Nowatorska zapalna komórka dendrytyczna, która jest obfita i przylega do limfocytów T w nerkach pacjentów z toczniowym zapaleniem nerek
Feb 24, 2022
Mechanizmy, które promują miejscowe uszkodzenie zapalne podczas nawrotu toczniowego zapalenia nerek (LN) są w dużej mierze nieznane. Zrozumienie kluczowych komórek odpornościowych, które kierują zapaleniem wewnątrznerkowym, pogłębi naszą wiedzę na temat patogenezy chorób i przyczyni się do opracowania nowych środków terapeutycznych do leczenia LN. W tym badaniu przeanalizowaliśmynerka biopsje od pacjentów z proliferacyjną LN i zidentyfikowano nową populację zapalnych komórek dendrytycznych (infDC) o wysokiej ekspresji w LNnerka, ale w minimalnym stopniu obecny u zdrowego człowiekanerki.Podczas agnostycznej oceny ekspresji transkryptów immunologicznych wnerkiwśród pacjentów z proliferacyjną LN, transkrypt z wyizolowanych kłębuszków o największej nadekspresji był FCER1G, który koduje łańcuch gamma receptora Fc (FcR ). Aby zidentyfikować typy komórek wyrażających FcR, które infiltrująnerkaw LN przeprowadzono badania nanerkabiopsje od pacjentów z aktywną LN przy użyciu mikroskopii konfokalnej immunofluorescencji (IF). To pokazało, że FcR jest obficie obecny w regionie okołokłębuszkowym (PG)nerkaiw mniejszym stopniu w kanaliku śródmiąższowym (TI). Dalsze badania markerów powierzchniowych tych komórek wykazały , że były to FcR plus , MHC II plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 i CD11bV, co sugeruje, że komórki były infDC. Kwantyfikacja infDC wykazała średnio 10-krotnie wyższy poziom infDC w LNnerkaw porównaniu do zdrowychnerki. Co ważne, IF zidentyfikowały limfocyty T CD3 plus, które sąsiadują z tymi infDC w przestrzeni PG LNnerka,podczas gdy oba typy komórek są minimalnie obecne u zdrowychnerka.W ten sposób zidentyfikowaliśmy wcześniej nieopisany DC w toczniunerkiktóre mogą wchodzić w interakcje z wewnątrznerkowymi limfocytami T i odgrywać rolę w patogenezieuszkodzenie nerekpodczas rozbłysku LN.
Słowa kluczowe:zapalne komórki dendrytyczne, toczniowe zapalenie nerek, nerki, autoimmunizacja, adaptacyjna odpowiedź immunologiczna, limfocyty T, SLE
WPROWADZANIE
Toczniowe zapalenie nerek (LN) jest poważnym powikłaniem tocznia rumieniowatego układowego (SLE), które wiąże się ze znaczną zachorowalnością i śmiertelnością. Do 30 procent pacjentów z progresją LN do stadium końcowegochoroba nerek(ESKD) (1). Nie ma konkretnych terapii zatwierdzonych przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Stanów Zjednoczonych do leczenia LN, a obecne terapie dają suboptymalne wskaźniki odpowiedzi ze znaczną cytotoksycznością (2). Wraz z innymi badaczami badamy patologię molekularnąnerkapodczas aktywnej LN, aby lepiej zrozumieć patogenezęuszkodzenie nerekw LN i szlakach, które mogą być konkretnie ukierunkowane na leczenie LN.
CISTANCHE POPRAWI FUNKCJĘ NEREK/NEREK
W trakcie agnostycznej oceny ekspresji transkryptów w mikrosekcji laserowejnerkatkanki z klinicznych biopsji LN odkryliśmy, że transkryptem o największej nadekspresji w kompartmencie kłębuszkowym był FCER1G, kodujący łańcuch gamma receptora Fc (FcR). Założono, że transkrypt ten odzwierciedlał komórki odpornościowe naciekającenerkapodczas aktywnej LN, a prace te podjęto w celu zidentyfikowania typów komórek reprezentowanych przez nadekspresjonowany FcR. Tak więc w tym badaniu wyniki badań transkryptomicznych zostały wykorzystane do prowadzenia badań konfokalnej immunofluorescencji (IF) w celu scharakteryzowania głównych naciekających komórek układu odpornościowego obecnych wnerkapodczas rozbłysku LN. Zidentyfikowaliśmy unikalną populację FcR - wyrażających zapalne komórki dendrytyczne (infDC), która znajduje się w przestrzeni okołokłębuszkowej (PG) i przylega do limfocytów T CD3 plus, co oznacza potencjalną interakcję między populacjami infDC i limfocytów T.
MATERIAŁY I METODY
Projekt eksperymentalnyCelem pracy było wykonanie analizy transkrypcyjnej i IF onnerkabiopsje wykonane przy wybuchu LN w celu zidentyfikowania głównych infiltrujących komórek układu odpornościowego obecnych wnerkaw czasie wybuchu LN. Analiza transkryptomiczna została przeprowadzona w dniunerkabiopsje uzyskane podczas rzutu LN od 58 pacjentów z proliferacyjną LN (klasa III/IV ± V) w latach 2007–2013. Po zakończeniu badań klinicznych wykorzystano biopsje archiwalne. Wykonano mikrodysekcję laserową (LCM) i oddzielnie wyizolowano kłębuszki i kanaliki śródmiąższowe (TI). Żywy dawca preimplantacyjnynerkabiopsje (n=10) służyły jako zdrowe kontrole (HC) i były analizowane równolegle z biopsjami LN. Ten sam nefrolog (AM) leczył wszystkich pacjentów, a jeden doświadczony nefrolog (VA) czytałnerkabiopsje. Rada ds. Etyki Szpitala Fernandez (Buenos Aires) oraz instytucjonalna komisja rewizyjna Uniwersytetu Stanowego Ohio zatwierdziły dochodzenie w sprawienerkabiopsje.
Ekstrakcja i analiza RNA
Biopsje użyte do analizy transkryptomicznej zostały utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE). Z bloczków parafinowych z każdej biopsji wycięto 10 µm skrawki. Po odparafinowaniu wszystkie dostępne kłębuszki i TI rozdzielono metodą mikrodysekcji laserowej (PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Niemcy), wychwytywano i trawiono proteinazą K. DNA usuwano za pomocą DNazy. RNA wytrącono, wyekstrahowano za pomocą kolumn wirowych RNeasy MinElute (Qiagen, Redwood City, CA, USA) i wymyto w wodzie wolnej od RNaz. Ekspresję transkryptu analizowano z 250 ng wyekstrahowanego RNA przy użyciu platformy NanoString nCounter i panelu transkryptów ludzkiej immunologii GX [NanoString Technologies, Seattle, WA, USA; (3–5)]. Panel ludzkiej immunologii v2 składał się z 579 genów odpowiedzi immunologicznej, 6 genów kontroli pozytywnej i 6 genów kontroli negatywnej. Pełną listę tych genów można znaleźć we wcześniejszej publikacji naszej grupy (6). Do konfokalnej mikroskopii IF, zamrożonenerkatkanki z biopsji od czterech pacjentów z aktywną LN klasy IV pobrano z biorepozytorium Ohio State Nephropathology Biorepository. Jako HC zastosowano trzy zamrożone próbki nefrektomii. Nefrektomie wykonano u pacjentów z:nerkowyrak komórkowy. Tkankę otrzymaną do analizy odcięto od tkanki nowotworowej. Otaczająca tkanka użyta do analizy okazała się zdrowa według analizy histologicznej. Nefrektomie były używane jako kontrole, ponieważ potrzebne były zamrożone próbki, a nie mieliśmy zamrożonej tkanki dawcy przeszczepu przechowywanej w naszym biorepozytorium.
Przeciwciała
Wszystkie podstawowe przeciwciała (Abs) stosowane do IF są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1. Przeciwciała stosowane w tym badaniu zostały zwalidowane dla IF przy użyciu ludzkich węzłów chłonnych lub ludzkiej wątroby jako kontroli pozytywnej (dane nieprzedstawione). Stosowanymi kontrolami izotypowymi są normalne królicze IgG ChromoPure, normalne mysie IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), mysie IgG1κ (BioLegend, San Diego, CA, USA) i mysie IgG2bκ (Jackson ImmunoResearch). Drugorzędowymi przeciwciałami stosowanymi do IF były kozie F(ab′)2 anty-mysie IgG 488 (Jackson ImmunoResearch) i kozie anty-królicze IgG 568, kozie anty-królicze IgG 488 i kozie anty-królicze IgG 647 firmy Invitrogen (Thermo Fisher naukowy, Waltham, MA, USA).
CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK
ImmunofluorescencjaMrożona nefrektomia i LNnerkabiopsje pocięto na skrawki (5 µm skrawek na szkiełko), utrwalono w 4% soli fizjologicznej buforowanej paraformaldehydofosforanem (PBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyto PBS (z 00,02% azydkiem sodu). Skrawki zablokowano 5% mlekiem w PBS, a następnie inkubowano z pierwotnym Ab przez noc. Po trzech płukaniach PBS przez 1 godzinę, skrawki inkubowano z fluorescencyjnie znakowanymi drugorzędowymi Abs przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej, a jądra barwiono DAPI (100 ng/ml) przez 10 minut. Skrawki zostały następnie zamocowane za pomocą Prolong Gold (Invitrogen) pod szkiełkami nakrywkowymi. Kontrolne Ab odnoszą się do listy izotypów Ab z odpowiadającymi im drugorzędowymi Ab. Obrazy uzyskano przy użyciu laserowego mikroskopu konfokalnego Olympus FluoView 1000 Laser Scanning Confocal wyposażonego (Olympus Corp., Tokio, Japonia) w system detekcji spektralnej do dokładniejszej separacji fluorochromów (widma FV1000) wraz z soczewką immersyjną ×60 w temperaturze pokojowej.
Mikroskopia ilościowaPoziom ekspresji infDC w LN i HCnerkizostał określony ilościowo na podstawie obrazów, które wybarwiono na infDC przy użyciu anty-CD163. Całkowitą intensywność CD163 w oparciu o ekspresję infDC obliczono stosując oprogramowanie ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Intensywność CD163 uzyskano po odjęciu fluorescencji tła z obrazów izotypowych i drugorzędowych barwionych Ab oraz przez pomiar obszaru i średniej intensywności fluorescencji zielonych pikseli pochodzących z infDC przy użyciu przeciwciała CD163, jak opisano wcześniej (7).
Analiza statystycznaW przypadku analizy transkryptomicznej statystyki opisowe są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe lub jako wartość procentowa. W przypadku zmiennych klinicznych, odpowiednio, stosowano test t, ANOVA lub test sumy rang Wilcoxona. Dla kategorycznych zmiennych klinicznych zastosowano dokładny test Fishera. W przypadku danych z nanociągów, nieprzetworzone zliczenia normalizowano do dodatnich kontroli z domieszką, a następnie transformowano log2. Aby zredukować błąd techniczny, odfiltrowano geny o poziomie ekspresji poniżej średniej plus dwa odchylenia standardowe kontroli negatywnych. Do pozostałych transkryptów zastosowano normalizację ilościową (522 dla kłębuszków i 502 dla TI). Próbki kłębuszków analizowano oddzielnie od próbek TI. Aby określić ekspresję różnicową, ekspresję transkryptów kłębuszkowych i TI z LNnerkiporównano z kontrolami. 1.5-krotna zmiana i p < 0.05="" były="" konieczne,="" aby="" transkrypt="" został="" uznany="" za="" wyrażany="" w="" sposób="" różnicowy.="" do="" analizy="" statystycznej="" mikroskopii="" konfokalnej="" zastosowano="" dwustronny="" test="" t-studenta="" do="" porównania="" dwóch="" grup,="" a="" p="">< 0,05="" uznano="" za="" istotny.="" wszystkie="" analizy="" przeprowadzono="" przy="" użyciu="" origin="" pro="" wersja="" 2020="" (originlab="" corp.,="" northampton,="" ma,="">
WYNIKI
Analiza transkryptomiczna biopsji nerek w zaostrzeniu LN ujawnia znaczącą nadekspresję FCER1G w kłębuszkach nerkowych i TI w zaostrzeniu LNPrzeprowadziliśmy analizę transkryptomiczną na RNA wyizolowanym z kłębuszków i TI przy użyciu LCM znerkabiopsje uzyskane przy proliferacyjnym rozbłysku LN (n=58). Żywy dawca preimplantacyjnyprzeszczep nerkibiopsje zastosowano jako HC (n {{0}}). Analiza transkryptomiczna dla 579 transkryptów immunologicznych wykazała, że FCER1G jest transkryptem kłębuszkowym o największej nadekspresji [Zmiana fałdowa (FC): 3,6, wartość p (p): 1E-10], ale był również znacząco nadeksprymowany w TI (FC: 1.7, p=0.001) przy rozbłysku LN (rysunek 1 i tabela uzupełniająca 2) w porównaniu z HC. Dodatkowo ekspresja FCER1G korelowała z histologicznym wskaźnikiem aktywności choroby NIH (r=-0,43, p=00,01).
Nerka FcR ulega silnej ekspresji w LN Flare i ogranicza się do regionu okołokłębuszkowegoAby scharakteryzować komórkę odpornościową, która wyraża FCER1G, przeanalizowaliśmy kodowane przez FCER1G białko, łańcuch gamma receptora Fc [FcR; (8)] w ludzkim LN i HCnerkatkanki za pomocą analizy mikroskopowej IF przy użyciu swoistego przeciwciała. Analiza IF wykazała, że FcR jest minimalnie wyrażany w kłębuszkach nerkowych (zidentyfikowany przez marker podocytów, synaptopodynę), ale silnie wyrażany w regionach PG i TI biopsji LN flare. Komórki eksprymujące FcR wydawały się mieć typowy wygląd nacieku komórkowego w regionie PG, mikroskopowo (Figura 2). Analiza IF wykazała, że podczas rozdźwięku LN, region PG jest rozszerzony z powodu obecności nacieku komórkowego, podczas gdy region PG jest cienki i bez nacieku komórkowego w HC, jak widać na połączonych obrazach na rycinie 2.
i Rysunek uzupełniający 4. Co najważniejsze, zaobserwowaliśmy słabą do zera ekspresję FcR w LN i HC przy użyciu kontroli izotypowych przeciwciał, które były przetwarzane jednocześnie (dane nie pokazane). Dane te wspierają ustalenia transkryptomiczne, że FCER1G koduje FcR i ulega znacznej nadekspresji w proliferacyjnym rozbłysku LN.
Markery makrofagowe CD11b i CD68 nie kolokalizują z FcR w ludzkiej nerce LN
Na podstawie wcześniejszych opisów śródmiąższowych leukocytów w LN (9-11), przewidzieliśmy, że komórka z ekspresją FcR jest makrofagiem. Wykonaliśmy podwójnie wybarwione skrawki biopsyjne z przeciwciałami anty-FcR, przeciwciałami FcR przeciwko markerom makrofagowym CD68, CD206 i CD11b. Nieoczekiwanie barwienie pod kątem markerów makrofagowych specyficznych dla M2-, CD11b i CD206 [(12); dane nie pokazane], wykazały słabą lub zerową ekspresję w LNnerka.Tymczasem marker panmakrofagowy CD68 (13) wykazał ekspresję kłębuszkową; w ten sposób sugerując, że makrofagi M1 zostały znalezione głównie w kłębuszkach. Jednak barwienie CD68 nie pokrywało się z barwieniem PG i TI dla FcR (Figura 3). Dane te pokazują, że komórki eksprymujące FcR wnerkanie są makrofagami. Chociaż przeciwciała przeciwko CD206, CD68 i CD11b dawały słaby sygnał lub brak sygnału w LNnerka, wybarwili oni komórki Kupffffera w zdrowej wątrobie ludzkiej silnie, potwierdzając wiarygodność i swoistość przeciwciał [(14); dane niepokazane].
FcR skolokalizowany z konwencjonalnym markerem komórek dendrytycznych CD11c i MHCII w nerce LN
Aby określić, czy komórka eksprymująca FcR była komórką dendrytyczną (DC), wykonano trójkolorową mikroskopię IF przy użyciu konwencjonalnego markera DC CD11c i MHCII, o którym wiadomo, że jest wysoce eksprymowany we wszystkich ludzkich DC (15, 16), oprócz inne komórki szpiku. Analiza jakościowa wykazała, że ekspresja FcR (znakowana przy użyciu przeciwciała anty-FcR, a następnie drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z barwnikiem Alexa-594 (Invitrogen), które wykazywała czerwony kolor emisji w mikroskopii konfokalnej) kolokalizowała zarówno CD11c, jak i MHCII. CD11c/MHCII znakowano przy użyciu przeciwciała CD11c/MHC II, a następnie drugorzędowe przeciwciało sprzężone z barwnikiem Alexa-488 (Invitrogen) wykazało zielony kolor emisji w mikroskopie konfokalnym (Figura 4). Kolokalizacja dała żółty kolor odzwierciedlający obecność zarówno fluoryzującego FcR (czerwony), jak i CD11c/MHCII (zielony), które współwystępują w tej samej lokalizacji/komórce w wymiarze XY (Figura 4). Wzór barwienia CD11c pasował do FcR (Figura 4) w regionie PG i TI i żadne przeciwciało nie barwiło się w kłębuszkach. Zgodnie z CD11c, MHCII (Figura 4, dolny rząd) również silnie barwił się w PG, kolokalizując z FcR. Ale, oprócz silnego barwienia PG, MHCII wykazywał również słabe barwienie w kłębuszku, co sugeruje obecność słabej komórki kłębuszkowej eksprymującej MHCII, która może być komórką szpikową.
FcR nie kolokalizował z plazmacytoidalnym markerem komórek dendrytycznych CD123, ale był kolokalizowany z markerem komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów DC-SIGN
Aby zidentyfikować, który podzbiór DC z ekspresją FcR znajduje się w regionie PG podczas rozbłysku LN, tkankę z biopsji barwiono na CD123, swoisty marker plazmocytoidów DC (pDC) (16, 17). Komórki CD123 plus zostały znalezione w regionie TI (ryc. 5, górny rząd), ale były nieobecne w kłębuszkach i regionie PG LNnerki. Komórki CD123 plus były nieliczne, a barwienie CD123 w TI nie zgadzało się z barwieniem FcR. Sugeruje to, że wewnątrznerkowe DC wyrażające FcR w LN nie są pDC. Ekspresja białka regulatorowego sygnału alfa (SIRP) kolokalizowana z FcR (Figura 5, środkowy rząd), co sugeruje, że PG DC nie są szpikowymi konwencjonalnymi DC typu 1 (cDC1) (16). Pozostałe możliwości polegały na tym, że DC PG są szpikowymi konwencjonalnymi DC typu 2 (cDC2) lub DC pochodzącymi z monocytów (moDC). Aby odróżnić te podzbiory DC, oceniono ekspresję DC-SIGN, marker specyficzny dla moDC. DC-SIGN skolokalizowany z FcR w regionie PG (Figura 5, panel dolny), co sugeruje, że PG DC jest moDC.
FcR skolokalizowany z CD64, CD16 i CD14 w okołokłębuszkowym regionie nerki i potwierdził, że DC
Znaleziony w LNNerkaat Flare Are moDC Aby potwierdzić, że DC wyrażające FcR są moDC, scharakteryzowano je dalej przez ocenę obecności dodatkowych markerów powierzchniowych komórek, o których wiadomo, że są obecne na moDC, w tym CD64, CD16 i CD14. Każdy z tych markerów został znaleziony w LNnerkatkanki i kolokalizowane z FcR (rysunek uzupełniający 1).
FcR skolokalizowany z wcześniej zidentyfikowanym krążącym markerem infDC CD163 i CD163 ekspresja jest nadekspresja w LN Flare
Następnie przeprowadzono analizę kolokalizacji CD163 z FcR w celu określenia, czy obserwowana tutaj populacja moDC może być niedawno opisanym krążącym infDC (18). Rycina 6 potwierdza kolokalizację CD163 (zielony) z FcR (czerwony) w regionie PG (Ryc. 6A) i TI (Ryc. 6B) silnie sugerując, że podzbiór moDC obecny wnerkapodczas LN flflare są rzeczywiście infDC. Ponieważ infDC nie wyrażają CD5 (18),nerkatkankę wybarwiono na CD5. Chociaż komórki eksprymujące CD5- były obecne wnerka, nie były one zlokalizowane w pobliżu regionu PG i nie kolokalizowały z FcR (rysunek uzupełniający 2), co sugeruje, że te infDC nie wykazują ekspresji CD5. Aby obliczyć różnicę w infDC w LN i HCnerkiinfDC oznaczono ilościowo mierząc obszar ekspresji CD163 po barwieniu przeciwciałem monoklonalnym anty-CD163 i średnią intensywność fluorescencji CD163. Korzystanie z 16 obrazów kłębuszkowych z 4 flary LNnerkioraz 18 obrazów kłębuszkowych z trzech HCnerki, znaleźliśmy od 9- do 21-krotnie wyższy poziom infDC w nerkach LN w porównaniu z HC (ryc. 6C). Ponieważ wcześniej wykazano, że infDC wyrażają CD11b (19, 20), dalej analizowaliśmy ludzkie LNnerkaze szczurzym anty-ludzkim mAb CD11b (klon M1/70) wraz z przeciwciałem anty-CD163. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami w tym manuskrypcie (Figura 3), klon M1/70 dawał sygnał od słabego do zera w infDC (Figura uzupełniająca 3).
Zapalne komórki dendrytyczne były obecne w bliskiej odległości od limfocytów T przy zaostrzeniu LN
Toczniowe zapalenie nereknerkaprzekroje wybarwiono markerem komórek T CD3 i przeciwciałami przeciwko FcR i CD163 w celu przestrzennej lokalizacji komórek T i infDC. Ustalanie CD3 markerami infDC przeprowadzono na dwa sposoby przy użyciu dwóch różnych klonów przeciwciał anty-CD3 (mysie mAb UCHT1 i królicze mAb SP7) i 2 markery infDC. Barwienie CD3 mAb UCHT1 i anty-FcR wykazało obecność komórek T CD3 plus obecnych w sąsiedztwie FcR plus infDC w regionie PG LNnerka(Rysunek 7A). Barwienie anty-CD163 plus CD3 mAb SP7 (Figura 7B) potwierdziło, że infDC były obecne w bliskim sąsiedztwie limfocytów T CD3 plus w ludzkim LNnerka.Chociaż wybarwianie CD3 markerami infDC wykazywało głównie dyskretne zielone i czerwone zabarwienie dla obu typów komórek, w kilku miejscach czerwone i zielone zabarwienie nakładały się.
DYSKUSJA W tym badaniu zidentyfikowaliśmy nową populację infDC infiltrującąnerkana flarze LN. Te infDC infiltrują, lokalizują się w przestrzeniach PG i TI, a ich ekspresja była 10-krotnie większa w rozbłysku LNnerkaw porównaniu z HC. Dowód na to, że są one nowe, opiera się na ich markerach powierzchniowych, takich jak FcR plus , MHCII plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 i CD11bV . Warto zauważyć, że te infDC były obecne w bliskim przybliżeniu do limfocytów T w regionie PGnerkapodczas rozbłysku LN. Obserwacje z tego badania są poparte wcześniejszymi badaniami, w których wykryto naciek PG DC w różnych mysich modelach doświadczalnego kłębuszkowego zapalenia nerek (21, 22). Jednak nie jest jasne, dlaczego infDC osiada w przestrzeni PG. Dotychczasowa literatura sugeruje, żenerkowyDC rozpoczyna się w kłębuszku i przechodzi od mezangium przez kępkę kłębuszków i limfatykę do drenujących węzłów chłonnych w celu prezentacji antygenu limfocytom T w PG (23). W tym przypadkunerkowyDC może rozpocząć się w kłębuszku, ale zanim LN stanie się klinicznie oczywiste, te DC już wyszły z kłębuszka i osiadły w przestrzeni PG. Sygnały hamujące mogą następnie zostać uwolnione i zablokować cytokiny/chemokiny wymagane do różnicowania monocytów do infDC, co wyjaśnia brak infDC z kłębuszków LN w czasie biopsji. Alternatywnie możliwe jest, że czynniki chemotaktyczne DC są uwalniane bezpośrednio znerkowykomórki kanalikowe przyciągające naciekające DC (24). Spekulujemy, że oba występują w odpowiedzi na bodźce zapalne powodujące akumulację PG i TI infDC podczas LN.
Badanie to wykazało, że PG DC nie są plazmocytoidami ani konwencjonalnymi DC. Ekspresja markerów monocytowych CD14, CD64 i CD16, o których wspomniano wcześniej, potwierdziła, że te PG DC reprezentują moDC (16, 25, 26). W warunkach aktywnego stanu zapalnego lub infekcji, moDC są określane jako infDC (27). Dalsza charakterystyka tych moDC ujawniła unikalną populację infDC nieopisaną wcześniej w ludzkiej LN. Warto jednak zauważyć, że ostatnie badanie transkryptomiczne komórek odpornościowych krwi obwodowej u pacjentów ze SLE zidentyfikowało sygnaturę infDC, którą była CD163 plus, CD14 plus i CD5h, która jest podobna do śródnerkowej populacji infDC opisanej tutaj (18). Ostatnio przeprowadzono obszerną ocenę komórek odpornościowych przy użyciu jednokomórkowego RNA-Seq znerkabiopsje przy rozbłysku LN (28). W tym badaniu zidentyfikowano kilka klastrów monocytów z jednym klastrem monocytów wyrażającym sygnaturę CD163plus , CD14plus , CD16plus , CD64plus i DC-SIGNplus, podobnie do opisanego tutaj infDC. Ponadto, scharakteryzowaną linię monocytów uważano za naciekający podzbiór monocytów, ponieważ była minimalnie eksprymowana u zdrowychnerki. Chociaż te badania IF nie dostarczają dokładnej miary poziomu ekspresji markera linii, a to może umożliwić identyfikację etapów przejściowych dDFOult konwersji monocytów do DC, odkrycia te pozwalają na charakterystykę i orientację przestrzenną w dalszych badaniach ilościowych.
Ta nowa populacja infDC również przypomina wcześniej opisane infDC, z węzłów chłonnych myszy zakażonych Listeria (CD64 plus CD11c plus MHCII plus) (27) i błonę śluzową jelita w celiakii (29). InfDC zostały również wcześniej opisane w ludzkim płynie maziowym z zapaleniem stawów od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (20). Jednak infDC opisane w LNnerkaróżni się od płynu maziowego infDC; pod tym względem brakuje im markerów makrofagowych CD11b i CD206, które są obecne w płynie maziowym infDC. Sugeruje to, że opisana tutaj populacja infDC różni się od populacji infDC obserwowanej przynajmniej w niektórych innych chorobach autoimmunologicznych i może być unikalna dlanerkapodczas rozbłysku LN. Ponadto wcześniejsze badania zidentyfikowały FcεRI [(19, 30); zidentyfikowane przy użyciu przeciwciała antyFcεRI (eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) dla miejsca wiązania przeciwciała], aby być najlepszym markerem do rozróżnienia infDC
RYSUNEK 6|Łańcuch gamma receptora Fc znajduje się w tej samej lokalizacji z wcześniej zidentyfikowanym markerem krążących zapalnych komórek dendrytycznych (infDC) CD163 i CD163. Ekspresja CD163 jest nadeksprymowana w ludzkim LN w porównaniu z HC. (A) Trzy kolorowe obrazy IF, które są reprezentatywne dla 3 ludzkich LNnerkiprzedstawiający kolokalizację CD163 na zielono RYSUNEK 6|(pierwszy) z FcR na czerwono (w środku) w regionie PG. Drugi rząd pokazuje powiększoną część obrazów z górnego rzędu, podświetloną w kropkowanym kwadracie. Trzecia kolumna pokazuje połączenie pierwszych 2 wraz z barwieniem jąder DIC i DAPI (niebieski). (B) Trzy kolorowe obrazy IF, które są reprezentatywne dla 3 ludzkich LNnerkipokazujący kolokalizację CD163 na zielono (pierwszy) z FcR na czerwono (w środku) w regionie cewkowo-śródmiąższowym (TI). (C) Wykres słupkowy przedstawia ocenę ilościową infDCs na podstawie ekspresji CD163 przy użyciu zielonego koloru z barwienia anty-CD163 z obrazów 18 G 3 różnych HC i 16 obrazów kłębuszków z 4 różnych próbek LN przy użyciu oprogramowania ImageJ. Zmierzono sam obszar (wykres po lewej) i pole × średnia intensywność fluorescencji (wykres po lewej) CD163 (zielony) i wykreślono ze średnią ± SD. Dane analizowano za pomocą niesparowanego testu t (jednostronnego) przy użyciu każdego pomiaru, a wartości p wskazano na wykresie słupkowym. RYSUNEK 7|wiersz przedstawia 3 kolorowe obrazy IF, które reprezentują trzy różne LNnerkipokazujący obecność CD3 (marker limfocytów pan T na czerwono) sąsiadujący z CD163 (marker infDC na zielono), które są silnie powiększone z regionu PG. Dolny rząd pokazuje połączone obrazy pierwszych 2 kolumn po prawej i połączone obrazy pierwszych 2 kolumn plus barwienie DIC i DAPI jąder (niebieskie) po lewej. z makrofagów i cDC metodą cytometrii przepływowej. Nasze badania sugerują, że FcR, cytoplazmatyczna podjednostka gamma, za pośrednictwem której działa wiele FcR, w tym FcεRI, Fc RI, Fc RIIIa i Fc RI, a także inne receptory odpornościowe, takie jak GPVI, OSCAR i TREM (8), są wiarygodne marker do badań IF na próbkach pobranych od pacjentów. Jest prawdopodobne, że infDC w LNnerkaekspresjonują Fc?RI, podobnie do Fc RI i Fc RIIIa (rysunek uzupełniający 1), ponieważ obecność FcR pośrednio sugeruje obecność wielu receptorów, w tym Fc?RI.
CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK
Znaczenie scharakteryzowania wewnątrznerkowego typu komórek wyrażających CD163 jest wzmocnione przez ostatnie ustalenia z naszej grupy, ujawniające, że poziomy CD163 w moczu były znacząco wyższe w aktywnej LN w porównaniu z pozanerkowym SLE lub nieaktywnym SLE (31). CD163 moczu korelowało z nasileniem choroby i wskaźnikiem aktywności histologicznej. Podczas gdy badanie przeprowadzone przez Mejia i wsp. (31). sugerując, że CD163 pochodzi z makrofagów M2, teraz sugerujemy, że CD163 w moczu również pochodzi z infDC, potwierdzając ideę, że CD163 w moczu jest biomarkerem, który odzwierciedla aktywność choroby w LN.
W odniesieniu do pochodzenia tych infDC, ekspresja markerów monocytowych sugeruje, że infDC można odróżnić od nacieczonych monocytów wnerkaw stanach zapalnych wywołanych różnymi bodźcami autoimmunologicznymi, w tym kompleksami immunologicznymi. Z drugiej strony obecność CD163 plus CD14 plus infDC u pacjentów z krążeniem tocznia (18) sugeruje, że infDC z krążenia obwodowego dostają się donerkaw LN. Możliwe też, że oba mechanizmy odpowiadają zanerkowyinfDCs. Mechanizmy interakcji infDC z limfocytami T podczas ludzkiej LN są obecnie nieznane. Chociaż kotaining CD3 wraz z markerami infDC pokazuje głównie odrębne populacje obu typów komórek w bliskim sąsiedztwie (ryc. 7B), istnieją również dowody na pewne nakładanie się sugerujące tworzenie immunologicznych synaps i interakcje między tymi infDC i limfocytami T w LNnerka.Jednak limfocyty T są gotowe do migracji do wtórnych narządów limfatycznych; niedawne doniesienie wykazało obecność agregatów immunologicznych zorganizowanych jako trzeciorzędowe struktury limfoidalne (TLS) u pacjentów z LN i mysim LNnerkiktóre przypominają węzły chłonne przez sygnatury genów i skład komórek (32). Jest to zgodne z poprzednim raportem, w którym zidentyfikowano centra rozmnażania z agregatami limfocytów T i B w LNnerka(33). Rozważenie tych ustaleń w kontekście identyfikacji infDCs w LNnerkasugeruje, że infDC w PG i TI mogą być ważnymi czynnikami lokalnej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej w obrębie nerki LN. Chociaż nie jest jeszcze jasne, czy te limfocyty T są rezydentnymi limfocytami T, czy limfocytami T, infDC są znane w różnych stanach chorobowych, aby mieć zdolność do wywoływania rozwoju głównych podzbiorów limfocytów T pomocniczych, a mianowicie Th1, Th2 i Th17 (20 , 34, 35). Chociaż badania in vitro sugerują, że infDC są zaangażowane w inicjację i utrzymywanie odpowiedzi Th17 (19), dalsze badania nad nowym LNnerkanfDC są potrzebne, ponieważ bodziec zapalny i mikrośrodowisko tkankowe determinują funkcję infDC in situ (36).
WNIOSEK
Podsumowując, zidentyfikowaliśmy nową populację infDC, która nie została wcześniej opisana w LNnerka.Te infDC znajdują się w regionie PG i sąsiadują z infiltrującymi limfocytami T. Nasze odkrycia, w połączeniu z najnowszą literaturą identyfikującą krążące CD163 plus infDC w SLE i CD163 w moczu jako cenny marker aktywności choroby w LN, sugerują, że infDC i ich partnerzy z limfocytów T mogą być kluczowymi czynnikami napędzającymi lokalną adaptacyjną odpowiedź immunologiczną podczas aktywnej LN. Konieczne są dalsze badania w celu zdefiniowania podzbiorów komórek T znajdujących się obok infDC i zrozumienia mechanizmów, za pomocą których infDC PG komunikują się z komórkami T w celu wywołania miejscowego zapalenia w LN.