Szczepionka MRNA wywołuje zależną od STING przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną

Abstrakcyjny

Szczepionki RNA na bazie lipidów są szeroko stosowane w zapobieganiu i leczeniu chorób, jednak ich mechanizm działania i poszczególne składniki przyczyniające się do takiego działania pozostają do ustalenia. Tutaj pokazujemy, że terapeutyczna szczepionka przeciwnowotworowa złożona z rdzenia protaminowego/mRNA i otoczki lipidowej bardzo skutecznie promuje cytotoksyczne odpowiedzi limfocytów T CD8+ i pośredniczy w odporności przeciwnowotworowej. Mechanicznie, zarówno rdzeń mRNA, jak i otoczka lipidowa są potrzebne do pełnej stymulacji ekspresji interferonów typu I i cytokin zapalnych w komórkach dendrytycznych. Stymulacja ekspresji interferonu-b zależy wyłącznie od STING, a działanie przeciwnowotworowe szczepionki mRNA jest znacząco obniżone u myszy z wadliwym genem Sting. Zatem szczepionka mRNA wywołuje zależną od STING odporność przeciwnowotworową.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

1. Wstęp

Szybki rozwój i ogólnoświatowe zastosowanie szczepionek mRNA w profilaktyce infekcji SARS-CoV-2 pokazały, jaką siłę mają leki na bazie mRNA w opiece zdrowotnej1,2. Ze względu na dużą masę cząsteczkową i ładunek ujemny cząsteczki mRNA muszą zostać zapakowane w nośniki dostarczające, aby skutecznie przedostać się do komórek ssaków. Pakowanie do nośników o wielkości nanometrowej ma również tę zaletę, że chroni cząsteczki mRNA przed degradacją enzymatyczną. Aby spełnić ten cel, opracowano wiele platform dostarczania, takich jak nanocząsteczka lipidowa4, lipopolipleks (LPP)5, liposom-protamina-RNA (LPR)6, lipopleks RNA (RNA-LPX)7 i wirusopodobna cząsteczka szczepionki (VLVP) )8. Chociaż każda platforma ma swoją unikalną strukturę i skład, większość nośników zawiera jonową cząsteczkę lipidu, która ułatwia pakowanie mRNA i ucieczkę cząsteczek mRNA z endosomów. Wraz z sukcesem szczepionek profilaktycznych powszechnie zdano sobie sprawę, że leki mRNA można stosować w leczeniu być może większości, jeśli nie wszystkich typów chorób9e12. Rzeczywiście, terapeutyczne szczepionki przeciwnowotworowe oparte na mRNA były badane przez wiele lat13,14. Ostatnie postępy w badaniach klinicznych wykazały również ich potencjał zastosowania u wybranych pacjentów chorych na raka15e17. W przeciwieństwie do peptydowych szczepionek przeciwnowotworowych przygotowanych z cząsteczek adiuwanta18e20, cząstki szczepionki mRNA mogą również służyć jako samoadiuwanty21.

Na przykład dwuskładnikowa szczepionka przeciwnowotworowa oparta na mRNA, zawierająca wolne mRNA skompleksowane z protaminą, może również aktywować sygnalizację receptora Toll-podobnego 7 (TLR7)22. Jednakże wraz ze wzrostem obaw związanych z ostrą wrodzoną toksycznością immunologiczną nagiego mRNA większość badaczy i firm używa zmodyfikowanego RNA, aby uniknąć wrodzonego rozpoznawania przez receptory TLR23. W konsekwencji składniki lipidowe odgrywają ważną rolę we wzmacnianiu aktywności adiuwantu w cząsteczce szczepionki mRNA, preferencyjnie poprzez aktywację sygnalizacji innej niż TLR. Niedawne badania nad lipidowym, ujemnie naładowanym RNA-LPX składającym się z liposomu 1,2- di-oktadecenylo-3-trimetyloamoniowego (DOTMA, lipid kationowy)/dioleilofosfatydyloetanoloaminy (DOPE, lipid pomocniczy) ujawniły aktywacja osi interleukina 1 (IL1)-antagonista receptora interleukiny 1 (IL-1ra) w regulacji wydzielania cytokin prozapalnych oraz istotna rola aktywacji dwuetapowego szlaku inflamasomu w monocytach24. Co ciekawe, inne niedawne badania nad BNT162b2 na bazie LNP, przygotowanym z ALC-0315 (lipid zjonizowany), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DSPC, lipid pomocniczy) , glikol polietylenowy-2000-N, N-ditetradecyloacetamid (PEG2000-DTA) i cholesterol wykazały kluczową rolę w aktywacji sygnalizacji MDA5 zależnej od interferonu typu I, ale nie TLR ani inflamasomu, w stymulacji obu wrodzona i nabyta odporność szczepionki przeciwko COVID-1925. Badania te wskazują na możliwość, że platformy dostarczania składające się ze zmiennych cząsteczek lipidów mogą opierać się na różnych szlakach przekazywania sygnału dla aktywności szczepionki. Dlatego ważne jest pełne zbadanie funkcji kluczowych cząsteczek i ich kombinacji w celu dalszego udoskonalenia terapii mRNA.

W bieżącym badaniu przeprowadziliśmy eksperymenty mające na celu analizę funkcjonalnej roli poszczególnych składników terapeutycznej szczepionki przeciwnowotworowej. Cząsteczka szczepionki mRNA (MVP) składa się z rdzenia protaminowego/mRNA zamkniętego w otoczce lipidowej składającej się z lipidu kationowego, lipidu pomocniczego, lipidu pegylowanego i cholesterolu (ryc. 1A). Wykazano, że włączenie naładowanego lipidu może ułatwić ukierunkowane dostarczanie RNA26, a dioleoiloetylofosfatydylocholina (EDOPC) i dioleilo-3-trimetyloamoniowy propan (DOTAP) to dwa lipidy kationowe przetestowane w tym celu5,27. Zbadaliśmy stymulację ekspresji interferonu-b (IFN-b), IL-1b i czynnika martwicy nowotworu-a (TNF-a) przez rdzeń mRNA, nośnik wolny od mRNA i cały MVP oraz skorelowali takie aktywności z TLR7, mitochondrialną sygnalizacją przeciwwirusową (MAVS, znaną również jako IPS-1), stymulatorem genów IFN (STING) i adapterem zawierającym domenę TIR indukującym sygnalizację IFN-b (TRIF). Następnie zbadaliśmy rolę protaminy w rdzeniu i lipidu kationowego w otoczce w stymulowaniu ekspresji IFN-b i TNF-a. Na koniec porównaliśmy przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną MVP u myszy typu dzikiego i myszy z nokautem genowym.

Korzyści z cistanche tubulosa-przeciwnowotworowego

2. Materiały i metody

2.1. Materiały

1,2-Dioleilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (EDOPC) (890704), 1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina (DOPE) (850725 ), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleilo-3-trimetyloamoniopropan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC) (850375) zakupiono od Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, USA). Cholesterol (C8667) otrzymano od firmy Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Odczynniki rozpuszczono w etanolu w stężeniu odpowiednio 2 mg/ml dla DSPE-PEG2k, 10 mg/ml dla cholesterolu i DOPC oraz 20 mg/ml dla EDOPC, DOPE i DOTAP. Siarczan protaminy (P4020) otrzymano z firmy Sigma Aldrich. Cząsteczki mRNA kodujące albuminę jaja kurzego (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (mRNA eGFP) (L-7201) i lucyferazę (Luc-mRNA) (L-7204) zakupiono od TriLink Biotechnologies (San Diego, Kalifornia, USA). Wodę wolną od RNaz (W0805-010) otrzymano z GeneDEPOT (Baker, Teksas, USA). Agonista TLR7 imikwimod (tlrimq) i agonista Stinga 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) były produktami firmy Invivogen (San Diego, Kalifornia, USA). Lipofectamine 2000 (11668019) i zestaw do testu RNA Quant-iT™ RiboGreen™ (R11490) zakupiono od Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Rekombinowaną mysz GM-CSF (554586) zakupiono od BD Biosciences (San Diego, Kalifornia, USA). Koktajl inhibitora transportera białka 500 (00-4980-93) był produktem firmy Invitrogen. Zestaw Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) zakupiono od firmy BD Biosciences. Zestaw do izolacji komórek T myszy EasySep™ (19851) otrzymano od STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Następujące przeciwciała zakupiono od BioLegend (San Diego, Kalifornia, USA): anty-CD80-PE-Cy7 (104734), anty-CD86-FITC (105006), anty-CD11b-APC- Cy7 (101226), anty-CD8-BV510 (100752), anty-CD44-APC (103012), anty-CD69-APC (104514) i anty-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anty-CD64- PE-Cy7 (139314), anty-B220-APC (103212), anty-MHCII-BV711 (107643) i anty-CD103-PE (121406). Anty-CD40-FITC (553723), anty-LY6C-AF700 (557979) i anty-IFN-g-PE (554412) pochodziły z firmy BD Biosciences. OVA257e264-DekstramerPE MHCI (JD2163) zakupiono od ImmuDex (Fairfax, Wirginia, USA). Zestawy ELISA dla IL-1b (EM2IL1B) i TNF-a (BMS607-3) zakupiono od firmy Invitrogen, a zestawy ELISA dla CCL5 (DY478) i IFN-b (DY8234) otrzymano od R&D Systems , Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA). Przeciwciała do analizy Western blot, w tym anty-MAVS (4983), anty-STING (13647), anty-TBK1 (3504), antyfosfo-TBK1 (5483), anty-b-aktyna (4970) i ​​anty-GAPDH (5174) zakupiono od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Rysunek 1 Przygotowanie i charakterystyka cząstek mRNA. (A) Schematyczny widok przygotowania cząstek szczepionki. (B) Elektroforeza w żelu agarozowym pokazuje, że cząsteczki mRNA pozostały w studzience do ładowania próbek w próbkach przygotowanych z mRNA/protaminą w stosunku 1:1 do 1:2. (CeF) Charakterystyka cząstek szczepionki mRNA (MVP) w oparciu o procent kapsułkowania, wskaźnik polidyspersyjności, potencjał zeta i wielkość. (G) Reprezentatywne obrazy TEM cząstek MVP2, pasek skali Z 50 nm. (H) Procent ekspresji eGFP po tym, jak komórki DC2.4 traktowano eGFP-MVP przez 16 godzin. (I) Obrazowanie fluorescencyjne komórek DC2.4 wykazujących ekspresję eGFP, pasek skali Z 400 mm. (J) Analiza ilościowa bioluminescencji w BMDC traktowanych MVP zamkniętymi w mRNA kodującym lucyferazę przez 16 godzin. (K) Zmiany w żywotności BMDC traktowanych PBS, nośnikiem wolnym od mRNA, rdzeniem mRNA/protaminowym lub MVP2 zamkniętym w mRNA. Stężenia lecznicze były równoważne mRNA. Dane przedstawiono jako średnią SEM (n Z 3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Linie komórkowe i hodowla komórkowa

Linię mysich komórek dendrytycznych DC2.4 uzyskano z ATCC (Manassas, VA, USA) i hodowano w RPMI-1640 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny. Linię komórek czerniaka mysiego B16-OVA uzyskano od dr Kennetha Rocka z Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, USA). Komórki B16-OVA hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Linię komórkową mysiego gruczolakoraka okrężnicy MC38 zakupiono od ATCC. Komórki modyfikowano pod kątem ekspresji OVA i hodowano w DMEM z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Hodowlę komórkową utrzymywano w temperaturze 37°C z 5% CO2.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

2.3. Przygotowanie cząstek szczepionki mRNA

Wszystkie cząstki szczepionki mRNA przygotowano przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego NanoAssemblr Benchtop firmy Precision Nanosystems, Inc. (Vancouver, BC, CAN) przez zmieszanie fazy organicznej i fazy wodnej. Aby przygotować fazę organiczną, EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), cholesterol (10 mg/ml) i bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) rozpuszczono w etanolu i mieszano w temperaturze 34°C. :30:35:1 M przy natężeniu przepływu 9 mL/min. Aby przygotować rdzeń mRNA w fazie wodnej, mRNA zmieszano z siarczanem protaminy w stosunku 1:1 (w/w) w instrumencie mikroprzepływowym przy szybkości przepływu 9 ml/min. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze 20°C rdzeń mRNA w fazie wodnej zmieszano z fazą organiczną w celu wytworzenia cząstek szczepionki mRNA. Po 20 minutach zawiesinę cząstek szczepionki przeniesiono do ultraodśrodkowego filtra Amicon (MWCO 30 kDa) i dodano wodę o czystości molekularnej 9-, aby rozcieńczyć stężenie etanolu z 25% do 2,5%. Zawiesinę cząstek następnie zatężono przez odwirowanie przy 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) w temperaturze 4°C. Do stężonego produktu dodano równą objętość 2 PBS w celu dostosowania ciśnienia osmotycznego.

2.4. Test opóźnienia żelu

Najpierw analizowano rdzeń mRNA/protamina metodą opóźniania w żelu. W skrócie, rdzeń mRNA/protaminowy zawierający 0,5 mg mRNA załadowano do studzienki 1% żelu agarozowego w 1 roztworze TBE i przeprowadzono elektroforezę przy 120 V przez 30 minut (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, Kalifornia). Prążki RNA barwiono Gelredem (Biotium, Hayward, Kalifornia) i wykrywano systemem GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Charakterystyka cząstek szczepionki mRNA

Rozkład wielkości i potencjał zeta mierzono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Szybkość kapsułkowania określono przy użyciu zestawu do oznaczania RNA Quant-iT™ RiboGreen™ RNA. W skrócie, próbkę cząstek szczepionki zawierającą 0,5 mg mRNA rozcieńczono buforem TriseEDTA (10 mmol/l TriseHCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,5) z lub bez 2% Triton-X100 w { {10}}płytka dołkowa. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37°C do każdej studzienki dodano RiboGreen i zmierzono intensywność fluorescencji. Wydajność kapsułkowania obliczono jak pokazano w równaniu. (1): Transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) cząstek szczepionki przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisaną procedurą9.

2.6. Zwierząt

Wszystkie operacje na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Metodystycznego w Houston (numer protokołu AUP06200042). Myszy trzymano w środowisku, które całkowicie spełniało standardy regulacyjne Narodowego Instytutu Zdrowia i Amerykańskiego Stowarzyszenia Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. Myszy C57BL/6J typu dzikiego i myszy zmodyfikowane genetycznie, w tym myszy Tlr7/, Sting/, Mavs/ i Trif/ zakupiono od Jackson Laboratory.

2.7. Wytwarzanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC)

Komórki szpiku kostnego wypłukano z kości udowej i kości piszczelowej kompletnym RPMI 1640. Czerwone krwinki poddano lizie buforem do lizy ACK, a niedojrzałe komórki szpiku kostnego hodowano w RPMI 1640 uzupełnionym 20 ng/ml rekombinowanego mysiego GM-CSF przez 10 dni w temperaturze 37°C i 5% CO2. Pożywkę do hodowli komórkowej odświeżano w dniach 3, 6 i 8, a nieadherentne komórki dendrytyczne zebrano w dniu 10.

2.8. Pomiar cytokin i chemokin

BMDC wysiano na płytkę z 24-studzienkami przy gęstości 5  105 komórek/studzienkę. Po 1 godzinie osiadania komórki traktowano cząstkami szczepionki 1 mg/ml imikwimodu, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP (1 mg/ml ekwiwalentu mRNA) lub kontrolami. Pożywki do hodowli komórkowych zebrano 24 godziny później i zmierzono poziomy TNF-a, CCL5, IFN-b i IL-1b za pomocą zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA), postępując zgodnie z procedurami sugerowanymi przez producenta.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

2.9. Analizy transfekcji DC, dojrzewania DC i stymulacji

Aby przeanalizować skuteczność transfekcji DC in vitro, komórki DC2.4 wysiano w ilości 2,5 105 komórek/studzienkę na płytce 24-studzienkowej. Komórki traktowano cząsteczkami zamkniętymi w mRNA kodującymi eGFP lub lucyferazę w końcowym stężeniu 1 mg mRNA/ml. Komórki zebrano 24 godziny później, przemyto 2% FBS w roztworze PBS, a następnie ponownie zawieszono w tym samym roztworze przed zastosowaniem do analizy metodą cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San Jose, Kalifornia). . Aby zmierzyć dojrzewanie DC i prezentację antygenu in vitro, BMDC wysiano w ilości 2,5  105 komórek/studzienkę na płytce 24-studzienkowej i traktowano 1 mg/ml OVA-MVP przez 24 godziny. BMDC barwiono przez 30 minut przeciwciałami swoistymi dla CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 i CD86 pod kątem dojrzewania DC oraz anty-H-2 Kb (SIINFEKL) w celu prezentacji antygenu. Aby określić siłę stymulacji in vivo, myszy C57BL/6J zaszczepiono jednokrotnie 10 mg OVA-MVP na mysz w poduszce stopy i zebrano drenujące LN podkolanowe 24, 48 i następujące markery powierzchniowe komórek: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Cytometria przepływowa analizuje aktywację i proliferację limfocytów T

Aby zmierzyć aktywację limfocytów T in vivo, myszy zaszczepiono jednorazowo 10 mg OVA-MVP i wyizolowano LN podkolanowe po 24 lub 48 godzinach. Komórki T barwiono następującymi przeciwciałami: CD45, CD3, CD4, CD8 i CD69. W celu wykrycia limfocytów T specyficznych dla antygenu pobrano guzy, śledzionę i podkolanowe węzły chłonne 5 dni po drugim szczepieniu. Tkanki poddano obróbce w celu wytworzenia zawiesin pojedynczych komórek, a komórki wybarwiono przeciwciałami specyficznymi dla limfocytów T i dekstramerem OVA257e264-MHCI zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zmierzyć wewnątrzkomórkowy poziom IFN-g, 2  106 splenocyty lub komórki wyizolowane z podkolanowych węzłów chłonnych i guzów stymulowano 10 mg/ml peptydu OVA257e264 w pełnej pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 55 mmol/l b-merkaptoetanolu i 1 inhibitorem transportera białkowego koktajl na 18 godz. Komórki zebrano i wybarwiono przeciwciałami specyficznymi dla limfocytów T. Po utrwaleniu i permeabilizacji za pomocą zestawu Cytofix/Cytoperm komórki wybarwiono przeciwciałem anty-IFN-g i poddano analizie za pomocą cytometru przepływowego BD LSR II (BD Biosciences). Aby zmierzyć proliferację komórek T, komórki T wyizolowano ze śledziony myszy transgenicznych OT-I przy użyciu zestawu do izolacji mysich komórek T. Barwiono je 1 mmol/l CFSE w RPMI 1640 zawierającym 200 mg/ml BSA przez 10 minut w temperaturze 37°C. Limfocyty T znakowane CFSE przemywano dwukrotnie 5 objętościami zimnego, kompletnego RPMI 1640. W międzyczasie dojrzałe BMDC traktowano MVP kapsułkowany w mRNA OVA w stężeniu 2 mg/ml przez 24 godziny przed izolacją komórek T. Gdy komórki T były gotowe, BMDC i komórki T hodowano wspólnie w stosunku 1: 5 (DC: T) przez 72 godziny. Komórki zebrano i wybarwiono powierzchniowymi przeciwciałami dla limfocytów T. Proliferację badano przy użyciu cytometru przepływowego BD LSR II (BD Biosciences) i analizowano. Wszystkie wyniki cytometrii przepływowej analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo v10 (Ashland, OH, USA).

2.11. Śledzenie ekspresji białka u żywych myszy

Myszy BALB/c leczono przez wstrzyknięcie do opuszki stopy 10 mg MVP zamkniętego w mRNA Luc. Wstrzyknięto im dootrzewnowo 30 mg RediJect D-lucyferyny na mysz 6, 12, 24 lub 48 godzin później i zmierzono bioluminescencję za pomocą systemu obrazowania Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, USA).

2.12. Test ELISpot

Płytki filtracyjne IP przepłukano wstępnie 50 ml 35% etanolu i dokładnie przemyto 3 razy PBS przed odparowaniem etanolu. Płytki następnie powlekano przeciwciałami wychwytującymi anty-IFN-g w temperaturze 4°C przez noc. Płytki blokowano pełną pożywką RPMI 1640 zawierającą 55 mmol/l b-merkaptoetanolu przez 2 godziny w 37°C. Komórki (1  105 splenocytów, 1  105 komórek z LN podkolanowego) wysiano do każdej studzienki i stymulowano przez 36 godzin 10 mg/ml peptydu OVA257e264. Pożywkę odrzucono, a komórki przemyto 4 razy PBST (PBS zawierający 0,05% Tween 20) i dwukrotnie PBS. Po ostatnim płukaniu dodano przeciwciało wykrywające anty-IFN-g i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Płytki przemyto 4 razy PBST i dwukrotnie PBS, dodano awidynę-HRP i inkubowano przez kolejne 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec płytki ponownie przemyto PBST i PBS, jak opisano powyżej, nałożono 50 ml substratu AEC i obserwowano reakcję punktową. Kiedy plamy stały się widoczne, reakcję zatrzymano przez odrzucenie substratu AEC i przepłukanie go 5 razy wodą podwójnie destylowaną. Po całonocnym suszeniu na powietrzu płytki skanowano i analizowano przy użyciu analizatora CTL ImmunoSpot Series S5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, Ohio, USA).

2.13. Analiza Western blot

Zebrano BMDC pochodzące od myszy typu dzikiego, Mavs KO lub Sting KO i komórki poddano lizie w buforze do lizy komórek RIPA uzupełnionym inhibitorami proteazy i fosfatazy. Stężenie białka w lizacie komórkowym mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA. Próbki białek rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i przeniesiono na membranę z difluorku poliwinylidenu (PVDF). Ekspresję MAVS i STING wykryto po inkubacji membrany z przeciwciałem anty-MAVS lub anty-STING w rozcieńczeniu 1:2000, a następnie immunodetekcji z użyciem SuperSignal West Pico i Femto Chemiluminescent Substrate. Aby zmierzyć aktywację szlaku STING, BMDC pochodzące od myszy typu dzikiego traktowano MVP zamkniętym w nośniku lub mRNA OVA we wskazanym stężeniu przez 2 godziny. Komórki poddano lizie i poddano analizie Western blot z przeciwciałami anty-TBK1 i antyfosfo-TBK1 w rozcieńczeniu 1:2000.

2.14. Test przeciwnowotworowy

Mysie modele nowotworów wygenerowano poprzez zaszczepienie podskórnie 2  105 komórek B16-komórek czerniaka OVA lub komórek 5  105 MC38-OVA na mysz w lewy bok od 6 do {{5} }tygodniowe samice myszy C57BL/6J. Myszy losowo przydzielono do grup terapeutycznych i leczono dwukrotnie w odstępie 7 dni 10 mg OVA MVP lub grupą kontrolną w poduszce łapy. Wzrost guza monitorowano co 2 dni. Objętość guza obliczono zgodnie z równaniem. (2):

Myszy uśmiercono 5 dni po drugim szczepieniu i rejestrowano masę tkanek nowotworowych.

2.15. Analiza statystyczna

Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnią SEM. Statystyki oceniano za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA, stosując poprawkę Tukeya dla porównania wielu grup i niesparowanego dwustronnego testu t dla porównania dwóch grup. Dane analizowano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{1{12}}}}5 uznano za istotne statystycznie (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Wyniki

3.1. MVP pośredniczy w silnej ekspresji mRNA w komórkach dendrytycznych (DC)

Przygotowaliśmy cząstki szczepionki typu rdzeń-powłoka w dwuetapowym podejściu mikroprzepływowym (ryc. 1A) i systematycznie ocenialiśmy poszczególne składniki nanocząstki, aby złożyć cząstkę szczepionki o wysokiej stabilności, wysokim wychwycie komórkowym i wysokim potencjale ekspresji w DC. Elektroforeza żelowa ujawniła, że ​​stabilny rdzeń mRNA może zostać utworzony, gdy stosunek mRNA do protaminy będzie wynosić 1 lub mniej (ryc. 1B). Używając mRNA kodującego eGFP jako markera zastępczego, odkryliśmy, że kompozycja lipidów w stosunku molowym 34% EDOPC/30% DOPE/35% cholesterolu/1% DSPEPEG2k zapewniała idealną szybkość kapsułkowania i najlepszą wydajność ekspresji (Tabela 1, Informacje dodatkowe rys. S1AeS1D). Zmiana stosunku ładunku nie zmieniła znacząco szybkości kapsułkowania, wskaźnika polidyspersyjności ani ładunku powierzchniowego cząstek (tabela 2, rys. 1CeE); jednakże wielkość powstałych cząstek wynosiła od 70 do 80 nm, gdy stosunek wynosił od 12 do 16, w porównaniu do średnicy 120–130 nm, gdy stosunek wykraczał poza zakres (ryc. 1F i G). Najlepszą ekspresję wykryto w komórkach DC2.4 traktowanych MVP2, które miały stosunek ładunku 12 (ryc. 1H i I). Podobny wzór zaobserwowano, gdy cząstki przygotowano z mRNA kodującym lucyferazę i wykryto ekspresję zależną od dawki (ryc. 1J). Cząstki zamknięte w mRNA wykazywały pożądaną stabilność, ponieważ nie traciły aktywności po liofilizacji lub zamrażaniu i rozmrażaniu (ryc. S1E i S1F). Ponadto nie stwierdzono cytotoksyczności po potraktowaniu komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) samym rdzeniem mRNA, cząstką nośnika przygotowaną bez cząsteczek mRNA lub MVP2 zawierającym mRNA (ryc. 1K). Zatem MVP2 wykazywał najlepszy potencjał ekspresji. Wykorzystano go we wszystkich dalszych eksperymentach w badaniu i oznaczono go jako MVP w pozostałej części tekstu. Cząsteczki MVP mogą skutecznie dostarczać cząsteczki mRNA in vivo i nie stwierdzono wykrywalnej toksyczności ze strony MVP zamkniętego w mRNA w oparciu o zmiany masy ciała (ryc. S1GeS1I).

3.2. MVP skutecznie indukuje prezentację antygenu i aktywację limfocytów T in vitro i in vivo

Przygotowaliśmy rdzeń mRNA, nośnik wolny od mRNA i MVP zamknięty w mRNA OVA i zastosowaliśmy je do testowania dojrzewania DC i prezentacji antygenu (ryc. 2A). BMDC traktowane MVP wykazywały zależną od dawki nadekspresję markerów dojrzewania DC, w tym CD40, CD80 i CD86 (ryc. 2BeD). Traktowanie albo nośnikiem wolnym od mRNA, albo MVP zamkniętym w mRNA wywołało nadekspresję MHC I (ryc. 2E), wskazując, że efekt był powiązany z nośnikiem, a nie z kompleksem mRNA. Ponadto traktowanie MVP spowodowało wyświetlenie na powierzchni komórki kompleksu epitop antygenu OVA257e264-MHC I (SIINFEKL-MHC I), który wykryto za pomocą przeciwciała anty-SIINFEKL-MHCI (ryc. 2F), wykazując skuteczne przetwarzanie antygenu i prezentację przez BMDC . Co więcej, wspólna inkubacja BMDC traktowanych MVP z B3Z, linią komórek T CD8þ, która specyficznie rozpoznaje epitop OVA257e264, lub komórkami T wyizolowanymi ze śledziony myszy OT-I, które eksprymują komórkę T specyficzną dla OVA257e264- receptor, wywołał wydzielanie IL-2, czego nie obserwowano w komórkach T połączonych z DC traktowanymi samym nośnikiem lub samym rdzeniem mRNA/protaminowym (Fig. 2G). Analiza metodą cytometrii przepływowej wykryła 32,5% proliferacyjnych limfocytów T CD8þ po wspólnej inkubacji z MVP (ryc. 2H i I). Cząstki MVP zamknięte w mRNA OVA zastosowano także do leczenia myszy poprzez wstrzyknięcie śródskórne. Badanie komórek w drenujących węzłach chłonnych ujawniło stały wzrost ekspresji CD86 zarówno wśród klasycznych DC (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC), jak i plazmocytoidalnych DC (pDC) w ciągu pierwszych 48 godzin, co wskazuje na stymulację DC dojrzewanie (ryc. 2J). Leczenie sprzyjało także wzbogaceniu limfocytów T CD8þ w węzłach chłonnych, ze znacznym wzrostem populacji limfocytów T CD69þCD8þ (ryc. 2K i L), co wskazuje na aktywację limfocytów T w wyniku leczenia. Aby określić aktywację limfocytów T, zebraliśmy komórki w drenujących węzłach chłonnych 3, 5 lub 7 dni po leczeniu MVP i przeprowadziliśmy analizy ELISpot po prowokacji komórek peptydem antygenowym OVA257e264 (informacje uzupełniające ryc. S2). Leczenie MVP spowodowało duży skok w liczbie komórek wydzielających IFN-g w tym czasie, ze szczytową aktywnością w dniu 5 (ryc. 2M). Wyniki te wykazały silną stymulację DC, prezentację antygenu i aktywację komórek T po leczeniu MVP.

Tabela 1 Skład nanocząstek kapsułkowanych mRNA kodującym eGFP.

Tabela 2Skład lipidów i stosunek ładunku MVPcząsteczki.

3.3. MVP wywołuje silną odporność przeciwnowotworową w mysich modelach nowotworu jelita grubego i czerniaka

MVP zastosowano w leczeniu myszy chorych na raka okrężnicy MC38 i czerniaka B16. W obu modelach leczenie mRNA OVA kapsułkowanym MVP dwukrotnie całkowicie blokowało podskórny wzrost guza; dla porównania, leczenie MVP zamkniętym w mRNA eGFP lub samym nośnikiem nie miało żadnego wykrywalnego działania hamującego na wzrost guza (ryc. 3AeD, informacje uzupełniające ryc. S3). Zgodnie ze wzorem przesunięcia CD4 do CD8 w węzłach chłonnych (ryc. 2), zaobserwowaliśmy wzrost stosunku limfocytów T CD8þ/CD4þ w nowotworach myszy leczonych MVP zamkniętym w mRNA OVA (ryc. 3E). Ponadto wykryliśmy podwyższony poziom limfocytów T IFN-gþCD8þ w śledzionach, węzłach chłonnych i nowotworach u myszy leczonych MVP zamkniętym w mRNA OVA, ale nie samym nośnikiem lub MVP zamkniętym w mRNA GFP (ryc. 3FeH, informacje uzupełniające Rys. S4). Ponadto zaobserwowano znaczny wzrost liczby limfocytów T CD8þ-dodatnich OVA257e264-MHCI-dodatnich do dekstrameru w nowotworach z grupy leczonej MVP zamkniętym w mRNA OVA, co wskazuje na proliferację limfocytów T CD8þ specyficznych dla antygenu (ryc. 3I). Test ELISpot z komórkami wyizolowanymi ze śledziony i węzłów chłonnych zapewnił dalsze wsparcie w aktywacji limfocytów T (ryc. 3JeM).

3.4. MVP stymuluje wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez aktywację sygnalizacji zależnej od STING

Zastosowaliśmy rdzeń mRNA, nośnik wolny od mRNA i MVP kapsułkowany mRNA do leczenia BMDC w celu zidentyfikowania kluczowych czynników i szlaków odpowiedzialnych za stymulację IFN typu I i ekspresję cytokin zapalnych. Co ciekawe, MVP był tak samo silny jak agonista Tlr7 imikwimod w wyzwalaniu wydzielania IFN-b, a samo podłoże również wykazywało aktywność we wspomaganiu wydzielania IFN-b, chociaż jego siła nie była tak wysoka jak MVP; jednakże sam rdzeń mRNA był nieskuteczny w stymulowaniu wydzielania IFN-b (ryc. 4A). Wynik sugerował, że do maksymalizacji ekspresji IFN-b potrzebne były zarówno mRNA, jak i składniki nośnika. W międzyczasie imikwimod i nośnik wykazały podobną aktywność w promowaniu ekspresji TNF-a i IL-1b, podczas gdy MVP był znacznie silniejszy niż którykolwiek z nich (ryc. 4B i C). Ekspresja CCL5, cytokiny powszechnie związanej z czynnikami regulacyjnymi NF-kB i IFN, była w równym stopniu stymulowana w komórkach traktowanych imikwimodem, samym nośnikiem lub MVP (ryc. 4D). TLR7, MAVS, STING i TRIF to kluczowe czynniki w głównych szlakach przekazywania sygnału, które pośredniczą w odpowiedziach komórkowych na wirusowy RNA i uszkodzone DNA28e30. Wygenerowaliśmy BMDC od myszy z nokautem genów Tlr7, Mavs, Sting lub Trif (KO) i potraktowaliśmy komórki rdzeniem mRNA, nośnikiem wolnym od mRNA lub MVP zamkniętym w mRNA w celu zbadania ekspresji IFN-b i TNF-a.

Rycina 2. Stymulacja odpowiedzi immunologicznych przez MVP. (A) Schematyczny widok rdzenia mRNA/protaminy, nośnika wolnego od mRNA i kompletnego MVP. (BeD) Dojrzewanie BMDC po traktowaniu OVA-MVP przez 24 godziny. (E i F) Ekspresja MHC I i kompleks epitop antygenu OVA257e264-MHC I w BMDC po traktowaniu OVA-MVP przez 24 godziny. (G) Poziom IL-2 z traktowanych BMDC inkubowanych wspólnie z komórkami T B3Z lub OT-I. (H i I) Analiza cytometrii przepływowej proliferacyjnych komórek T. Pokazano reprezentatywne chromatogramy komórek T. (J) Dojrzewanie DC po traktowaniu MVP in vivo. Myszy C57BL/6J traktowano OVA-MVP i analizowano DC w podkolanowych węzłach chłonnych. (K i L) Analiza populacji komórek T. Myszy C57BL/6J traktowano nośnikiem lub OVA-MVP, a komórki T w podkolanowych węzłach chłonnych analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. (M) Test ELISpot. Myszy C57BL/6J traktowano OVA-MVP i we wskazanych punktach czasowych pobierano węzły chłonne. Wyizolowane komórki zastosowano do pomiaru komórek wykazujących ekspresję IFN-g. Dane przedstawiono jako średnią SEM (n Z 3). *P <0.05; **P <0.01; ***P < 0,005; ***P < 0,001; ns, nieistotne.

Rycina 3 Działanie przeciwnowotworowe MVP. (A) Hamowanie wzrostu guza MC38-OVA. Samice myszy C57BL/6J zaszczepiono podskórnie 5  105 MC38-komórkami nowotworowymi OVA/mysz w dniu 0 i potraktowano kontrolą PBS, kontrolą nośnika, GFP-MVP lub OVA-MVP w dniu Dzień 3 i 10. (B) Hamowanie wzrostu guza B16-OVA. Samice myszy C57BL/6J zaszczepiono podskórnie 2  105 B16-komórkami nowotworowymi OVA/mysz w dniu 0 i potraktowano kontrolą PBS, kontrolą nośnika, GFP-MVP lub OVA-MVP w dniach 3 i 10. (C i D) Obraz i masa guzów B16-OVA w dniu 17. (E) Populacja komórek T w nowotworach myszy po leczeniu. (FeH) Limfocyty T IFN-gþCD8þ w śledzionach, węzłach chłonnych (LN) i nowotworach myszy po leczeniu. (I) Komórki T CD8+ specyficzne dla OVA w nowotworach myszy po leczeniu. (JeM) Obrazy i analiza ilościowa testu ELISpot komórek śledziony i LN od myszy po leczeniu. Dane przedstawiono jako średnią SEM (n Z 5). *P <0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ***P < 0,001.

Status KO Mavs i Sting w BMDC potwierdzono analizą Western blot (informacje uzupełniające ryc. S5A). Co zaskakujące, Sting KO wymazał aktywność stymulującą wydzielanie IFN-b zarówno z samego nośnika, jak i MVP (ryc. 4E), wskazując, że MVP aktywował ekspresję IFN typu I poprzez STING. Na poparcie tej tezy wykryliśmy fosforylację kinazy wiążącej zbiornik 1 (TBK1) (ryc. S5B), kinazy powszechnie kojarzonej z aktywnością STING31. Ponadto szlak ten był niezależny od sygnalizacji TLR7, ponieważ ekspresja IFN-b nie była zaburzona w komórkach traktowanych imikwimodem (ryc. 4E). Dla porównania, Trif lub Mavs KO miały minimalny wpływ na ekspresję IFN-b promowaną przez MVP. Zgodnie z oczekiwaniami imikwimod był nieskuteczny w stymulowaniu wydzielania IFN-b w BMDC pochodzących z Tlr7 KO; jednakże Tlr7 KO miał negatywny wpływ na efekt stymulujący MVP (ryc. 4E). Co ciekawe, zaobserwowano inny profil wydzielania TNF-a podczas tych samych terapii. Nokaut Stinga, Trifa lub Tlr7 nie miał żadnego lub minimalny wpływ na ekspresję cytokin stymulowaną przez MVP. Z drugiej strony, nokaut Mavs radykalnie obniżył poziomy TNF-α w komórkach traktowanych samym nośnikiem lub MVP (ryc. 4F). Wynik wskazuje, że MAVS jest kluczowym regulatorem ekspresji TNF-a w DC po leczeniu MVP.

3.5. MVP stymuluje szlaki STING i MAVS w celu promowania wydzielania IFN-I i cytokin zapalnych

Aby zidentyfikować komponenty pojazdu odpowiedzialne za stymulację sygnalizacji STING i MAVS, przygotowaliśmy pojazdy i MVP poprzez wymianę lub pominięcie kluczowych komponentów i zastosowaliśmy je do leczenia BMDC. Cykliczny agonista Stinga GMP-AMP (cGAMP) służył jako kontrola pozytywna w stymulowaniu wydzielania IFN-b. Zastąpienie lipidu kationowego EDOPC w nośniku innym dodatnio naładowanym lipidem, DOTAP, całkowicie wyeliminowało wydzielanie IFN-b. Dla porównania, efekt stymulujący nośnika i MVP został zachowany z protaminą lub bez niej, a taka aktywność stymulująca zależała od nienaruszonego genu Sting (ryc. 4G). Co ciekawe, BMDC traktowane indywidualnymi składnikami otoczki lipidowej, w tym EDOPC, nie promowały silnego wydzielania IFN-b (informacje uzupełniające ryc. S6). Zatem EDOPC było niezbędne do aktywacji STING, a jego aktywność zależy od tworzenia nanocząstki lipidowej (tj. nośnika lub MVP). Nośnik i MVP przygotowane z EDOPC lub DOTAP zastosowano również do leczenia BMDCS pochodzącego od myszy typu dzikiego i Mavs KO i określono poziomy TNF w pożywce do wzrostu komórek. Zgodnie z oczekiwaniami zastąpienie EDOPC przez DOTAP lub DOPC wyeliminowało wysiłek stymulujący ze strony pojazdu i MVP. Ponadto poziom TNF-a był znacząco obniżony w komórkach Mavs KO w porównaniu z komórkami typu dzikiego, ale nie zmniejszył się (ryc. 4H), co wskazuje, że w pośredniczeniu w ekspresji TNF-a stymulowanej przez MVP mogą być zaangażowane dodatkowe czynniki.

3.6. Szlak STING jest niezbędny dla przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem MVP

Zarówno myszy typu dzikiego, jak i myszy z nokautem traktowano MVP zamkniętym w mRNA OVA i badano dojrzewanie DC i proliferację komórek T. Sting KO znacząco zmniejszył odsetek komórek CD80þ i CD86þ DC oraz komórek T CD69þ (ryc. 5AeD). Test ELISpot ujawnił znacząco zmniejszoną liczbę komórek wytwarzających IFN-g w śledzionach i węzłach chłonnych myszy Sting KO w porównaniu z myszami typu dzikiego po leczeniu tą samą dawką MVP (ryc. 5EeH). Wpływ preparatu Mavs KO był minimalny, ponieważ nie monitorowano żadnych różnic w komórkach T pamięci CD44–CD8þ, limfocytach T CD8–dodatnich pod względem dekstrameru OVA257e264-MHCI ani w liczbie komórek wytwarzających IFN-g w węzłach chłonnych w porównaniu z dzikimi myszy typu (ryc. 5IeL). Wynik wzmacnia pogląd, że w stymulowanej przez MVP ekspresji cytokin zapalnych mogą brać udział dodatkowe czynniki poza MAVS. Zarówno myszy typu dzikiego, jak i myszy Sting KO zastosowano do zaszczepienia guzów B16-OVA, a myszom podano kontrolę PBS lub MVP zamknięty w mRNA OVA. Analiza metodą cytometrii przepływowej próbek węzłów chłonnych i nowotworów pobranych od zaszczepionych myszy ujawniła znacznie zmniejszoną liczbę komórek T CD8γ wytwarzających IFN-g u myszy Sting KO (ryc. 6A i B). W rezultacie wzrost guza był całkowicie zahamowany u myszy typu dzikiego leczonych MVP, w porównaniu z jedynie częściowym zahamowaniem u myszy Sting KO (Fig. 6C).

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Dyskusja

W obecnym badaniu systematycznie badaliśmy funkcjonalną rolę poszczególnych składników MVP w stymulacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Nasze badanie na komórkach wyraźnie wykazało, że zarówno cząsteczki mRNA, jak i nośnik wolny od RNA w MVP są potrzebne do jego pełnej aktywności w promowaniu ekspresji IFN-b i szeregu cytokin zapalnych, w tym IL-1b i TNF -a w komórkach dendrytycznych. Wykazano, że takie cytokiny odgrywają zasadniczą rolę w aktywacji komórek dendrytycznych i odporności przeciwnowotworowej za pośrednictwem szczepionki20. Nasze badanie ujawniło również, że stymulacja produkcji cytokin zależy od szeregu kluczowych szlaków przekazywania sygnału zaangażowanych we wrodzone wykrywanie układu odpornościowego, w tym szlaków, w których pośredniczy STING i MAVS. Podczas gdy STING jest niezbędny do ekspresji IFN-b, MAVS bierze udział głównie w regulacji ekspresji TNF-a (ryc. 6D). Znaczenie sygnalizacji STING na odporność przeciwnowotworową za pośrednictwem MVP wykazano ponadto przez zmniejszoną aktywność limfocytów T i w konsekwencji upośledzone hamowanie wzrostu nowotworu u myszy Sting KO. Wynik ten jest zgodny z innymi doniesieniami, że aktywacja STING determinuje odporność przeciwnowotworową za pośrednictwem cytotoksycznych limfocytów T32. MAVS jest kluczowym pośrednikiem w sygnalizacji receptora RIG-I (RLR) w odpowiedzi na infekcję wirusową. Aktywacja tego szlaku prowadzi do kaskady reakcji zapalnych33. Intrygujące jest to, że aktywność limfocytów T nie jest zagrożona u myszy Mavs KO, biorąc pod uwagę, że sygnalizacja MAVS wyraźnie odgrywa dużą rolę w regulacji ekspresji cytokin zapalnych, w tym TNF-a. Możliwą przyczyną jest to, że stymulacja takich cytokin przez MVP odbywa się za pośrednictwem wielu szlaków, a zakłócenie szlaku MAVS nie zmniejsza ekspresji cytokin do wystarczająco niskiego poziomu, aby spowodować znaczący wpływ. Alternatywnie, utrata sygnalizacji MAVS jest kompensowana przez inne ścieżki. Konieczne są dalsze badania w celu zidentyfikowania tych ścieżek i lepszego zrozumienia mechanizmu działania szczepionki MVP. Chociaż TLR7 tradycyjnie kojarzono z lekami mRNA21, sygnalizacja TLR7 nie wydaje się odgrywać głównej roli w pośredniczeniu w aktywności MVP. Zastosowanie w pełni zmetylowanych cząsteczek mRNA w bieżącym badaniu mogło sprawić, że sygnalizacja TLR7 będzie mniej istotna. Dobrze wykazano, że metylacja RNA hamuje rozpoznawanie przez receptory TLR23. TRIF jest kluczowym białkiem adaptorowym dla sygnalizacji TLR3/7/828. Knockout of Trif również nie wpływa na aktywność MVP, co wzmacnia pogląd, że powyższe receptory TLR, w tym TLR7, nie odgrywają głównej roli w pośredniczeniu w odpowiedziach komórkowych na MVP. W opracowywaniu szczepionek przeciwnowotworowych zastosowano wielu agonistów Stinga, w tym cykliczne dinukleotydy oraz związki o małych i dużych cząsteczkach34e37. Takich agonistów Stinga należy dodać jako zewnętrzne adiuwanty podczas przygotowywania szczepionki, co dodaje kolejną warstwę złożoności do składu szczepionki. Ponadto dodany z zewnątrz agonista Stinga może powodować niepożądane skutki uboczne po oddzieleniu się od kompleksu mRNA. Dla porównania, nasz MVP służy jako samoadiuwant i działa w kontekście szczepionki przeciwnowotworowej, ponieważ żaden z poszczególnych składników szczepionki, w tym EDOPC, nie może promować ekspresji cytokin. Co ciekawe, kationowego fosfolipidu EDOPC nie można zastąpić niefosfolipidem DOTAP, który również jest naładowany dodatnio. Intrygujące jest spekulowanie na temat potencjalnego mechanizmu różnicy między tymi dwoma lipidami kationowymi. Jednakże udokumentowano, że inne właściwości składnika cząsteczki lipidu, takie jak hydrofobowość, mogą mieć głęboki wpływ na ogólną funkcję nanocząstki i skuteczność jej dostarczania kwasów nukleinowych38. Dlatego należy zachować ostrożność przy wyborze odpowiednich cząsteczek, aby przygotować w pełni funkcjonalną szczepionkę mRNA. Podsumowując, opracowaliśmy silną terapeutyczną szczepionkę przeciwnowotworową opartą na mRNA i przypisaliśmy poszczególnym składnikom szczepionki ich funkcjonalność. Jego mechanizm działania różni się znacznie od innych platform mRNA stosowanych w interwencjach profilaktycznych i terapeutycznych. Wiedza uzyskana z bieżącego badania z pewnością pokieruje przyszłym rozwojem dodatkowych terapii mRNA.

Rycina 4 Promowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przez MVP. (AeD) BMDC traktowane 1 mg/ml imikwimodu, 1 mg/ml rdzenia równoważnego mRNA, nośnikiem lub MVP przez 24 godziny. Poziomy IFN-b, TNF-a, IL-1b i CCL5 mierzono za pomocą testu ELISA. (E i F) Ekspresja IFN-b i TNF-a w BMDC pochodzących od myszy typu dzikiego i myszy z nokautem genowym (KO). BMDC traktowano wskazanymi odczynnikami przez 24 godziny. IFN-b i TNF-a mierzono za pomocą testu ELISA. (G) IFN-b w BMDC pochodzących od myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Sting. BMDC traktowano 20 mg/ml cGAMP, 1 mg/ml rdzenia równoważnego mRNA, nośnikiem lub MVP przez 24 godziny. Pojazd (DOTAP): przygotowany poprzez zastąpienie EDOPC przez DOTAP; nośnik (bez protaminy): przygotowany przez pominięcie protaminy. ND: niewykrywalny. (H) TNF-a w BMDC pochodzących od myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Mavs. BMDC traktowano rdzeniem, nośnikiem lub MVP równoważnym 1 mg/ml mRNA przez 24 godziny. Pojazd (DOTAP): przygotowany poprzez zastąpienie EDOPC przez DOTAP; pojazd (DOPC): przygotowany poprzez zastąpienie EDOPC przez DOPC. Dane przedstawiono jako średnią SEM (n Z 3). ***P <0.005; ***P < 0,001; ns, nieistotne.

Rycina 5 Przeciwnowotworowa odpowiedź immunologiczna u myszy z nokautem Sting i Mavs. (AeD) Zmniejszona aktywacja komórek DC i T u myszy z nokautem Sting. Zarówno myszy typu dzikiego, jak i myszy z nokautem Sting traktowano MVP zamkniętym w mRNA OVA, a węzły chłonne pobierano 48 godzin później w celu pomiaru komórek DC i T. (EeH) Zmniejszone komórki T wyrażające IFN-g w śledzionie i węzłach chłonnych u myszy z nokautem Sting. Pokazane są zarówno obrazy plam, jak i analizy ilościowe. (IeL) Brak wpływu na aktywność limfocytów T u myszy z nokautem Mavs. Zarówno myszom typu dzikiego, jak i myszom z nokautem Mavs podawano kontrolę PBS lub MVP zamknięty w mRNA OVA, a węzły chłonne pobrano 48 godzin później w celu pomiaru limfocytów T pamięci CD44 – CD8 – (I), OVA257e264-MHCI CD8 – dodatnich pod względem dekstrameru Limfocyty T (J) i liczba komórek wytwarzających IFN-g (K i L). Dane przedstawiono jako średnią SEM (n Z 3 lub 5). *P <0.05; **P <0.01; ***P < 0,005; ***P < 0,001; ns, nieistotne.

Rycina 6. Odporność przeciwnowotworowa zależna od użądlenia. (A i B) Analiza limfocytów T wykazujących ekspresję IFN-g w węzłach chłonnych i tkankach nowotworowych po leczeniu myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Sting z guzami B16-OVA leczonych MVP zamkniętym w mRNA OVA. Myszy leczono w dniach 3 i 10, a węzły chłonne i guzy pobrano w dniu 15. Pojedyncze komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. (C) Hamowanie wzrostu nowotworu u myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Sting. Myszom podano kontrolę PBS lub MVP w dniach 3 i 10. Dane przedstawiono jako średnią SEM (n Z 5). *P < 0,05; ***P < 0,001; ns, nieistotne. (D) Schematyczny widok stymulacji MVP szlaków przekazywania sygnału prowadzących do wytwarzania cytokin w DC. Chociaż w stymulacji ekspresji IFN-b pośredniczy wyłącznie STING, istnieje wiele czynników, w tym MAVS, które pośredniczą w ekspresji TNF-a i IL-1b.

Bibliografia

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ i in. Skuteczność szczepionki mRNA-1273 SARS-CoV-2 po zakończeniu fazy zaślepionej. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A i in. Bezpieczeństwo i skuteczność trzeciej dawki szczepionki BNT162b2 Covid-19. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Pokonywanie barier komórkowych w terapii RNA. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Systemy nanocząstek lipidowych umożliwiające terapie genowe. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP i in. Lipopolyplex wzmacnia odporność przeciwnowotworową szczepionek opartych na mRNA. Biomateriały 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P i in. Ogólnoustrojowe dostarczanie zmodyfikowanego mRNA kodującego kinazę tymidynową 1 wirusa opryszczki pospolitej do celowanej terapii genowej raka. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC i in. Ogólnoustrojowe dostarczanie RNA do komórek dendrytycznych wykorzystuje obronę przeciwwirusową w immunoterapii nowotworów. Natura 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L i in. Szczepionka mRNA naśladująca wirusa do leczenia raka. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. Szczepionki mRNA nowa era w wakcynologii. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L i in. Komórki T CAR są produkowane in vivo w celu leczenia uszkodzenia serca. Nauka 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Czy w erze szczepionek mRNA jest jakakolwiek nadzieja na funkcjonalne lekarstwo na HIV? Wirusy 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T i in. Niezapalna szczepionka mRNA do leczenia eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Nauka 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. Szczepionka mRNA do immunoterapii nowotworów. Mol Rak 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K i in. mRNA w immunoterapii nowotworów: poza źródłem antygenu. Mol Rak 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M i in. Spersonalizowane szczepionki z mutanomem RNA mobilizują wieloswoistą odporność terapeutyczną przeciwko nowotworowi. Natura 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M i in. Szczepionka RNA zwiększa odporność w przypadku czerniaka leczonego inhibitorem punktu kontrolnego. Natura 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C i in. Aktywnie spersonalizowana próba szczepienia dla nowo zdiagnozowanego glejaka wielopostaciowego. Natura 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA i in. Immunoterapia nowotworów. Szczepionka z komórek dendrytycznych zwiększa zakres i różnorodność limfocytów T specyficznych dla neoantygenu czerniaka. Nauka 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S i in. Szczepionka neoantygenowa wywołuje odpowiedź wewnątrznowotworowych komórek T w badaniu fazy Ib na glejaka wielopostaciowego. Natura 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H i in. Synergistyczna aktywacja odporności przeciwnowotworowej przez cząsteczkową szczepionkę terapeutyczną. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Wrodzone poczucie adiuwantowości szczepionki mRNA. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J i in. Szczepionki na bazie messenger RNA o podwójnym działaniu indukują zrównoważoną adaptacyjną odpowiedź immunologiczną zależną od TLR-7-i zapewniają działanie przeciwnowotworowe. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Supresja rozpoznawania RNA przez receptory Toll-podobne: wpływ modyfikacji nukleozydów i ewolucyjne pochodzenie RNA. Immunitet 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L i in. IL-1 i IL-1ra są kluczowymi regulatorami odpowiedzi zapalnej na szczepionki RNA. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M i in. Mechanizmy odporności wrodzonej i nabytej na szczepionkę PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Zastąpienie lipidów pomocniczych naładowanymi alternatywami w nanocząsteczkach lipidów ułatwia ukierunkowane dostarczanie mRNA do śledziony i płuc. J. Wersja kontrolna 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA i in. Mały interferujący RNA w leczeniu raka: pokonywanie przeszkód w dostawie. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Odpowiedź interferonowa typu I i wrodzone wykrywanie raka przez układ odpornościowy. Trendy Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Progresja mitotyczna po uszkodzeniu DNA umożliwia rozpoznawanie wzorców w mikrojądrach. Natura 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S i in. Uszkodzenie DNA pobudza układ interferonu typu I poprzez cytozolowy czujnik DNA STING, aby promować wrodzoną odporność przeciwdrobnoustrojową. Immunitet 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikaza DDX41 wykrywa wewnątrzkomórkowy DNA, w którym pośredniczy adapter STING w komórkach dendrytycznych. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH i in. Wielkość terapeutycznej aktywacji STING determinuje odporność przeciwnowotworową za pośrednictwem limfocytów T CD8. Przedstawiciel komórki 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Rozpoznawanie wzorców i mechanizmy sygnalizacyjne RIG-I i MDA5. Przedni Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E i in. Szczepionki przeciwnowotworowe zawierające agonistów STING mogą wyleczyć rozwinięte nowotwory oporne na blokadę PD-1. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE i in. Bezpośrednia aktywacja STING w mikrośrodowisku guza prowadzi do silnej i ogólnoustrojowej regresji nowotworu oraz odporności. Przedstawiciel komórki 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J i in. Dostarczanie szczepionek mRNA z lipidami heterocyklicznymi zwiększa skuteczność przeciwnowotworową poprzez aktywację komórek odpornościowych za pośrednictwem STING. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y i in. Nanoszczepionka aktywująca STING do immunoterapii nowotworów. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L., Koynova R., Parikh H., MacDonald RC. Aktywność transfekcyjna mieszanin binarnych kationowych o-podstawionych pochodnych fosfatydylocholiny: hydrofobowy rdzeń silnie moduluje właściwości fizyczne i skuteczność dostarczania DNA. Biophys J. 2006;91:3692e706.