor kwasu retinowego (RAR) ulega ekspresji na komórkach kanalików proksymalnych, a krystalina B, produkt docelowych genów RAR, jest regulowana w górę wyłącznie w uszkodzonych komórkach kanalików proksymalnych. Odwrotny agonista RAR osłabia proliferację komórek kanalików in vitro. Biorąc pod uwagę, że kwas retinowy wydzielany przez mezenchym zrębu w embrionienerkijest niezbędny do rozwoju zawiązka moczowodu,^95,96odkrycia te sugerują, że RALDH2 plus miofibroblasty mogą odgrywać ważną rolę w regeneracji uszkodzonych kanalików proksymalnych poprzez sygnalizację kwasu retinowego we wczesnej fazie uszkodzenia.