Wpływ Shenkang na zwłóknienie nerek i aktywację śródmiąższowych fibroblastów nerek poprzez szlak JAK2/STAT3

edmund.chen@wecistanche.com

Tło

Przewlekła choroba nerek (PChN) wynika z wielu różnych chorób, które nieodwracalnie uszkadzają nerkę i powodują różnego rodzaju powikłania u pacjentów [1]. W przypadku pacjentów poddawanych dializie jakość życia znacznie się pogarsza, a koszty leczenia są bardzo wysokie [2]. Pierwotny proces patologicznyuszkodzenie nerekprowadzi do normalnościnerkowyzniszczenie miąższu i postępujące tworzenie tkanki bliznowatej, co ostatecznie prowadzi do zwłóknienia. Nerkowyzwłóknienie obejmuje cewkowe zwłóknienie śródmiąższowe i stwardnienie kłębuszków nerkowych [3], prowadzące do zniszczeniartkanka jelitowa i utrata funkcji.Nerkowyzwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe jest typową ścieżką postępującego rozwoju prawie wszystkich PChN i główną przyczyną patologiczną schyłkowej fazychoroba nerek,który charakteryzuje się atrofią komórek nabłonka kanalikowego, infiltracją komórek zapalnych, nieprawidłową aktywacją i wzrostemnerkowyfibroblasty i nadmierna akumulacja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) [4, 5]. Komórki efektorowe, -aktyny mięśni gładkich (-SMA)-dodatnie miofibroblasty, syntetyzują i wydzielają ECM. Aktywacja śródmiąższowych fibroblastów w miofibroblasty może pomóc w naprawie uszkodzonej tkanki. Jednakże, gdy ten proces naprawy jest nieprawidłowy i dochodzi do nadmiernej sekrecji macierzy zewnątrzkomórkowej, dochodzi do nieodwracalnego uszkodzenia nerek. W związku z tym szlak sygnałowy, który pośredniczy w aktywacji miofibroblastów, może być celem łagodzenia procesunerkowyzwłóknienie.

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

Szlak kinazy Janus/przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji (JAK/STAT) jest plejotropową kaskadą sygnalizacyjną dla wielu czynników wzrostu i cytokin [6], która pośredniczy w różnych funkcjach komórkowych, w tym przeżyciu i proliferacji komórek [7]. STAT3 jest aktywowany przez fosforylację tyrozyny (Tyr) w Tyr705 przez kinazę Janus w odpowiedzi na różne czynniki wzrostu i cytokiny, w tym transformujący czynnik wzrostu (TGF- ) [8]. Fosforylowany STAT3 tworzy dimery, które są następnie przenoszone do jądra, gdzie bezpośrednio wiążą się z sekwencją DNA i regulują ekspresję genów docelowych [9]. Aktywacja STAT3 i JAK2 jest zwiększona w włóknistych fibroblastach śródmiąższowych nerek indukowanych jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) [10, 11]. Wzrost fosforylacji STAT3 zaobserwowano również w komórkach NRK-49F traktowanych TGF- -F [12].

Obecnie szeroko stosowanym terapiom PChN często towarzyszą mniej niż zadowalające efekty [13] i częste działania niepożądane. W związku z tym ogromne znaczenie ma zbadanie i zidentyfikowanie skutecznych metod leczenia w celu zapobiegania i kontrolowania występowania i rozwoju PChN w celu poprawy rokowania pacjentów. Shenkang (SK) to powszechnie stosowana mieszanka ziołowa zawierająca rabarbar (Rheum palmatum L. lub R. tanguticum Maxim. ex Balf.), szałwię czerwoną (Salvia miltiorrhiza Bunge), krokosz barwierski (Carthamus tinctorius L.) i traganek (Astragalus mongholicus) bunge). Od lat 90. SK jest stosowany w Chinach w leczeniu PChN i chorób pokrewnych, w tym nefropatii cukrzycowej (DN), przewlekłejniewydolność nerek, kłębuszkowe zapalenie nerek, przewlekłe zapalenie nerek inerkowyniewydolność. Dzięki oczywistym efektom terapeutycznym i nielicznym skutkom ubocznym SK może opóźnić postępnerkowydysfunkcja w PChN. W badaniu klinicznym z udziałem 2200 osób skuteczność SK w ochronie przed przewlekłyminerkowyniepowodzenie i objawy związane z PChN po leczeniu tradycyjną medycyną chińską wyniosły odpowiednio 73,05 i 98,00 procent. Dodatkowo, klirens kreatyniny i poziom kreatyniny w surowicy (SCr) pozostały stabilne, co wskazuje, że SK ma dobrą skuteczność i jest bezpieczna w leczeniu PChN [14]. Potwierdzono, że SK jest w stanie złagodzić CKD inerkowyzwłóknienie poprzez łagodzenie zwłóknienia, zapalenia [15] i apoptozy [16]. Jednak większość istniejących badań na ten temat nie była wystarczająco obszerna i skupiała się głównie na szlakach TGF i pokrewnych. Model UUO jest uznawany za model eksperymentalny do badania zwłóknienia nerek. W niniejszym badaniu zbadaliśmy wpływ SK na aktywację komórek fibroblastów NRK-49F i zwłóknienie nerek u myszy UUO. Ponadto wykazaliśmy, że te lecznicze efekty SK można było osiągnąć poprzez celowanie w szlak JAK2/STAT3 w hodowanych komórkach NRK-49F i mysim modelu UUO.

Słowa kluczowe:Shenkang, przewlekła choroba nerek, zwłóknienie nerek, UUO, aktywacja fibroblastów nerek, szlak JAK2/STAT3

Metody

Chemikalia i odczynniki SK zakupiono od Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (Xi'an, Chiny). Tabletki losartanu potasu zakupiono od Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, Chiny).

Hodowlę komórkową

Linię komórkową fibroblastów nerki szczura (NRK-49F) otrzymano z American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Komórki NRK-49F hodowano w pełnej pożywce, tj. pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (Invitrogen, CA, USA) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny i streptomycyny w atmosferze 5% CO2 i 95 procent powietrza o temperaturze 37 stopni. Następnie komórki traktowano z lub bez TGF- 1 (10 ng/ml) (Novoprotein, Szanghaj, Chiny), blokera receptora angiotensyny (ARB) (1 mg/ml) i gradientowych stężeń SK po przyleganiu i oceniano żywotność komórek.

Testy żywotności komórek

Żywotność komórek NRK-49F określono przy użyciu zestawu Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kyushu, Japonia) zgodnie z instrukcjami zestawu. Komórki NRK-49F wysiano z gęstością 5 × 10 4 komórek na studzienkę w 96-studzienkowych płytkach. Dla każdego zabiegu było 5 powtórzeń. Po 24 godzinach lub 48 godzinach hodowli pożywkę w każdym dołku zastąpiono 100 µl pożywki wolnej od surowicy zawierającej CCK-8 (10:1) i komórki inkubowano w inkubatorze przez kolejne 2 godziny. Absorbancję mierzono przy długości fali 450 nm. Efekt leczenia obliczono jako procent żywych komórek w stosunku do żywych komórek kontrolnych traktowanych tylko nośnikiem.

Zwierząt

Procedury eksperymentalne zastosowane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Pekińskiego Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (nr BUCM{{{{30}}},018,{ {39}}60,419-2023) i zgodne z międzynarodowymi zasadami wykorzystywania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Trzydzieści sześć 8-tygodniowych samców myszy C57BL/6 zakupiono od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). Myszy umieszczono w specjalnym laboratorium zwierzęcym wolnym od patogenów w klimatyzowanym pomieszczeniu (światło: 12-h cykl światło/ciemność; temperatura pokojowa: 25±1 stopień; wilgotność względna: 50} 10 procent ) i losowo podzielona na następujące sześć grup: grupa pozorowana, grupa UUO, grupa ARB oraz grupy SK z wysoką, umiarkowaną i niską dawką. UUO indukowano u myszy w grupie UUO, grupie ARB oraz grupach SK z wysoką, umiarkowaną i niską dawką, zgodnie z wcześniej ustaloną procedurą. Znieczulenie wywołano 2 procentowym izofluranem i podtrzymywano 1,5 procentowym izofluranem. Wykonano podłużne nacięcie o długości 1- do 2- cm w lewym śródbrzuszu i lewy moczowód oddzielono tępo, podwiązano w dwóch miejscach, a następnie przecięto między dwoma podwiązaniami. Następnie zamknięto jamę brzuszną, po czym przez 3 dni podawano analgezję. Myszy w grupie pozorowanej przeszły podobne zabiegi chirurgiczne, w tym znieczulenie przed- i pooperacyjne, laparotomię i tępe oddzielenie moczowodu, bez podwiązania i przecięcia moczowodu. Od drugiego dnia po niedrożności losartan podawano dożołądkowo myszom w grupie ARB w dawce 0,13 mg/10 g (0,15 ml/10 g). SK w wysokiej dawce 0,08 g/10 g (0,13 ml/10 g), umiarkowanej dawce 0,04 g/10 g (0,13 ml/10 g) lub małej dawce 0,02 g/10 g (0,13 ml/10 g) myszy w grupie SK przez żyłę ogonową przez 14 dni po podwiązaniu moczowodu. Sól fizjologiczną (0,13 ml/10 g) podawano przez żyłę ogonową myszom w grupach pozorowanej, UUO i ARB, a sól fizjologiczną (0,15 ml/10 g) podawano przez zgłębnik myszom w grupach pozorowanych, UUO i SK w celu zmniejszenia stronniczość. Po MRI pobrano krew od myszy przez nakłucie serca po uśmierceniu w głębokim znieczuleniu (indukowanym i utrzymywanym z 2 procentowym izofluranem) 14 dnia i zebrano tkanki nerki. Surowicę pobrano z krwi pełnej przez wirowanie w 1000 (× g) (4 stopnie) przez 10 min. Stężenie azotu mocznikowego we krwi (BUN), SCr i cystatyny C (Cys-C) w surowicy oznaczano metodą kolorymetryczną. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienie czerwienią Sirius przeprowadzono odpowiednio w celu wykrycia histopatologii i kolagenu w strukturach zrębu zajętej nerki. W przypadku barwienia HE plastry moczono w wodzie destylowanej po odparafinowaniu, moczono w roztworze barwiącym hematoksyliną (Solarbio Science & Technology, Chiny), a następnie w 1% roztworze alkoholu kwasu chlorowodorowego w celu oddzielenia barw, przemywano wodą z kranu, zmieniano kolor na niebieski i barwiono barwnik eozyna. Zabarwione plastry przemyto wodą destylowaną, odwodniono, klarowano i uszczelniono obojętną gumą. W przypadku barwienia czerwienią Sirius, plastry zostały odparafinowane, wybarwione hematoksyliną Harrisa, przemyte, wybarwione czerwienią Sirius (Solarbio Science & Technology, Chiny), bezpośrednio oddzielone i odwodnione absolutnym etanolem, oczyszczone ksylenem i zamknięte. Pięć pól wizualnychnerkowykorę i obszar kanalików proksymalnych wybrano losowo dla każdej myszy. Oprogramowanie ImageJ zostało użyte do obliczenia czerwonego obszaru, a średni czerwony obszar został obliczony w celu określenia obszaru zabarwionego na czerwono przez Sirius.

MRI in vivo w celu oceny stopnia zwłóknienia nerekMyszy poddano MRI 13 dnia po podaniu SK za pomocą systemu 7T MRI dla małych zwierząt (system Agilent 7T MRI) i body coil. Znieczulenie wywołano 2 procentowym izofluranem i podtrzymywano 1,5 procentowym izofluranem. Myszy umieszczono w pozycji na brzuchu z brzuchem wyśrodkowanym względem środka cewki częstotliwości radiowej i podłączono do czujnika respiratora w celu monitorowania oddychania. Do wzbudzania częstotliwością radiową i wykrywania sygnału zastosowano RAPID Rat Head System. Wszystkie skany wykonano przy swobodnym oddychaniu. Obrazy uzyskano stosując sekwencje obrazowania tensora dyfuzji (DTI), a parametry były następujące: kierunki=30 (b=1004.7s/mm 2 ) plus null (b=0s/mm 2 ), Δ=4ms i δ=16ms. Parametry akwizycji obrazu były następujące: TR/TE=3000ms/50,73ms, =60 stopień , macierz=128×128, FOV=2×2cm i grubość warstwy obrazowania =1mm. Całkowity czas trwania preparatu dyfuzyjnego wynosił 4 ms. Między skanami zastosowano opóźnienie skanowania wynoszące 16 ms i włączono dwa skany b=0s/mm2 w celu ograniczenia efektów relaksacji T1. Całkowity czas skanowania wynosił około 1 godziny. Z powodu wodonerczanerkinieprawidłowości budowy spowodowane niedrożnością moczowodu, do analizy obrazowej oceniano tylko zewnętrzną korę i zewnętrzny rdzeń tkanki nerki szczura. Mapy anizotropii frakcyjnej (FA) otrzymano i obliczono za pomocą oprogramowania VNMRJ4.0. Aby dokładnie zmierzyć intensywność sygnału MRI i określić stopień zwłóknienia między różnymi grupami, dla każdej próbki nerki wybrano pięć płaszczyzn skanowania, a dla każdej płaszczyzny skanowania wybrano losowo trzy małe obszary zainteresowania.

CISTANCHE POPRAWI CZYNNOŚĆ NEREK/NEREK

Analiza Western blotCałkowite białko wyekstrahowano z komórek przy użyciu 500 μl buforu do lizy białka RIPA (Solarbio, Pekin, Chiny). Po odwirowaniu przy 10000 (x g) przez 10 min, do ilościowego oznaczenia białka zastosowano zestaw Bradford protein assay (Applygen, Beijing, China). Równoważne ilości białka (40 ug) denaturowano w 100 stopniach przez 10 minut w buforze ładującym (Applygen, Pekin, Chiny), rozdzielano elektroforetycznie na 8-10 procentowych żelach SDS-PAGE w zależności od względnej masy cząsteczkowej i elektrotransferowano na 0.{{ 10}}μm membrany z polifluorku winylidenu (Millipore, Bedford, MA, USA). Następnie membrany zablokowano w buforze blokującym (Nacalai Tesque, Japonia) w 25±5 stopniach i inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi, w tym -aktyną (Proteintech Group, USA, 1:5000), -SMA (Proteintech Group, USA, 1: 1000), kolagen III (kol. I) (Abcam, Wielka Brytania, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, USA, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, USA, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, Tyr1007) (1:1000) oraz Peroxiredoxin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, USA, 1:800), przy 4 stopnie na noc. Po przemyciu w TBST membrany inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem (Cell Signaling Technology, USA, 1:10000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie przemyto TBST. Następnie do ekspozycji użyto zestawów do wykrywania ECL. Następnie, gęstość optyczną prążków białka odczytano i przeanalizowano za pomocą oprogramowania Image Lab™ do analizy ilościowej. Wartości densytometryczne znormalizowano do gęstości prążka β-aktyny.

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistymCałkowity RNA został wyekstrahowany z komórek lubnerkowytkanki przy użyciu zestawu Monarch® Total RNA Miniprep Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie do zsyntetyzowania pierwszej nici cDNA zgodnie z instrukcją zastosowano system GoScript Reverse Transcription System. Ilościową PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym przeprowadzono w reakcji 20-μl. Startery do genetargetingu zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje mRNA opublikowane przez NCBI i są wymienione w Tabeli 1. Względną liczebność mRNA określono na podstawie stosunku ekspresji specyficznego mRNA do ekspresji mRNA β-aktyny w tej samej próbce i krotności zmiany w stosunku do tego u myszy w grupie pozorowanej lub w komórkach w grupie 0ng/mL TGF- 1 obliczono metodą 2 -ΔΔCt.

Analiza statystycznaWszystkie dane z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów są wyrażone jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS 20.0. Przeprowadzono testy normalności i testy jednorodności dla wariancji. Jeśli dane miały rozkład normalny, do porównania różnic między dwiema grupami zastosowano test t-Studenta, a do porównania zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) (test LSD dla parzystych wariancji i test Dunnetta dla nieparzystych wariancji). różnice między grupami. Jeśli dane nie miały rozkładu normalnego, do porównania różnic między dwiema grupami stosowano nieparametryczny test U Manna-Whitneya, a do porównania różnic między więcej niż dwiema grupami stosowano nieparametryczny test Kruskala-Wallisa. P<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">

Wyniki

Wpływ SK na żywotność komórek NRK-49F po leczeniu TGF- 1

TGF- jest kluczową cytokiną fibrogenetyczną zaangażowaną w zwłóknienie nerek. Najpierw użyliśmy różnych dawek TGF- 1 (0, 10,20, 40 i 80 ng/ml) do stymulowania wzrostu komórek NRK- 49F. Leczenie TGF- 1 przez 24 godziny zwiększyło żywotność komórek w sposób zależny od dawki (ryc. 1a), co jest zgodne z wcześniejszymi wynikami uzyskanymi w teście MTT [17]. Gradientowe stężenia SK (1, 2, 4 i 8 mg/ml) znacząco zmniejszyły wzmocnienie żywotności indukowane przez 10 ng/ml TGF- 1 (ryc. 1b) oraz efekt leczenia przez 48 godzin było bardziej oczywiste niż leczenie przez 24 godziny. Wynik ten wskazuje, że SK może hamować wzrost indukowany przez TGF- 1- fibroblastów nerkowych i zwiększanie żywotności in vitro.

SK hamował ekspresję -SMA indukowaną przez TGF- - i odkładanie się składników ECM w komórkach NRK-49FMiofibroblasty to aktywne fibroblasty charakteryzujące się ekspresją odkładania -SMA i ECM. TGF- 1 jest ważną cytokiną zaangażowaną w produkcję ECM przez miofibroblasty i zwłóknienie [18]. Jak pokazano na rys. 2a i b, zarówno -SMA jak i kol. III były silnie wyrażane w komórkach NRK-49F po traktowaniu TGF- 1, co wskazuje, że hodowane komórki zostały przekształcone w aktywowane miofibroblasty po podaniu TGF- 1. Aby dalej zbadać, czy SK może hamować aktywację nerkowych fibroblastów śródmiąższowych, zbadaliśmy wpływ SK na ekspresję -SMA i kolagenu III w komórkach NRK-49F. Podawanie SK znacząco zmniejszyło ekspresję -SMA (w sposób zależny od dawki) (Fig. 2 i 3a) i kol. III (Fig. 2), co sugeruje, że SK może bezpośrednio hamować indukowaną przez TGF- 1- aktywację komórek NRK-49F. Wystąpiła tendencja do tego, że wpływ 4 ng/ml SK w zmniejszaniu indukowanej przez TGF- 1- ekspresji -SMA i odkładania się składników ECM był lepszy niż w przypadku losartanu (1 mg/l).

SK hamował STAT3 indukowany TGF- 1-, aktywację JAK2 i ekspresję Prdx5 w komórkach NRK-49FAby zbadać możliwe mechanizmy, za pomocą których SK hamuje aktywację fibroblastów, wykryliśmy ponadto ekspresję genów STAT3 i JAK2 oraz poziomy białka w komórkach NRK-49F za pomocą, odpowiednio, RT-qPCR i Western blotting. Komórki NRK-49F wyrażały wyższe poziomy mRNA STAT3 i JAK2 po stymulacji TGF- 1 niż przed leczeniem. SK dramatycznie hamowała ekspresję mRNA STAT3 i JAK2 indukowaną przez TGF- 1- po 24 godzinach (Fig. 3b i c). Fosforylacja STAT3 przy Tyr705 i JAK2 przy Tyr1007 była zwiększona w obecności TGF- 1. SK hamował również fosforylację tych dwóch cząsteczek (ryc. 2). Prdx5, regulator szlaku JAK2/STAT3, był podwyższony w obecności TGF- 1, a to podwyższenie było również odwrócone przez traktowanie SK (ryc. 2). Prawie wszystkie efekty, z wyjątkiem fosforylacji JAK2 i ekspresji kol. III, były silniejsze w grupie SK z wysoką dawką niż w grupie SK z niską dawką. W konsekwencji wydaje się jasne, że SK może hamować indukowaną przez TGF- 1- aktywację fibroblastów NRK-49F poprzez regulację aktywacji JAK2/STAT3. Przy 2 ng/ml lub 4 ng/ml SK miał lepszy efekt w łagodzeniu indukowanej przez TGF- 1- aktywacji STAT3 i JAK2 oraz ekspresji Prdx5 niż losartan.

SK łagodził dysfunkcję nerek wywołaną przez UUO i zmiany morfologiczne nerekMysi model zwłóknienia nerek ustalono przez indukcję UUO. Figura 4 a, b, c przedstawia wskaźniki dysfunkcji nerek w grupie pozorowanej, grupie UUO, grupie ARB oraz grupach SK z wysoką, umiarkowaną i niską dawką po 14 dniach leczenia. Wysoka dawka SK znacząco zmniejszyła poziom Cys-C (P mniejsze lub równe 0.05; Ryc. 4a) i poziomy SCr (P mniejsze lub równe {{12} }.01; ryc. 4c) i SK znacznie zmniejszyły poziom BUN we wszystkich dawkach (P mniejsze lub równe 0,05 lub P mniejsze lub równe 0,01; ryc. 4b). Powyższe wyniki sugerowały, że SK łagodziło upośledzenie funkcji nerek i zwłóknienie nerek, a skutki SK były podobne do skutków losartanu. Barwienie HE nerek ujawniło, że nagromadzenie macierzy zewnątrzkomórkowej, naciek komórek zapalnych, rozszerzenie i/lub zanik kanalików nerkowych, zwyrodnienie i martwica komórek nabłonkowych kanalików nerkowych bez widocznych zmian w strukturze kłębuszków w grupie UUO (ryc. 4d). Zaburzenia czynności nerek zostały złagodzone w różnym stopniu w różnych grupach terapeutycznych w porównaniu z grupą UUO; umiarkowana dawka i wysoka dawka SK osiągnęły najlepsze efekty, chociaż stopień funkcji nerek w grupie pozorowanej operacji nie został osiągnięty w żadnej z grup leczenia.

SK zmniejszyło wartość FA związaną z włóknieniem wykrytą za pomocą DTIJak pokazano na Fig. 5, wartość FA, która ma liniową zależność od stopnia zwłóknienia w rzeczywistej tkance, została określona za pomocą DTI in vivo. W porównaniu z grupą pozorowaną wartość FA w grupie UUO była istotnie zwiększona (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>

SK hamował aktywację fibroblastów i odkładanie się składników ECM u myszy UUODodatkowo oceniliśmy ekspresję markera aktywacji fibroblastów -SMA, białka specyficznego dla fibroblastów -1 (FSP-1) oraz klasycznych składników ECM fibronektyny (FN), col. III i kolagen I (kol. I) w grupach pozorowanych, UUO i SK z umiarkowaną dawką przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym. Ponieważ umiarkowana dawka SK jest równa dawce zalecanej klinicznie i ponieważ ogólna poprawa w grupie z umiarkowaną dawką była wyższa niż w grupie z wysoką i niską dawką, do oceny ekspresji mRNA zastosowano umiarkowaną dawkę SK. Jak pokazano na Fig. 7a ib, umiarkowana dawka SK znacząco złagodziła wzrosty -SMA, FSP, FN, kol. III i płk. I poziomy. Wyniki te były zgodne z wynikami barwienia Siriusred, które wykazały, że czerwony obszar zwłóknienia w zajętej nerce w grupie ARB oraz w grupach SK z umiarkowaną i niską dawką był znacznie mniejszy niż w grupie nieleczonej (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">

Wpływ SK na poziomy STAT3, JAK2 i TGF-mRNA oraz ekspresję cząsteczek regulatorowych i supresora białek sygnalizacyjnych cytokin (SOCS) SOCS1 i SOCS3 u myszy UUOJak pokazano na Fig. 7c, poziomy mRNA TGF-, JAK2 i STAT3 były znacząco podwyższone w grupie UUO w porównaniu z grupą pozorowaną w 14 dniu. W porównaniu z myszami pozorowanymi, myszy UUO, którym podawano SK umiarkowaną dawką, wykazywały znaczny spadek poziomów mRNA JAK2 i TGF-mRNA w 14 dniu po niedrożności, ale SK nie obniżyło znacząco poziomów mRNA STAT3 po UUO. Wynik ten sugerował, że wpływ SK na zwłóknienie nerek i aktywację fibroblastów u myszy UUO może wystąpić poprzez regulację aktywacji JAK2 i STAT3 bez zmian w całkowitej ekspresji mRNA STAT3. Poziom TGF-, niższej cząsteczki STAT3, również został obniżony przez SK w kontekście podwiązania moczowodu. Białka SOCS są uważane za istotne dla negatywnej regulacji sygnalizacji JAK/STAT [19]. W odpowiedzi na UUO poziomy SOCS1 i SOCS3 znacznie wzrosły i uległy znacznemu obniżeniu w grupie SK w porównaniu z grupą modelową (ryc. 7d). Wynik ten sugeruje, że SK może hamować szlak JAK/STAT w celu zmniejszenia ekspresji swoich negatywnych cząsteczek regulatorowych jako sprzężenia zwrotnego.

CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK/NEREK

Dyskusja

Zwłóknienie kanalikowo-śródmiąższowe nerek jest ostateczną powszechną ścieżką schyłkowej niewydolności nerek. Miofibroblasty, które pochodzą z różnych komórek, w tym komórek nabłonkowych, komórek śródbłonka i pericytów, poprzez transdyferencjację nabłonkowo-mezenchymalną (EMT) lub transdyferencjację śródbłonkowo-mezenchymalną (EndoMT), mogą pomóc w naprawie uszkodzonej tkanki poprzez wytwarzanie ECM i -SMA do generować napięcie skurczowe [20]. Wśród tych różnych typów komórek, aktywowane fibroblasty śródmiąższowe są głównym źródłem miofibroblastów, stanowiąc 50% tych komórek [21]. Oprócz -SMA, aktywowane fibroblasty również specyficznie wyrażają FSP-1. TGF- jest zdefiniowany jako główny czynnik napędzający zwłóknienie nerek i stwierdzono, że jest aktywowany w różnych modelach chorób nerek i komórkach nerkowych. Aktywowany TGF- wiąże się z receptorem TGF- i indukuje dalsze cząsteczki sygnalizacyjne, w tym cząsteczki i czynniki transkrypcyjne związane z EMT, EndoMT, aktywacją fibroblastów, produkcją ECM i hamowaniem degradacji ECM, poprzez Smad-w tym TGF- [23], STAT3 jest aktywowany przez fosforylację Tyr w Tyr705 przez kinazy Janus. Aktywowane białko STAT3 wchodzi do jądra w postaci dimeru i wiąże się z genem docelowym. Ponadto STAT3 indukuje transdukcję sygnału szlaku TGF [24]. Rzeczywiście, w modelu UUO, aktywacja STAT3 przy Tyr705 w fibroblastach śródmiąższowych nerek, wraz ze zmianami histopatologicznymi i aktywacją fibroblastów, jest zwiększona od pierwszego dnia, osiągając maksimum w 7 dniu i wzrastając do 14 dnia [25]. STAT3 prawdopodobnie bierze udział w wielu rodzajach chorób nerek poprzez regulację ekspresji genów docelowych, zwłaszcza czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój PChN. W niniejszym badaniu, 14 dnia po niedrożności, poziomy mRNA -SMA, JAK2 i STAT3 były istotnie podwyższone wraz ze wzrostem stopnia zwłóknienia nerek.

Według wcześniejszych badań stwierdzono, że SK i jej składniki zmniejszają uszkodzenia patologiczne, hamują proliferację komórek śródbłonka, łagodzą białkomocz i stwardnienie kłębuszków nerkowych, chronią resztkową czynność nerek i spowalniają progresję choroby, interweniując w ten sposób w CKD i progresji zwłóknienia nerek; jednak nie ma doniesień o aktywacji fibroblastów. Zgodnie z poprzednimi badaniami i naszymi wynikami CCK-8, do aktywacji fibroblastów użyto 10 ng/ml TGF- 1; 1, 2 i 4 mg/ml wybrano jako niskie, umiarkowane i wysokie dawki SK; a 48 godzin został wybrany jako czas interwencji w niniejszym badaniu. W komórkach NRK-49F po stymulacji TGF- 1 wystąpiła zwiększona regulacja -SMA i zmiany morfologiczne, którym towarzyszyła proliferacja i aktywacja komórek, objawiająca się wzrostem żywotności komórek i wytwarzaniem ECM [26, 27]. W tym badaniu potwierdzono, że TGF- 1 reguluje ekspresję genu -SMA i ECM poprzez aktywację wcześniejszego szlaku JAK2/STAT3. Nasze dane wykazały, że SK bezpośrednio hamuje indukowaną przez TGF- 1- aktywację komórek NRK-49F i produkcję ECM in vitro. Ponadto wykazaliśmy, że SK może osłabiać zwłóknienie nerek u myszy UUO in vivo, zmniejszając śródmiąższową akumulację ECM 14 dnia po niedrożności. Wyniki te wskazują, że SK może znacząco osłabiać zwłóknienie nerek poprzez hamowanie aktywacji śródmiąższowych fibroblastów i zmniejszanie ekspresji -SMA. Potencjalnym mechanizmem działania przeciwwłóknieniowego SK jest hamowanie aktywacji fibroblastów poprzez regulację szlaku sygnałowego JAK2/STAT3 zarówno in vitro, jak i in vivo. Umiarkowana dawka SK również znacząco odwróciła regulację w górę TGF- 1 indukowaną przez UUO, co sugeruje, że wpływ SK jest związany z TGF-. Ponieważ TGF- i STAT3 oddziałują ze sobą, SK może hamować STAT3 poprzez celowanie w TGF-, obniżać poziom TGF- poprzez celowanie w STAT3 lub hamować oba. Nasze poprzednie badanie farmakologii systemowej przewidywało STAT3 jako jedną z możliwych cząsteczek docelowych SK [28], co zostało zweryfikowane w niniejszym badaniu. Używamy losartanu, ARB

może znacząco osłabiać włóknienie nerek i apoptozę komórek kanalików nerkowych poprzez hamowanie fosforylacji białka sygnałowego STAT3 w szczurzym modelu UUO [29], jako lek kontroli pozytywnej. Dotychczasowe ustalenia są zgodne z naszymi danymi. Peroksyredoksyny to rodzina peroksydaz zależnych od merkaptanów, które mogą zmniejszać stres oksydacyjny poprzez katalizowanie redukcji nadtlenku wodoru. Poziom Prdx5 w nerce szczura zmniejszył się pierwszego dnia po UUO. Zaobserwowano, że ekspresja Prdx5 stopniowo wzrasta do 5 dni po traktowaniu TGF. Wykazano, że nadekspresja Prdx5 hamuje indukowaną TGF- - fosforylację STAT3 i zmniejsza indukowaną TGF ekspresję SMA i FN w komórkach NRK-49F, co wskazuje, że Prdx5 negatywnie reguluje TGF- - indukowała aktywację STAT3 i zwłóknienie w komórkach NRK-49F [12]. Główny mechanizm regulacyjny leżący u podstaw endogennej sygnalizacji STAT3 obejmuje rodzinę białek SOCS. Po aktywacji STAT3 przez cytokiny, dimer STAT3 jest transportowany do dalszych genów docelowych indukcji jądrowej, w tym SOCS [30]. W szczególności, region SOCS1 hamujący kinazę, który może bezpośrednio wiązać, może znacząco osłabiać zwłóknienie nerek i apoptozę komórek kanalików nerkowych poprzez hamowanie fosforylacji białka sygnałowego STAT3 w szczurzym modelu UUO [29], jako lek kontroli pozytywnej. Dotychczasowe ustalenia są zgodne z naszymi danymi. Peroksyredoksyny to rodzina peroksydaz zależnych od merkaptanów, które mogą zmniejszać stres oksydacyjny poprzez katalizowanie redukcji nadtlenku wodoru. Poziom Prdx5 w nerce szczura zmniejszył się pierwszego dnia po UUO. Zaobserwowano, że ekspresja Prdx5 stopniowo wzrasta do 5 dni po traktowaniu TGF. Wykazano, że nadekspresja Prdx5 hamuje indukowaną przez TGF- - fosforylację STAT3 i zmniejsza ekspresję SMA i FN indukowaną przez TGF- - w komórkach NRK-49F, co wskazuje, że Prdx5 negatywnie reguluje TGF{{ 38}}indukował aktywację i zwłóknienie STAT3 w komórkach NRK-49F [12]. Główny mechanizm regulacyjny leżący u podstaw endogennej sygnalizacji STAT3 obejmuje rodzinę białek SOCS. Po aktywacji STAT3 przez cytokiny, dimer STAT3 jest transportowany do dalszych genów docelowych indukcji jądrowej, w tym SOCS [30]. W szczególności region SOCS1 hamujący kinazę może bezpośrednio wiązać

do JAK2 i hamują fosforylację STAT3 [31]. Aktywacja JAK/STAT indukowana przez UUO powoduje wzrost ekspresji SOCS [32]. Po stymulacji 10 ng/ml TGF- 1 przez 48 godzin, ekspresja białka Prdx5 w komórkach NRK-49F znacząco wzrosła, co jest zgodne z poprzednimi wynikami. SK (4 mg/ml) znacząco obniżył poziom białka Prdx5 po 48 godzinach interwencji. 14 dnia po UUO poziomy mRNA SOCS1 i SOCS3 w zajętej nerce były znacząco podwyższone w grupie UUO w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazuje, że aktywacja sygnalizacji STAT3 po UUO indukowała ekspresję SOCS1 i SOCS3 do ujemnie regulują nadmiernie aktywowany sygnał STAT3. Po 14 dniach interwencji SK poziomy mRNA SOCS1 i SOCS3 znacznie spadły. Wyniki te pokazały, że zamiast bezpośredniego podnoszenia negatywnych regulatorów w celu hamowania sygnalizacji JAK2/STAT3, SK hamowała JAK2/STAT3, powodując w dół regulację negatywnych regulatorów Prdx5, SOCS1 i SOCS3. Zatem JAK2/STAT3 może być bezpośrednim celem terapeutycznym SK dla zwłóknienia nerek.

MRI jest bardzo bezpieczną metodą oceny zmian strukturalnych i fizjologicznych w nerkach bez użycia dożylnego środka kontrastowego [33, 34]. Obrazowanie ważone dyfuzją (DWI) jest dobrze znaną metodą MRI, która służy do obrazowania ruchu molekularnego lub dyfuzji odzwierciedlającej zmiany w mikrostrukturze tkanek biologicznych [35]. DTI to nowa technologia obrazowania opracowana na podstawie obrazowania ważonego dyfuzją (DWI), która może opisywać nie tylko prędkość cząsteczek wody, ale także kierunek ich ruchu, czyli anizotropię. W porównaniu z DWI, DTI jest bardziej czułe i dokładniejsze w odzwierciedlaniu zmian w dyspersji wody. DTI może również dostarczyć dodatkowych informacji o kierunku i wielkości dyfuzji zmierzonej na podstawie FA. Hueper i in. [36] wykazali, że u szczurów DN FA było związane ze stwardnieniem kłębuszków nerkowych, zwłóknieniem śródmiąższowym i uszkodzeniem kanalików nerkowych. Yan i in. [37] stwierdzili, że FA może być biomarkerem wczesnego DN. Kaimori i in. [38] zaobserwowali liniową zależność między wartością FA a stopniem rzeczywistego zwłóknienia tkanek w modelu szczurzym UUO. W tym badaniu zoptymalizowaliśmy parametry, aby skrócić czas skanowania, czas znieczulenia i zużycie zasobów eksperymentalnych. Wyniki DTI były zgodne z barwieniem Sirius red pod względem stopnia zwłóknienia nerek spowodowanego przez UUO i zdolności SK do łagodzenia zwłóknienia nerek. Do pewnego stopnia te odkrycia ujawniły, że SK ma rzeczywisty wpływ na zwłóknienie nerek in vivo. W tym badaniu wykazaliśmy mechanizm, za pomocą którego SK reguluje zwłóknienie śródmiąższowe nerek zarówno in vivo, jak i in vitro. W przyszłych badaniach do dalszej weryfikacji tego mechanizmu wymagane jest zastosowanie inhibitorów lub siRNA do hamowania JAK2/STAT3.

Wnioski

Podsumowując, nasze dane sugerują, że SK może skutecznie hamować aktywację nerkowych fibroblastów i zwłóknienie nerek u myszy UUO poprzez regulację szlaku sygnałowego JAK2/STAT3. Nasze wyniki zapewniają dobre zrozumienie mechanizmu SK w leczeniu chorób nerek. Jednak szczegółowe molekularne mechanizmy leczenia SK w zwłóknieniu nerek wymagają dalszych badań.