Wrodzona strategia wykrywania patogenów obejmująca ubikwitynację białek powierzchniowych bakterii, część 2

DYSKUSJA

Metazoanie wykorzystują ubikwitynację jako wszechstronny mechanizm utrzymywania homeostazy cytozolowej, zapobiegając gromadzeniu się uszkodzonych białek/organelli i broniąc się przed inwazją patogenów (40, 41). Biorąc pod uwagę różnorodność patogenów i różnorodne zestawy napotkanych uszkodzonych białek, identyfikacja wspólnych motywów rozpoznawania substratów i późniejszej ubikwitynacji stanowi inteligentną strategię optymalizacji zasobów. Białka w komórkach eukariotycznych, które są przeznaczone do proteolizy, są zazwyczaj identyfikowane przez trójdzielny motyw degronu (24).

Odporność to zdolność organizmu do zwalczania chorób, w tym odpowiedzi na bakterie, wirusy i inne szkodliwe substancje. Jeśli układ odpornościowy organizmu jest osłabiony, nie będzie wystarczająco silny, aby poradzić sobie z atakiem choroby. Badania wykazały, że niedożywienie ma wpływ na funkcjonowanie układu odpornościowego, czyniąc organizm bardziej podatnym na infekcje i choroby. Białko jest jedną z ważnych substancji dla utrzymania odporności.

Białka składają się z aminokwasów, z których niektóre nazywane są aminokwasami egzogennymi, ponieważ muszą być dostarczane z pożywieniem i nie mogą być syntetyzowane przez organizm. Te niezbędne aminokwasy obejmują tryptofan, leucynę, fenyloalaninę, lizynę, izoleucynę, metioninę, walinę i histydynę. Jeśli organizm nie otrzymuje wystarczającej ilości niezbędnych aminokwasów, może to prowadzić do upośledzonego metabolizmu białek, co może wpływać na funkcjonowanie układu odpornościowego.

Dodatkowo spożycie wysokiej jakości białka pomaga w utrzymaniu prawidłowego układu odpornościowego i funkcji organizmu. Kiedy organizmowi brakuje białka, może to prowadzić do upośledzenia układu odpornościowego, a organizm jest bardziej podatny na choroby. Jeśli organizmowi ludzkiemu brakuje białka przez długi czas, może to spowodować długotrwałe uszkodzenie układu odpornościowego, czyniąc ludzi podatnymi na różne choroby.

Dlatego zbilansowana dieta i odpowiednie ćwiczenia są kluczem do utrzymania spożycia białka. Ludzie mogą zaspokoić zapotrzebowanie organizmu na białko, jedząc więcej pokarmów bogatych w białko, takich jak mięso, drób, ryby, fasola, jaja, produkty mleczne, zboża, orzechy i nasiona. Ponadto umiarkowany wysiłek fizyczny może również zwiększyć zapotrzebowanie organizmu na białko i efektywność wchłaniania. Zrównoważona i zróżnicowana dieta oraz zdrowy tryb życia są kluczem do utrzymania odporności, utrzymania zdrowego i stabilnego organizmu oraz przeciwstawienia się inwazji chorób. Z tego punktu widzenia musimy poprawić naszą odporność. Cistanche może znacznie poprawić odporność, ponieważ polisacharydy w mięsie mogą regulować odpowiedź immunologiczną ludzkiego układu odpornościowego, poprawiać odporność komórek odpornościowych na stres i wzmacniać odporność komórek odpornościowych. Działanie bakteriobójcze.

Kliknij dodatek cistanche deserticola

To skłoniło nas do zbadania, czy podobne motywy można znaleźć na powierzchniach patogenów, gdzie mogą one działać jako proxy do rozpoznawania substratu. Tutaj pokazujemy, że ligazy ubikwityny gospodarza wykorzystują podobne sygnatury molekularne do wykrywania filogenetycznie różnych patogenów. Rozpoznawanie patogenu za pomocą wspólnych wzorców/motywów molekularnych (PAMP) jest dobrze scharakteryzowaną cechą odporności wrodzonej (42). Nasze wyniki sugerują, że sekwencje podobne do degronu w bakteryjnych białkach powierzchniowych działają w sposób równoważny z PAMP, w celu nadania nadzoru nad patogenami wewnątrzkomórkowymi. Ten operand modus może być dalej wykorzystywany przez gospodarza do prezentacji antygenów białek drobnoustrojowych na głównym kompleksie zgodności tkankowej I w celu wywołania silnej odpowiedzi CD8 skierowanej przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym.

Potencjalne znaczenie wykrywania patogenów za pośrednictwem ubikwityny dla obrony gospodarza jest dodatkowo podkreślone przez znaczną resztkową ubikwitynację wykrytą w zmutowanej SPN, której brakuje zarówno BgaA, jak i PspA. Wskazuje to, że istnieją dalsze niezidentyfikowane substraty mechanizmu ubikwityny, a wynikająca z tego redundancja zapewnia solidne przechwytywanie patogenów. Warto zauważyć, że niektóre bezpośrednie pytania dotyczące motywu degronu i jego znaczenia dla bakterii (poza byciem rozpoznawalną jednostką) dostarczają interesującego punktu widzenia ewolucyjnego.

Motyw degronu jest zbędny in vivo, a jeśli już, mutacja lub usunięcie motywu poprawiło trwałość wewnątrzkomórkową, powodując zwiększoną zjadliwość. Potwierdzają to nasze wyniki, że mutacja w motywie degronu może być wykorzystana przez patogeny do uniknięcia rozpoznawania za pośrednictwem ubikwityny, jak widać dla serotypu 19F SPN. Jednak konserwatywny charakter motywu degronu w BgaA w większości serotypów SPN może sugerować strategię przeciwdziałania przyjętą przez bakterie, aby była mniej śmiertelna dla gospodarza.

Może to stanowić okazję dla patogenu do zwiększenia zajmowanych siedlisk. Jednocześnie ubikwitynacja powierzchni bakteryjnej lub wydzielanych białek w motywie degronu może modulować je funkcjonalnie, aby stłumić lub zmienić odpowiedź gospodarza w celu uzyskania ostatecznej korzyści (43). Dlatego obecność lub brak domen funkcjonalnych lub motywów podobnych do eukariotów (takich jak degrony) może zależeć od patogennej niszy i być przystosowana do unikania lub modulowania odpowiedzi immunologicznych gospodarza.

Podobny mechanizm wykrywania patogenów, obejmujący białka wiążące guanylan, jest również zaangażowany w klirens bakteryjny; jednakże, w przeciwieństwie do ubikwitynacji, ich rola jest ograniczona do patogenów Gram-ujemnych (44-47). Ubikwitynacja celuje w patogen niezależnie od pochodzenia Grama, na przykład udokumentowano, że RNF213 celuje w Listeria spp. niezależnie od braku LPS (48). Dlatego nie wykluczamy możliwości jego działania przeciwbakteryjnego również przeciwko SPN.

Patogenna powierzchnia może być ubikwitynowana wieloma typami łańcuchów przez różne ligazy E3 z interakcjami międzyłańcuchowymi (41). W szczególności w przypadku Mtb, Smurf1 i Parkin wykazano, że tworzą typy łańcuchów K48 i K63, które działają synergistycznie w celu degradacji patogenu (12). Zrozumienie mechanistycznej roli ubikwitynacji K48 i ligaz E3 zaangażowanych w scenariusze infekcji jest nadal niedostatecznie zbadane. W przypadku STm przedstawiono, że pojedyncza ligaza E3 ARIH1 celuje w cytozolowy STm za pomocą łańcuchów ubikwityny K48, co prowadzi do ich eliminacji z układu (15). Na podstawie ustaleń naszych i innych osób patogeny znakowane K{12}}Ub są ostatecznie degradowane, gdy są związane z maszynerią proteasomalną.

Jednak to badanie pokazuje dekorację K{0}}Ub określonych białek powierzchniowych bakterii. Wiadomo, że niektóre patogeny aktywnie modyfikują swoje białka powierzchniowe, chroniąc je przed ubikwitynacją i późniejszym zabijaniem, co podkreśla znaczenie lokalizacji substratu ubikwityny na powierzchni (10). Ponadto wiele obowiązkowych patogenów wewnątrzkomórkowych wyewoluowało strategie deubikwitynacji lub składników regulatorowych gospodarza, aby uniknąć klirensu za pośrednictwem ubikwityny (5). Łącznie odkrycia te podkreślają znaczenie wzbudzenia alarmu za pośrednictwem ubikwityny jako podstawowego wewnątrzkomórkowego mechanizmu wykrywania patogenów, kluczowego dla obrony gospodarza.

Nasze badanie wykazało ponadto centralną rolę ligazy SCF E3, szczególnie z FBXW7, w bakteryjnej ubikwitynacji zwiększającej degradację patogenu. Heterozygotyczne mutacje w FBXW7, szczególnie w wariancie R505C (krytyczna reszta w kieszeni rozpoznawania substratu), wywołują wiele raków i białaczkę limfocytową u ludzi (49, 50). Niedawne badanie kohortowe wykazało, że prawie 43 procent pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (PBL) zapada na bakteryjne zapalenie płuc i posocznicę, a następnie infekcje grzybicze (51).

Potwierdza to naszą obserwację zniesionej zdolności komórek gospodarza niosących mutację FBXW7 do wykrywania i eliminowania patogenów. Nasze odkrycia dostarczają zatem nieoczekiwanego molekularnego wyjaśnienia zwiększonego ryzyka infekcji u pacjentów z CLL. Związek między polimorfizmem genetycznym w genach ligazy E3 a podatnością na infekcje bakteryjne jest również potwierdzony przez pacjentów z chorobą Parkinsona, którzy są podatni na dur brzuszny lub trąd (14), co sugeruje znaczący wkład ligaz E3 w odporność gospodarza na infekcje bakteryjne i utrzymanie komórkowego stanu stacjonarnego.

Podsumowując, odszyfrowaliśmy uniwersalny język wykrywania patogenów żyjących w cytozolu, który może być skutecznie stosowany przez gospodarza do rozpoznawania mikroorganizmów w celu późniejszej eliminacji. Podsumowując, odkrycia te rzucają światło na zrozumienie podstawowych komórkowych procesów odpornościowych, które można wykorzystać do wzmocnienia odporności przeciwbakteryjnej.

MATERIAŁY I METODY

Hodowlę komórkową

Obie linie komórkowe ludzkiego raka pęcherzyków płucnych (pneumocyt typu II) A549 [kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC) nr. CCL185)] i linię komórkową gruczolakoraka szyjki macicy HeLa (ATCC nr CRM-CCL{3}}) hodowano w zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle'a (DMEM; HiMedia) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Gibco) w 37 stopniach i 5 procent CO2.

Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu

SPN (R6, serotyp 2, prezent od Tima J. Mitchella, University of Birmingham, Wielka Brytania) hodowano w bulionie Todd-Hewitt uzupełnionym 1,5% ekstraktem drożdżowym w 37 stopniach w 5% CO2. W razie potrzeby do hodowli hodowli SPN stosowano następujące antybiotyki: kanamycynę (200 μg/ml), spektynomycynę (100 μg/ml) i chloramfenikol (4,5 μg/ml). Dziewięćset mikrolitrów hodowanej kultury SPN 0,4 OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) zmieszano z 600 ul 80-procentowego sterylnego glicerolu (32-procentowe końcowe stężenie glicerolu) i przechowywano w głębokiej zamrażarce -80 stopni. Te zapasy glicerolu zastosowano jako inokulum wyjściowe do wszystkich eksperymentów.

Hodowle Escherichia coli DH5 i STm (ATCC 14028) hodowano w bulionie Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 stopni z wytrząsaniem (200 obr./min.), a w razie potrzeby stosowano następujące antybiotyki: kanamycynę (50 ug/ml), spektynomycyny (100 ug/ml), chloramfenikolu (20 ug/ml) i ampicyliny (100 ug/ml). We wszystkich testach zakażenia bakterie hodowano do OD600 ~0,4, a następnie ponownie zawieszano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do podobnej gęstości przed zakażeniem komórek gospodarza.

Badania przesiewowe domniemanych docelowych białek ubikwityny

Wszystkie białka powierzchniowe obecne w proteomie STm i SPN zostały najpierw zidentyfikowane na podstawie opublikowanej literatury. Kompletne sekwencje białkowe białek powierzchniowych uzyskano z UniProt, które następnie wykorzystano do identyfikacji obecności motywów degronu. Zestaw 29 domniemanych motywów degronowych został wybrany z opublikowanej literatury (24, 52, 53) i bazy danych Eukariotycznych motywów liniowych. Moduł regex Pythona został użyty do zidentyfikowania lokalizacji wszystkich takich wyselekcjonowanych motywów w sekwencjach białek powierzchniowych. Następnie przeprowadzono liniowe wyszukiwanie w celu zidentyfikowania obecności reszty lizyny w pobliżu (8 do 14 reszt aminokwasowych) do każdego zidentyfikowanego motywu degronu. Przypuszcza się, że ta reszta lizyny działa jako miejsce przyłączenia ubikwityny. Na koniec, wybrane sekwencje białkowe zostały wprowadzone do IUPred (54), narzędzia do przewidywania struktury białek, aby zlokalizować obecność nieuporządkowanego regionu pomiędzy motywem degronu a proksymalną lizyną. Otrzymane białka (BgaA i PspA dla SPN i RlpA dla STm) wybrano do oceny jako cele ubikwitynacji i dekodowania ich roli w usuwaniu patogenów.

Budowa szczepu bakteryjnego

Wymianę alleli przez rekombinację homologiczną przeprowadzono przy użyciu regionów flankujących geny niosących włożoną kasetę antybiotykową do generowania zmutowanych szczepów zarówno w SPN, jak i STm (tabela S2).

Dla SPN, 500-} bp regionów w górę iw dół genów bgaA, pspA i jego zamplifikowano z genomu za pomocą odpowiednich starterów (tabela S3) i złożono w wektorze pBKS. Po sklonowaniu tych fragmentów, do tego konstruktu wstawiono kasetę oporności na antybiotyki (spektynomycyna dla worka oraz pspA i chloramfenikol dla hysA). Zlinearyzowane rekombinowane plazmidy następnie transformowano do WT SPN przy użyciu peptydu stymulującego kompetencje 1 (GenPro Biotech), rekombinanty wybrano przy użyciu odpowiednich antybiotyków, a zastąpienie genów potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i sekwencjonowania odpowiednich loci genów. W przypadku STm do wytworzenia mutantów z delecją genów zastosowano metodę rekombinazy λ-red (55).

Pokrótce, sekwencje homologiczne do końców genu rope dołączono do sekwencji starterów, które stosuje się do amplifikacji kasety oporności na kanamycynę. Kasetę poddano następnie elektroporacji do szczepu WT STm i wybrano nokauty wygenerowane przez rekombinację homologiczną na podstawie oporności na kanamycynę. Delecję genu potwierdzono za pomocą PCR i sekwencjonowania locus genu. Pełnej długości pspA, hysA i skrócone bgaA-T (1 do 3168 bp) sklonowano pod promotorem P23 w wektorze wahadłowym pIB166 (56) i użyto do komplementacji.

Te zrekombinowane plazmidy zastosowano również do ukierunkowanej mutagenezy w celu wytworzenia różnych wariantów bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R i bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R i pspAΔDegron ) i jego (hysADegron-BgaA i hysADegron-PspA) przy użyciu odpowiednich zestawów starterów (tabela S3) i transformowano do mutantów ΔbgaA i ΔpspA. Wszystkie klony zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Ekspresję różnych wariantów BgaA, PspA i HysA potwierdzono metodą Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał.

Przeciwciała i odczynniki

surowica anty-enolaza i anty-PspA (S. Hammerschmidt, Uniwersytet w Greifswaldzie, Niemcy); surowica anty-BgaA (S. King, The Ohio State University, USA); i przeciwciała specyficzne dla His6 (Invitrogen, MA1-21315), wiązanie K48-Ub (Millipore, 05-1307), wiązanie K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Betyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), dehydrogenaza fosforanu gliceraldehydu (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonina (CST, 9381S), IgA, Kappa ze szpiczaka mysiego, klon TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) i PSMB7 (Invitrogen, PA{25}}). Zastosowano następujące przeciwciała drugorzędowe: znakowane peroksydazą chrzanową (HRP) przeciw królicze (BioLegend, 406401), znakowane HRP przeciw mysie (BioLegend 405306), przeciw królicze Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), przeciw królicze Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), skoniugowana z biotyną anty-mysia immunoglobulina A (Life Technologies, M31115), anty-mysia Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anty-mysia Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anty-koza Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) i FM 4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Ekspresja i oczyszczanie białek

BgaA-T i jego warianty sklonowano w pET28 przy użyciu miejsc restrykcyjnych Xba I/Not I. Rekombinowane plazmidy kodujące BgaA-T z N-końcowym znacznikiem His transformowano do komórek E. coli BL21 (DE3) w celu ekspresji białka. Świeżo stransformowane kolonie hodowano w LB zawierającym kanamycynę (5 0 μg/ml) w 37 stopniach w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin. Jeden procent hodowli pierwotnej dodano do 1 litra bulionu LB i inkubowano w 37 stopniach na wytrząsarce do momentu, gdy OD600nm osiągnęło wartość między 0,6 a 0,8. Ekspresję białka indukowano przez dodanie 100 μM izopropylo- -D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i dalszą hodowlę w 37 stopniach przez 5 do 6 godzin z mieszaniem przy 150 obrotach na minutę.

Komórki zebrano przez wirowanie przy 6 0 obrotach na minutę przez 10 minut w 4 stopniach. Osad komórek ponownie zawieszono w buforze A [25 mM Tris (pH 8,0) i 300 mM NaCl] i poddano lizie przez sonikację. Resztki komórek oddzielono przez wirowanie (14,{8}} rpm, 50 min, 4 stopnie), a supernatant naniesiono na kolumnę Ni-NTA, zrównoważoną buforem A. Kolumnę przemyto 10 objętościami kolumny buforu A i białka znakowane His eluowano imidazolem (250 mM) w buforze A. Wszystkie warianty BgaA-T wyrażano i oczyszczano stosując tę ​​samą procedurę. FBXW7 subklonowano w wektorze pGEX-4T-1 mającym N-końcowy znacznik S-transferazy glutationowej (GST) z wektora pCMV6-Entry-FBXW7 przy użyciu enzymu restrykcyjnego EcoRI.

Znakowany GST FBXW7 był eksprymowany w komórkach E. coli BL21 (DE3) po indukcji ekspresji białka 0,1 mM IPTG i hodowaniu w 30 stopniach przez 4 godziny. GST-FBXW7 z surowego ekstraktu E. coli oczyszczono stosując chromatografię kolumnową Glutation-Sepharose (GE HealthCare). Frakcje zawierające oczyszczone białka połączono i zatężono do 0,5 mg/ml stosując filtr z odcięciem masy cząsteczkowej 10-} kDa (Amicon) przez wirowanie przy 4700 obr./min w 4 stopniach. Czystość białek sprawdzono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie wybarwiono błękitem Coomassie.

Transfekcje komórek gospodarza

BgaA-T klonowano w wektorze indukowanym doksycykliną pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene nr 130261) przy użyciu zestawu do klonowania infuzyjnego (Takara). Pozytywny klon potwierdzono przez sekwencjonowanie Sangera. Mutację FBXW7R505C przeprowadzono przez ukierunkowaną mutagenezę z użyciem pMRX-GFP-FBXW7 jako matrycy i potwierdzono przez sekwencjonowanie Sangera. Wszystkie transfekcje przeprowadzono stosując odczynnik Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), a selekcje przeprowadzono w obecności chlorowodorku blastycydyny (2 ug/ml; HiMedia).

knockdown genów kierowany przez siRNA

Do knockdown określonych genów za pośrednictwem interferencji RNA zastosowano następujące siRNA: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L -004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) i siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Pokrótce, komórki A549 hodowane w 24-płytce przejściowo transfekowano specyficznymi dla genu siRNA lub mieszanką (siControl) (150 pmol) przy użyciu Lipofectamine 3000 zgodnie z instrukcjami producenta. Trzydzieści sześć godzin po transfekcji komórki poddano obróbce do testów Western blotting i immunofluorescencji lub testów ochrony penicyliną-gentamycyną.

Przewidywanie i modelowanie konstrukcji

Wszystkie struktury przewidziano za pomocą AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.{1}}) (57) i zwizualizowano przy użyciu PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, wersja 2. 0 Schrödinger, LLC). Struktury zostały oznaczone kolorami w PyMol na podstawie wyników IUPred (54) w zakresie od uporządkowanego (niebieski) do nieuporządkowanego (czerwony) do białego.

Western blotting

Hodowle SPN wyhodowane do {{0}}.4 OD600nm poddano lizie przez sonikację, a surowe ekstrakty zebrano po odwirowaniu (15, 000 obr./min, 30 min, 4 stopnie). W przypadku A549 monowarstwy przemyto kilka razy PBS i poddano lizie w lodowatym buforze do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 procent Triton X-100, 0,5 procent sodu dezoksycholan i 1 procent SDS] zawierający koktajl inhibitorów proteazy (Promega), fluorek sodu (10 mM) i EDTA (5 mM). Zawiesinę komórek krótko poddano działaniu ultradźwięków i odwirowano w celu zebrania lizatów komórkowych. Białka obecne w lizatach bakteryjnych lub komórkowych A549 (10 lub 20 μg) rozdzielono na 12% żelach SDS-PAGE i przeniesiono na aktywowaną membranę z difluorku poliwinylidenu. Po zablokowaniu w 5% odtłuszczonym mleku błony sondowano odpowiednimi pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami znakowanymi HRP. Bloty zostały ostatecznie wywołane przy użyciu substratu o wzmocnionej chemiluminescencji (Bio-Rad).
Test ochrony penicyliną-gentamycyną

Szczepy SPN hodowane do OD600}nm 0,4 w bulionie Todd-Hewitt uzupełnionym 0,2% ekstraktem drożdżowym (THY) osadzono, ponownie zawieszono w PBS ( pH 7,4) i rozcieńczono w pożywce testowej do infekcji monowarstw A549 z wielokrotnością infekcji (MOI) 10. Po 1 godzinie infekcji, monowarstwy przemyto DMEM i inkubowano z pożywką testową zawierającą penicylinę (10 μg/ml ) i gentamycyny (400 μg/ml) przez 2 godziny w celu zabicia pozakomórkowej SPN. Komórki następnie poddano lizie za pomocą 0,025% Triton X-100, a lizat umieszczono na płytkach agarowych Brain Heart Infusion w celu zliczenia żywotnych SPN. Inwazję procentową obliczono jako [jednostki tworzące kolonie (CFU) w lizacie / CFU użyte do zakażenia] × 100. Aby ocenić przeżycie wewnątrzkomórkowe, 9 godzin po zakażeniu (od początku leczenia penicyliną-gentamycyną), lizaty komórkowe przygotowano jako wymienionych powyżej, i zliczono bakterie wysiane na płytce i przeżywające. Wydajność przeżycia (procent) przedstawiono jako krotność zmiany procentu przeżycia w stosunku do kontroli we wskazanym punkcie czasowym (znormalizowanym do 0 godzin).

Immunofluorescencja

W teście immunofluorescencyjnym komórki A549 lub HeLa hodowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych i infekowano szczepami SPN lub STm przy MOI ~25 przez 1 godzinę, a następnie poddawano działaniu antybiotyku przez 2 godziny. W pożądanych punktach czasowych po infekcji (9 godzin dla infekcji SPN w A549 i 3 godziny dla infekcji STm w HeLa), komórki przemyto DMEM i utrwalono schłodzonym lodem metanolem w temperaturze -2 0 stopni przez 10 minut. Ponadto szkiełka nakrywkowe blokowano 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Komórki następnie traktowano odpowiednim pierwszorzędowym przeciwciałem w 1% BSA w PBS przez noc w temperaturze 4°C, przemyto PBS i inkubowano z odpowiednim drugorzędowym przeciwciałem w 1% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec szkiełka nakrywkowe przemyto PBS i zamontowano na szkiełkach razem z VECTASHIELD z lub bez 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (Vector Laboratories) do wizualizacji za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSM 780, Carl Zeiss ) pod celami naftowymi 40 × lub 63 ×. Obrazy uzyskano po cięciu optycznym, a następnie przetwarzano za pomocą oprogramowania ZEN lite (wersja 5.0). Mikroskopię superrozdzielczą przeprowadzono podobnie przy użyciu Elyra 7 (Carl Zeiss) w trybie SIM. Do analizy kolokalizacji bakterie oceniano przez wizualne zliczanie n > 100 bakterii na powtórzenie.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa

Po zakażeniu SPN i STm komórki przemyto {{0}},1 M buforem z kakodylanem sodu, utrwalonym 2,5% aldehydem glutarowym (Sigma-Aldrich) w 0,1 M buforze z kakodylanem sodu ( Sigma-Aldrich) przez 3 godziny w 4 stopniach. Po utrwaleniu komórki zebrano przez skrobak do komórek i osadzono przy 2 0 00 obr./min przez 10 min. Komórki następnie przemyto 0,1 M buforem kakodylanu sodu i utrwalano 1 procentowym tetratlenkiem osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przez 20 minut w 4 stopniach. Po kolejnych przemyciach buforem kakodylanowym i wodą destylowaną, komórki następnie odwodniono we wzrastających stężeniach etanolu (50, 70, 95 i 100 procent) i tlenku propylenu przez 30 minut i na koniec zatopiono w żywicy epoksydowej (Electron Microscopy Sciences, 14300) przez polimeryzacja w 75 stopniach przez 45 min. Następnie kapsułki przeniesiono do pieca o temperaturze 95 stopni na 45 minut. Ultracienkie skrawki (70 nm) wycięto za pomocą diamentowego noża na Leica EM UC7 Ultramicrotom i wybarwiono 2% octanem uranylu i 1% cytrynianem ołowiu i oglądano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) przy 120 KV.

Ubikwitynacja ex vivo

A549- wyrażający BgaA-T i jego warianty traktowano MG132 (5 μM), a ekspresję białek indukowano doksycykliną (100 μg/ml) przez 24 godziny. Komórki następnie poddano lizie w buforze RIPA i próbki poddano elektroforezie metodą SDS-PAGE (8 procent). Potwierdzenie ekspresji białka i ubikwitynacji BgaA-T i jej wariantów zostało potwierdzone metodą Western blot po sondowaniu odpowiednio przeciwciałami anty-BgaA i anty-K{10}}Ub.

Ubikwitynacja in vitro

Do testów ubikwitynacji in vitro rekombinowane białka oczyszczono w sposób opisany wcześniej (58). Kompleks ligazy E3 SCFFBW7 inkubowano z rekombinowanym 0,1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) i ubikwityną (2,5 ug/ml; Boston Biochem) w obecności oczyszczonego BgaA-T i jego wariantów. Reakcje ubikwitylacji przeprowadzono w buforze testowym [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM trifosforanu adenozyny (ATP), 1 mM -merkaptoetanol i 0,1 procent Tween 20] przez 2 godziny w 25 stopniach . Reakcje zatrzymano 5x buforem Laemmli, rozdzielono na żelach SDS-PAGE i analizowano metodą immunoblottingu przy użyciu przeciwciała anty-BgaA.

Test kinazy in vitro

Aby przeprowadzić test kinazy in vitro, zastosowano system enzymatyczny kinazy GSK3 (Promega) zgodnie z protokołem producenta z następującymi modyfikacjami. W skrócie, 3 μg rekombinowanego BgaA-T dodano do 0,5 μg aktywnego GSK3 z 4{12}} 0 μM ATP w buforze reakcyjnym złożonym z 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) i 50 μM ditiotreitolu. Reakcję inkubowano przez 2 godziny w 30 stopniach i zatrzymano dodając 1x bufor Laemmli. Próbki następnie gotowano i poddawano elektroforezie do Western blotting, jak wspomniano wcześniej. Fosforylowaną BgaA-T wykrywano za pomocą przeciwciała przeciw fosfotreoninie.

Model in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 procent początkowej masy ciała i wyraźna wydzielina z nosa lub oczu. Próbki krwi pobrano przez nakłucie serca w końcowym znieczuleniu, a śledziony wycięto pośmiertnie w celu zliczenia bakterii. Próbki tkanek przetwarzano za pomocą ręcznego homogenizatora tkanek, a homogenaty rozcieńczano seryjnie w PBS przed naniesieniem na płytki z agarem z krwią. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2, a liczbę kolonii bakteryjnych oceniono następnego dnia.

Analiza statystyczna

Do analizy statystycznej wykorzystano GraphPad Prism w wersji 5. Testy statystyczne przeprowadzone dla poszczególnych eksperymentów są wymienione w odpowiednich legendach do rysunków. P < 0},05 uznano za statystycznie istotne. Dane testowano pod kątem normalności iw celu określenia wariancji każdej badanej grupy. Wszystkie analizy wieloparametrowe obejmowały poprawki dla wielokrotnych porównań, a dane przedstawiono jako średnie ± SD, o ile nie zaznaczono inaczej.

ODNIESIENIA I UWAGI

ME Bianchi, DAMP, PAMP i alarminy: wszystko, co musimy wiedzieć o niebezpieczeństwie. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Rozpoznawanie patogenów i sygnalizacja zapalna we wrodzonej obronie immunologicznej. Clin. Mikrobiol. Obj. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Życie w środku: wewnątrzkomórkowy styl życia bakterii cytozolowych. Nat. Wielebny Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Rola wszechobecności w obronie immunologicznej i unikaniu patogenów. Nat. Wielebny Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, System ubikwitynacji w interakcjach bakteryjnych gospodarz-patogen. Mikroorganizmy 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Globalna analiza ubikwitynomu gospodarza i bakterii w odpowiedzi na zakażenie salmonellą typhimurium. Mol. Cela 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Białko powierzchniowe Mycobacterium tuberculosis rekrutuje ubikwitynę, aby wywołać ksenofagię gospodarza. Nat. Komuna. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubikwitylacja lipopolisacharydu przez RNF213 podczas infekcji bakteryjnej. Przyroda 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, kompleks ligazy ubikwitynowej FBXO2/SCF kieruje ksenofagią poprzez rozpoznawanie bakteryjnego glikanu powierzchniowego. Przedstawiciel EMBO 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Metylacja lizyny chroni patogen wewnątrzkomórkowy przed wszechobecnością i autofagią. nauka adw. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, ligaza ubikwitynowa E3 z wyczuciem dla bakterii. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Ligaza ubikwitynowa Smurf1 działa w selektywnej autofagii prątków gruźlicy i przeciwgruźliczej obronie gospodarza. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, liniowe łańcuchy ubikwityny zsyntetyzowane przez LUBAC ograniczają bakterie atakujące cytozol poprzez aktywację autofagii i NF-κB. Nat. Mikrobiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, The ubiquitin ligase parkin pośredniczy w odporności na patogeny wewnątrzkomórkowe. Natura 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Rozszerzanie maszynerii ubikwitylacji komórek gospodarza ukierunkowanej na cytozolową Salmonellę. Przedstawiciel EMBO 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com