Przeciwstarzeniowe działanie ribes Meyeri antocyjanów na nerwowe komórki macierzyste i starzejące się myszy Część 2

Prosimy o kontaktoscar.xiao@wecistanche.comwięcej informacji

Nar ratuje starzejące się fenotypy 23M-NSC

Antocyjany R. Meyera są bogate w wiele rodzajów flawonoidów i składników bioaktywnych [1,3-5]. Aby określić, który składnik antocyjanów R. Meyera odgrywa ważną rolę w przeciwdziałaniu starzeniu się, przeprowadziliśmy analizę metabolomiczną antocyjanów R. Meyera. Ujawniliśmy, że Nar może być ważnym metabolitem flawonoidów, ponieważ szlak biosyntezy flawonoidów był wysoce wzbogacony w antocyjany R. Meyera (Tabela uzupełniająca 1). Aby określić działanie przeciwstarzeniowe Nar, różne stężenia (0, 1,7, 3,4,6,8,13,6 i 27,2 μg / ml) zastosowano do 23M-NSC, a testy CCK-8 wykorzystano do zbadania żywotności komórek. Jak pokazuje dodatkowy rysunek 3, 6,8 μg/ml leczenia Nar zwiększyło żywotność komórek o 150%. Aby dokładniej zbadać przeciwstarzeniowe działanie Nar, 23M-NSC leczono Nar, a następnie wykryto wskaźniki związane ze starzeniem się.zastosowania hesperydynyW 23M-NSC leczonych 6,8 μg / ml Nar, ekspresja mRNA p16nk4a była zmniejszona (ryc. 3A). Nar wydłużył również telomery hodowanych mNSC i zwiększył syntezę DNA (ryc. 3B,3C). Aby dokładniej zbadać wpływ Nar na proliferację komórek, przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne Ki67, który jest antygenem jądrowym komórek mitotycznych, który ulega ekspresji w całym cyklu komórkowym, z wyjątkiem G0 [19,27]. Leczenie Nar zwiększyło proliferację komórek, mierzoną zwiększoną liczbą komórek Ki67-dodatnich (ryc. 3D, 3E). Następnie wykryliśmy również potencjał różnicowania NSC w neuronach. Rzeczywiście, leczenie Nar 6,8 g / ml również zwiększyło liczbę komórek MAP2-dodatnich (ryc. 3F, 3G). Wyniki te konsekwentnie pokazują, że Nar może odwrócić starzenie się 23M-NSC.

Ryc. 2. Antocyjany Ribesa Meyera poprawiają pamięć myszy i zdolności uczenia się poprzez zwiększenie liczby nerwowych komórek macierzystych (NSC). A) Znalezienie platformy zajmuje trochę czasu. B) Czas jest potrzebny, aby najpierw dotrzeć do platformy. (C) Średnia prędkość do znalezienia platformy. D) Dystans przepłynął przed znalezieniem platformy. (E. F) Leczenie R.zaginione imperium cistanchekażda antocyjanina zwiększała liczbę i rozmiar neurosfery w porównaniu z grupą kontrolną. (G) Neurosfery o wielkości 50-100 um zostały zwiększone w wyniku leczenia antocyjanami R. Meyera u myszy. Dane przedstawiono jako średnią ±SD trzech niezależnych eksperymentów. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Ryc. 3. Wpływ naringeniny (Nar) na starzenie się mysich nerwowych komórek macierzystych (MNC). (A) Ekspresję mRNA p16k4a mierzono za pomocą qRT-PCR w 23M-NSC z i bez leczenia 6,8 ug/ ml Nar przez 48 h. (B) Rozkład fazy cyklu komórkowego 23M-NSC leczonych Nar przez 48 h i komórek kontrolnych. (C) Względna długość telomerów 23M-NSC znacznie wzrosła wraz z leczeniem Nar, (D)Immunofluorescencyjność Ki67 barwienie mięśni leczonych Nar przez 48 godzin, z oznakowaniem jądrowym DAPI, (E) Kwantyfikacja (D), (F) Reprezentatywne pola MAP2 i barwienie GFAPimmunofluorescencyjne hodowanych mNSC po kontroli i obróbce Nar. G) Kwantyfikacja (F). Dane są prezentowane jako średnia± SD trzech niezależnych eksperymentów. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Nar poprawia pamięć i funkcje poznawcze u starzejących się myszy

Poziomy poznawcze zmniejszają się wraz ze starzeniem się, a leczenie przeciwstarzeniowe może poprawić poziom poznawczy [11, 28]. Aby zweryfikować działanie przeciwstarzeniowe Nar in Vivo, wstrzyknęliśmy 20 mg / kg Nar starzejącym się myszom C57BL / 6 (12 miesięcy) przez żyłę ogonową. Test MWM został wykorzystany do zbadania pamięci przestrzennej i zdolności poznawczych myszy.mikronizowana oczyszczona frakcja flawonoidowa 1000 mgW ciągu 5 dni powtarzanego treningu czas potrzebny starzejącym się myszom leczonym Narem na znalezienie platformy stopniowo zmniejszał się w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 4A). Wyniki testów wykazały, że czas potrzebny na pierwsze dotarcie do platformy został skrócony (rysunek 4B), podczas gdy czas spędzony w strefie platformy został wydłużony (rysunek 4C). Ponadto myszy starzejące się leczone Narem obserwowano w strefie platformy z większą częstotliwością niż grupa kontrolna (ryc. 4D). Łącznie wyniki te sugerują, że Nar może poprawić pamięć przestrzenną i zdolności poznawcze u starzejących się myszy.

Analiza sekwencjonowania RNA krwi poddanej narowi od starzejących się myszy

Aby zbadać specyficzne dla Nar mechanizmy przeciwstarzeniowe, przeanalizowaliśmy profil ekspresji genów krwi leczonej Narem od starzejących się myszy za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-seq). Wyniki ujawniły 1 961 genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG). Ogólnie rzecz biorąc, Nar obniżył ekspresję genów, a tylko niewielka liczba genów była regulowana w górę w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną (ryc. 5A, 5B). Dodatkowo, ważne geny szlaku sygnałowego związane ze starzeniem się zostały obniżone, szczególnie te w szlaku sygnałowym TNF (ryc. 5C).oteflawonoidWyniki te sugerują, że Nar wpływa na szlak sygnałowy TNF, tym samym głęboko wpływając na funkcję TNF-a, która bierze udział w zaburzeniach poznawczych związanych ze starzeniem się [29,30]. Dlatego zbadaliśmy poziomy TNF-α w osoczu myszy. Wyniki testów immunoenzymatycznych d (ELISA) związanych z enzymem

Ryc. 4. Naringenin (Nar) poprawia pamięć i zdolności uczenia się u starzejących się myszy. A) Opóźnienie ucieczki u starzejących się myszy leczonych Narem było krótsze w porównaniu z grupą kontrolną. (B) Czas potrzebny do pierwszego dotarcia na platformę był krótszy u starzejących się myszy leczonych Narem niż w grupie kontrolnej. (C) Czas przebywania w strefie platformy. (D) Częstotliwość obserwacji w strefie platformy u starzejących się myszy leczonych Narem w porównaniu z grupą kontrolną. Dane przedstawiono jako średnią ±SD trzech niezależnych eksperymentów.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.“n”="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu się

DYSKUSJA

Starzenie się wiąże się ze zwiększonym ryzykiem pogorszenia funkcji poznawczych, a także utratą zdolności uczenia się i zapamiętywania [22,23]. Utrata neuronów i upośledzona neurogeneza są ściśle związane z dysfunkcją mózgu związaną z wiekiem [11-13]. Tak więc zwiększenie liczby neuronów i poprawa neurogenezy są kluczowe dla leczenia przeciwstarzeniowego. R. Meyer, roślina bogata w flawonoidy i inne substancje bioaktywne [1, 3-6], ma wiele funkcji, które nie zostały jeszcze opisane. W niniejszym badaniu antocyjany R. Meyera promowały proliferację NSC i zwiększały tworzenie neurosfer o jednolitej morfologii. Leczenie antocyjanami R. Meyera poprawiło również fenotyp starzenia się komórek, ze zmniejszonym poziomem ROS i związaną ze starzeniem się ekspresją genu P16nk4, zwiększoną fazą syntezy DNA i wydłużonymi telomerami.purytanie witamina cCo więcej, wyniki barwienia immunofluorescencyjnego ujawniły, że antocyjany R Meyer stymulowały tworzenie neuronów. Wyniki te sugerują, że antocyjany R. Meyera mają działanie przeciwstarzeniowe na mNSC, a także mogą bezpośrednio promować tworzenie neuronów in vitro. Co więcej, spadek funkcji poznawczych jest ściśle związany ze starzeniem się [22, 23]. Nasze wyniki MWM wykazały, że dożołądkowe podawanie antocyjanów R. Meyera poprawiło pamięć przestrzenną i zdolności uczenia się u starzejących się myszy, a także zwiększyło

Ryc. 5. Czynnik martwicy nowotworów (TNF)-a odgrywa istotną rolę w działaniu przeciwstarzeniowym za pośrednictwem naryngeniny (Nar). (A) Podsumowanie ekspresji genów we krwi myszy, określone przez sekwencję RNA. B) Mapa cieplna pokazująca geny o zróżnicowanej ekspresji (DEG) we krwi między myszami kontrolnymi i leczonymi Narem. DEG zidentyfikowano przez zmianę fałdu >2.0 lub<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Zastosowanie analizy metabolomicznej do zbadania specyficznego składu antocyjanów R. Meyer ujawniło, że Nar może być ważnym metabolitem flawonoidów. Wcześniej informowano, że Nar łagodzi starzenie się komórek mięśnia sercowego [31], poprawia zdolność metaboliczną przewodu pokarmowego [32] i wywiera działanie przeciwzapalne [33] i przeciwnowotworowe [34]. Jednak wpływ Nar na NSC podczas starzenia się pozostaje nieznany. Aby zbadać działanie przeciwstarzeniowe antocyjanów R. Meyera, przeprowadziliśmy dalsze badania przy użyciu Nar. Leczenie 6,8 ug/ml Nar zwiększyło żywotność komórek, zmniejszyło ekspresję genu P16ink4a, wydłużyło telomery i promowało różnicowanie NSC w neuronach in vitro. Aby dokładniej ocenić wpływ Nar na proliferację komórek, przeprowadziliśmy badania immunofluorescencyjne. Wyniki wskazują, że leczenie Nar zwiększyło zarówno liczbę komórek Ki67-dodatnich, jak i odsetek komórek MAP2-dodatnich, co sugeruje, że Nar może promować neurogenezę. Ponadto wpływ Nar na uczenie się i pamięć oceniano również u starzejących się myszy. Wyniki testu MWM konsekwentnie wykazały, że leczenie Nar poprawia przestrzenne rozwiercanie u starzejących się myszy. Co ciekawe, analiza sekwencji RNA ujawniła, że Nar może wpływać na starzenie się poprzez szlak sygnałowy TNF, szczególnie poprzez zmniejszenie ekspresji TNF-a we krwi starzejących się myszy. Testy ELISA wykazały również, że leczenie Narem zmniejszyło poziom TNF-a w osoczu w porównaniu z kontrolnymi myszami starzejącymi się. TNF-a jest kluczowym czynnikiem w szlaku sygnałowym TNF i jest ściśle związany ze starzeniem się poznawczym. Jego funkcje obejmują promowanie zmian patologicznych w synapsach hipokampa [29] i hamowanie proliferacji komórek prekursorowych [35]. Zmienione poziomy TNF są związane z zaburzeniami poznawczymi w depresji, schizofrenii, chorobie afektywnej dwubiegunowej i chorobie Alzheimera [30,36,37]. Dokładniej, TNF-a jest regulowany w górę u pacjentów z chorobą Alzheimera [38].

Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że antocyjany R. Meyera poprawiają efekty starzenia się nSC za pośrednictwem Nar, który obniża poziom TNF-a in vivo i poprawia funkcje poznawcze u starzejących się myszy. Łącznie nasze odkrycia stanowią nowatorską strategię rozwoju terapii klinicznych, mającą na celu większą realizację wartości leczniczej antocyjanów R.Meyera.

MATERIAŁY I METODY

Zwierzęta doświadczalne

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Tongji i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Antocyjany R. Meyera podawano wewnątrzgastrowo przez 2 miesiące do 12-miesięcznych myszy utrzymywanych na tle C57BL / 6. Nar został wstrzyknięty do żyły ogonowej dla myszy w wieku od 1 miesiąca do 12 miesięcy utrzymywanych na tle C57BL / 6. Myszom kontrolnym podano taką samą objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

Przygotowanie antocyjanów R. Meyera i Nar

Owoc R. Meyera (500 g) został homogenizowany za pomocą homogenizatora tkankowego i zawieszony w 1 l metanolu zawierającym 0,1% kwasu hvdrochlorowego. Ekstrakcję ultradźwiękową przeprowadzono trzy razy przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ekstrakty połączono, a metanol zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem w celu uzyskania ekstraktów Z R Meyera. Ekstrakt został dodatkowo oczyszczony makroporowatą żywicą AB-8 w celu zwiększenia zawartości antocyjanów.

Naringenin(C15H1205; MW:272,25; czystość: ≥98%; HPLC) został zakupiony od Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Syczuan, Chiny) i przechowywany w temperaturze 2 ° C-8 ° C w suchym środowisku bez światła. Stężenie roztworu podstawowego wynosiło 100 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO). Końcowe stężenie DMSO nie przekraczało 0,1% w pożywce hodowlanej.

Testy neurosfery i różnicowania

NSC pochodzą z mysiego SVZ. Myszy złożono w ofierze po znieczuleniu, a SVZ starannie rozcięto i zdysocjowano na pojedyncze komórki z papainą 0,4 j./ml (Imogen, Alexandria, VA, USA; Nr katalogowy: LS003126). NSC powlekano w naczyniach 10 cm zawierających 10 ml NSC Basal Medium z 10 ng / ml EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, USA; Nr kat.: AF-100-15) i 10 ng/ml FGF (PeproTech, Cranbury, NJ, USA; Nr katalogowy: AF-100-18B). Neurosfery były przekazywane co 5 dni. NSC ze świeżo zdysocjowanych neurosfer pasażu-2 zostały zasiane na lamininie (Gibco, Gaithersburg, MD, USA; Nr kat.:23017015)i bromowodorek poli-L-ornityny (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone; Nr katalogowy: Szkiełka powlekane P3655 w NSCBasalMedium bez suplementów różnicujących. Zróżnicowane komórki były immunobarwione na Tu1 (beta-tubulina II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; Nr kat.: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, nr kat.: MA5-12826) i glejowe włókniste kwaśne białko (GFAP; Thermo Fisher Scientific, nr kat. PA5-16291), a następnie przeciwbarwione 4'6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI; Thermo Fisher Scientific, nr kat.: D1306). Szkiełka badano za pomocą mikroskopu Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, USA). Kwantyfikację komórek TuJ1- i MAP2-dodatnich przeprowadzono poprzez zliczanie oznakowanych komórek z trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t.

Ten artykuł pochodzi z www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, No. 17