Zastosowania aptamerów w neurologii, część 2

Inny neuroprzekaźnik, serotonina, odgrywa rolę w działaniach neuromodulacyjnych wpływających na sen, agresję, apetyt i aktywność seksualną. Jest wytwarzany w różnych częściach ciała, takich jak mózg, rdzeń kręgowy, płytki krwi i jelita [81–84].

Serotonina jest neuroprzekaźnikiem odgrywającym ważną rolę w zdrowiu fizycznym i psychicznym człowieka. W organizmie człowieka serotonina reguluje nastrój, kontroluje apetyt i sen, a także sprzyja odczuwaniu przyjemności fizycznej i dobrego samopoczucia. Jednak serotonina odgrywa również ważną rolę w wpływaniu na pamięć.

Badania wykazały, że serotonina może sprzyjać poprawie pamięci poprzez regulację sygnalizacji między neuronami. Kiedy ludzie są pozytywnie pobudzeni, organizm uwalnia serotoninę, która pomaga wzmocnić połączenia między neuronami i poprawia wydajność pamięci. Serotonina może również zwiększyć kreatywność ludzi, poprawić sprawność umysłową i pomóc ludziom szybciej się uczyć i myśleć.

Ponadto serotonina może pomóc zmniejszyć objawy lęku i depresji, problemy nastroju, które mogą negatywnie wpływać na koncentrację i pamięć. Szczęśliwy nastrój i stan psychiczny często mogą sprzyjać rozpoznawaniu nowych rzeczy i zdolności uczenia się.

Podsumowując, serotonina odgrywa niezastąpioną rolę w procesie uczenia się oraz zapamiętywania w zakresie zdrowia fizycznego i psychicznego. Możemy zwiększyć uwalnianie serotoniny i [poprawić pamięć] poprzez zmianę naszych nawyków żywieniowych, ilości ćwiczeń, metod uczenia się itp., kultywując pozytywną i zdrową mentalność oraz stale rzucając sobie wyzwanie, aby stale promować poprawę pamięci. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche desericola może znacząco poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwstarzeniowe, co może pomóc zmniejszyć utlenianie i reakcje zapalne w mózgu, chroniąc w ten sposób zdrowie układu nerwowego. Ponadto Cistanche Deserticola może również promować wzrost i naprawę komórek nerwowych, poprawiając w ten sposób łączność i funkcjonowanie sieci neuronowych. Efekty te mogą pomóc poprawić pamięć, uczenie się i szybkość myślenia, a także mogą zapobiegać rozwojowi dysfunkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.

Kliknij Poznaj suplementy, aby zwiększyć pamięć

Brak równowagi w poziomach obwodowej serotoniny powiązano z kilkoma stanami chorobowymi, w tym nadciśnieniem, chorobami nerek i depresją. Zatem wykorzystanie serotoniny do przewidywania stanu chorobowego i rozpoczęcia odpowiedniego leczenia ma znaczenie kliniczne.

Opracowano test plazmoniczny na obecność serotoniny z koniugatem aptameru – AuNP, którego agregacja zmienia się w obecności serotoniny. Zmianę agregacji cząstek można zmierzyć jako przesunięcie szczytowej długości fali absorpcji.

Test wykazał specyficzną odpowiedź na serotoninę i nie dał statystycznie istotnego sygnału w przypadku jej metabolitów, kwasu 5-hydroksyindolooctowego (5-HIAA), epinefryny lub noradrenaliny, gdy każdy z nich był testowany w stężeniu 1 µM.

Płodowe bydlęce, naśladujące ludzką surowicę, również nie inicjowało żadnego sygnału [85]. Niedawno opracowano wszczepialne neurosondy z tranzystorem polowym (FET) do monitorowania poziomu serotoniny w tkance mózgowej. Ultracienkie powierzchnie In2O3 nanoskalowych tranzystorów FET zmodyfikowano aptamerami, a te neurosondy umożliwiły wykrywanie progów serotoniny fM in vivo przy minimalnym zanieczyszczeniu biologicznym [86).

Dzięki dodatkowym sondom neuroprzestrzennym możliwe będzie czasoprzestrzenne rejestrowanie aktywności neuronalnej, co umożliwi zrozumienie funkcji mózgu na znacznie głębszym poziomie. Epinefryna jest neuroprzekaźnikiem katecholaminowym o szerokim zakresie funkcji fizjologicznych, którego nieprawidłowy poziom może powodować problemy zdrowotne, takie jak arytmia, zawał mięśnia sercowego, zaburzenia krwi wzrost ciśnienia i obrzęk płuc.

Aby móc obserwować powiązane stany chorobowe, ważne jest oznaczenie ilościowe krążącej epinefryny. W tym celu opracowano kolorymetryczną metodę detekcji, opartą na oddziaływaniu epinefryny z Au-NP funkcjonalizowanym aptamerem. System jest tańszy i bardziej specyficzny niż inne techniki oznaczania ilościowego epinefryny, takie jak chromatografia cieczowa i spektrofotometria.

Za pomocą spektroskopii w zakresie widzialnym UV określono także granicę wykrywalności wynoszącą 0,9 nM, co stanowi najniższą granicę wykrywalności zarejestrowaną dla epinefryny jakąkolwiek metodą kolorymetryczną. Analogi epinefryny, kwasu 3,4-dihydroksyfenylooctowego (DOPAC), tryptofanu, kwasu askorbinowego, dopaminy, tyrozyny i kwasu homowanilinowego wykazywały bardzo małą odpowiedź lub nie wykazały jej wcale, co wskazuje na wysoką specyficzność aptasensora [87].

Zmiana poziomu pojedynczego neuroprzekaźnika może wskazywać na dowolną z kilku chorób, co sprawia, że ​​postawienie diagnozy choroby na podstawie pomiaru pojedynczego neuroprzekaźnika jest bardzo mało prawdopodobne. Dlatego też możliwość integracji większości aptasensorów z platformą multipleksową doprowadzi do powstania narzędzi diagnostycznych lepiej dostosowanych do potrzeb klinik i mogących wspierać dokładniejszą identyfikację chorób.

2.3. Wykrywanie biomarkerów
Biomarker to dowolna substancja, struktura lub proces w organizmie, który albo skutkuje wynikiem, albo wskazuje na obecność określonej choroby. Wiele biomarkerów to substancje, które można oznaczyć w płynach biologicznych, takich jak krew, ślina i mocz.

Głównym problemem charakteryzacji biomarkerów chorób neurologicznych jest bariera krew-mózg (BBB), przez którą nie może przejść wiele cząsteczek, w tym wiele białek. Chociaż białka są dominującymi biomarkerami niektórych chorób, małe peptydy, takie jak neuropeptyd Y lub fragmenty białek, z większym prawdopodobieństwem przechodzą przez BBB i są wykrywane w krążeniu.

Metabolity to kolejna ważna grupa biomarkerów zaburzeń neurologicznych. Firma NeoVentures Biotechnology Inc. opracowała metodę selekcji aptamerów zwaną FRELEX, która umożliwia selekcję aptamerów w oparciu o konkurencję pomiędzy krótkim oligonukleotydem przyłączonym do powierzchni a celem. Podobnie jak w przypadku SELEX-u komórkowego i innych form SELEX-u ze zmianą struktury, protokół ten można wykonać z próbką zawierającą mieszaninę składników bez wcześniejszej wiedzy na temat celu(ów), do którego zostaną wybrane aptamery.

W przypadku tych form SELEX przeprowadza się selekcję przeciwstawną z określonymi podzbiorami składników, aby sterować selekcją aptamerów spełniających pożądaną specyficzność. Stosując FRELEX, aptamery selekcjonowano względem surowicy od myszy transgenicznych, które nadekspresjonowały ludzkie białko tau.

Aby poprowadzić selekcję aptameru w stronę ludzkiego tau i konsekwencje nadekspresji tau, w przeciwselekcji zastosowano surowicę od myszy typu dzikiego. Grupa zidentyfikowała wzbogacone sekwencje aptamerów przy użyciu NGS i scharakteryzowała niektóre aptamery u myszy transgenicznych w późnym stadium i myszy typu dzikiego, porównując ich względną liczebność.

Postawili hipotezę, że różnica w liczebności odzwierciedla odpowiednie stężenie epitopów (zwiększone w odpowiedzi na nadekspresję tau), z którymi aptamery mogą oddziaływać [29].

3. Zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne

Choroby neurodegeneracyjne (ND) obejmują zwyrodnienie neuronów w mózgu, co powoduje utratę struktur i funkcji ośrodkowego układu nerwowego. ND może być spowodowane starzeniem się, czynnikami genetycznymi i środowiskowymi.

Demencja jest jedną z najczęstszych chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem, podobnie jak choroba Alzheimera (AD). Choroba Parkinsona (PD) może być spowodowana mutacjami genetycznymi i/lub toksynami środowiskowymi. Stwardnienie zanikowe boczne (ALS), stwardnienie rozsiane (MS), choroba Huntingtona (HD) i choroby prionowe to inne częste choroby ND o powiązaniach genetycznych.

Niestety, w przypadku tych chorób nie są dostępne ani skuteczne leki, ani strategie wczesnego wykrywania. Podobnie jak powszechnie stosowane przeciwciała, aptamery stały się atrakcyjnymi czynnikami do zastosowania w opracowywaniu nowych biosensorów do wczesnej diagnostyki ND i leczenia tych chorób [88].

3.1. Choroba Alzheimera

Jako postępujące zaburzenie mózgu związane z wiekiem, prowadzące do upośledzenia umysłowego, AD jest najczęstszą postacią demencji. Jego patologię charakteryzuje agregacja amyloidu (A) pochodzącego z białka prekursorowego amyloidu (APP) i inicjowana w obszarze mózgu hipokampa.

Chociaż naukowcy postawili hipotezę, że neurotoksyczność wywołana A jest skorelowana z nierozpuszczalnymi płytkami A (AP) i włókienkami (AF), najnowsze dowody wskazują, że rozpuszczalne oligomery A (AO) są również powiązane z początkiem AD.
Dlatego AO uznano za atrakcyjny biomarker do wczesnej diagnostyki AD, a A i tau uważa się za istotne cele terapeutyczne w leczeniu AD [89].

3.1.1. Diagnostyka AD

Wcześnie opisane aptamery przeciwko AO miały niskie powinowactwa i specyficzność, ale późniejsze badania wykazały większą skuteczność w identyfikacji aptamerów, które selektywnie rozpoznawały fibryle 40-resztowej postaci polimerów A (A 40), ale nie A 40 [90].

Jednakże aptamery nie charakteryzowały się wysoką specyficznością w stosunku do włókienek A40 w porównaniu do włókienek kilku innych testowanych białek amyloidogennych. Wykazano również, że aptamer DNA wybrany do interakcji z oligomerem -synukleiny (-syn) z powinowactwem 68-nM wiąże AO z powinowactwem 25-nM [91]. W 2019 roku, wykorzystując te same aptamery, które uzyskali Tsukakoshi i wsp., opracowano pozbawiony znaczników elektrochemiczny aptasensor do bardziej specyficznego rozpoznawania AO [92].

Aptamer samoorganizuje się na elektrodach ze złotego pręta poprzez oddziaływanie tiolu (-S), a system ma granicę wykrywalności wynoszącą 30 ppm, określoną za pomocą EIS. Był to pierwszy aptasensor, który z powodzeniem zastosowano do monitorowania agregacji białka A w oparciu o EIS, co było możliwe dzięki wysokiej selektywności aptameru wśród gatunków A. Dzięki łatwemu wytwarzaniu i skutecznej regeneracji ten aptasensor może być obiecującym narzędziem diagnostycznym do wczesnego wykrywania AD i wykazywania akumulacji białka A [92].

Opracowano aptasensor do wykrywania oligomerów A, wykorzystując aptamer DNA -syn [91] w kompleksie z błękitem metylenowym (MB) i przymocowany do nanoporowatej anodykaluminy. Wysoki współczynnik absorpcji MB dla światła białego spowodował małą intensywność odbitego światła białego.

W obecności oligomerów A kompleks aptamer/MB ulegał dysocjacji, a wzrost światła odbitego wykrywano za pomocą interferometrycznej spektroskopii odbicia (IRS) [93]. Aptasensor miał granicę wykrywalności wynoszącą 8 pM i dobrą odpowiedź na oligomery A w zakresie stężeń od 0,5 do 50 nM. Splątki neurofibrylarne (NFT) są patologicznymi cechami charakterystycznymi AD.

Tworzenie się NFT rozpoczyna się w hipokampie, a stopień powstawania NFT jest powiązany z ciężkością otępienia w AD. Hiperfosforylacja białka związanego z mikrotubulami, tau, zwiększa jego zdolność do rekrutacji i organizowania normalnego tau w włókna, które stają się NFT. Dlatego też sugeruje się, że hiperfosforylacja tau jest jedną z głównych przyczyn AD.

Oprócz swojej normalnej roli w promowaniu składania mikrotubul i stabilizowaniu złożonych mikrotubul, zaobserwowano, że tau za pomocą nierównowagowej elektroforezy kapilarnej (CE) wiąże trzy losowo wybrane oligonukleotydy ssDNA, z których jeden, ssDNA1, wiąże się z tau381 z wysokim powinowactwem (Kd {{ 3}} nM) [94].

Opracowano test kanapkowy aptamer/przeciwciało, wykorzystując ssDNA1 do wykrywania femtomolowych stężeń białka tau w ludzkim osoczu metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) [95].

W innym badaniu aptamery DNA wybrano względem całego białka tau składającego się z 441 aminokwasów (tau441) za pomocą techniki szybkiej selekcji opartej na podziale w elektroforezie kapilarnej z trzema rundami selekcji zakończonymi w ciągu jednego dnia. Pięć aptamerów wybranych na podstawie wyników sekwencjonowania o dużej przepustowości zostało ocenionych przez SPR pod kątem ich zdolności rozpoznawania tau.

Potencjał analityczny aptameru o większym powinowactwie wykazano za pomocą testu anizotropii fluorescencji w fazie jednorodnej. Ten aptamer o wysokim powinowactwie wiązał w tym teście białko tau441 i krótsze izoformy, tau352, tau381 i tau383 z granicami wykrywalności odpowiednio 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM i 22 nM [96].

3.1.2. Terapia AD

Jako jedną z potencjalnych terapii wybrano aptamery RNA hamujące agregację A40. Podczas selekcji oligomer A sprzęgano z nanocząsteczkami złota (A-AuNP) i po SELEX zidentyfikowano dwa aptamery jako kandydatów na aptamery.

Dzieci 10–20 nM. Aptamery te hamowały tworzenie się płytek A i włókienek, co wykazano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej i testu immunoenzymatycznego A40 (ELISA) [97].

Peptyd wabikowy (DP), dehydrogenazy alkoholowej (ABAD), który oddziałuje z A, antagonizuje cytotoksyczność peptydu A. Sekwencję ABAD-DP wstawiono pomiędzy dwa tiole tworzące wiązanie dwusiarczkowe w tioredoksynie (TRX), aby utworzyć aptamer peptydowy TRX1-ABAD-DP-TRX2. Jego stabilną ekspresję w komórkach NIH 3T3 przy użyciu wirusów towarzyszących adenopotwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Wyrażony aptamer może wiązać peptyd A i poprawiać żywotność komórek. Badanie to potwierdziło skuteczne hamowanie efektu cytotoksycznego peptydu A przez aptamery peptydowe [98]. Białka Tau zwykle łączą się z mikrotubulami i je stabilizują, ale ich hiperfosforylacja może skutkować powstaniem agregatów białkowych zwanych „tauopatią”, które są toksyczne.

Aptamer DNA Tau-1, który został wybrany przeciwko ludzkiemu tau441, hamuje oligomeryzację Tau1 in vitro [99]. Hamowanie to potwierdzono także w badaniach na hodowlach komórkowych z użyciem komórek HEK293 [100]. Beta-sekretaza (BACE1) odgrywa rolę w wytwarzaniu A, a hamowanie ekspresji BACE1 jest śmiertelne u myszy. Leczenie AD może obejmować modulację BACE1.

Jednak jego duże miejsce aktywne sprawia, że ​​BACE1 stanowi trudny cel dla inhibitorów małocząsteczkowych. Aby obejść ten problem, aptamery kwasów nukleinowych mogą okazać się nowymi narzędziami hamującymi aktywność BACE1. Enzym ten ma ogon cytoplazmatyczny, B1-CT, służący jako miejsce dokowania dla białek, takich jak białko opiekuńcze miedzi dla dysmutazy ponadtlenkowej-1 (CCS) i białko wiążące czynnik rybozylacji ADP (GGA1).

Fizjologiczna rola B1-CT jest w dużej mierze nieznana. Aptamer RNA ukierunkowany na B1-CT związany z bliższą od błony połową C-końca BACE1 zapobiegł rekrutacji CCS, umożliwiając jednocześnie GGA1 wiązanie się z BACE1 i regulując transport BACE1 do endosomów recyklingowych [101].

Aby specyficznie celować w BACE1, wygenerowano aptamery DNA, BI1 i BI2, przeciwko BACE1, który hamował BACE1, ale ani alfa, ani gamma-sekretazę. Stosując stabilnie transfekowaną linię komórkową HEK293, dokonali ekspresji prekursora białka amyloidowego (APP) i stosując test fluorescencyjnego rezonansowego transferu energii in vitro (FRET) wykazali, że poziom A został obniżony, a niedobór komórkowy został uzupełniony w pierwotnie hodowanej linii komórek neuronalnych [102]. Skuteczność aptameru została dodatkowo poprawiona poprzez dodanie glikolu cholesterylotetraetylenowego (TEG).

3.2. Choroba Parkinsona

Choroba Parkinsona (PD) jest drugą najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną, na którą cierpi około siedmiu milionów ludzi na całym świecie. Choć jest chorobą postępującą, charakteryzującą się cechami motorycznymi i niemotorycznymi, ma ona znaczący wpływ kliniczny na pacjentów ze względu na utratę przez nich mobilności i kontroli mięśni.

ChP charakteryzuje utrata neuronów dopaminergicznych w prążkowiu oraz utrata neuronów w obszarach niedopaminergicznych. Utrata neuronów jest na ogół związana z charakterystycznym powstawaniem ciał Lewy'ego. Zatem obecność ciał Lewy'ego zawierających oligomery -syn w mózgu uważa się za możliwy cel terapeutyczny i diagnostyczny PD.

3.2.1. Diagnostyka PZ

Pierwszy aptamer, „M5-15”, wybrany względem -syn, nie miał specyficzności wobec oligomerów i mógł także wiązać się z monomerami -syn [103]. Wykazano, że wybrane następnie aptamery DNA oddziałują z oligomerami -syn, a nie z monomerami -syn, ale wiążą oligomery A1-40.

Badacze zbadali także specyficzność aptameru wobec oligomerów -syn w porównaniu z innymi białkami o strukturach składających się głównie z arkusza, np. struktura śmigła z arkusza dehydrogenazy pirolochinolinochininowo-glukozowej (PQQH) i wykazali, że aptamer nie wiąże się z PQQH [91].Odmiana Doniesiono, że aptasensory są zdolne do ilościowego oznaczania -synoligomerów.

Aptasensor kolorymetryczny, wykorzystujący aptamer DNA przeciwko -synoligomerowi, został zaadsorbowany na nanocząsteczkach złota (AuNP), co zapobiegło indukowanej solą agregacji nanocząstek. Jego wiązanie z oligomerem -syn zapobiega absorpcji aptameru na powierzchni AuNP, co umożliwia wywołanie agregacji AuNP przy wysokich stężeniach soli i skutkuje zmianą koloru.

Donoszono o tym systemie z LoD wynoszącym 10 nM. Jednakże surowica (nawet 2%) przyczyniła się do absorpcji związków w zakresie zmiany koloru w teście i zakłóciła zależną od soli agregację aptameru-Au-NP.

Aptasensory wykorzystujące EIS i SPR były bardziej czułe, z LoD odpowiednio 1 pM i 8 pM [104]. Stwierdzono, że aptasensor EIS jest wysoce swoisty dla oligomerów w stosunku do monomerów i nie ma na niego wpływu obecność surowicy [104]. Skomplikowany projekt elektrochemicznego aptasensora do wykrywania oligomeru -syn obejmował hybrydę utworzoną przez sekwencję komplementarną z aptamerem oligomeru -syn połączoną z powierzchnią złota poprzez wiązanie tiolowe i zawierającą terminalną transferazę deoksynukleotydową (TdT) i dTTP w celu przedłużenia 30 końców aptameru i jego uzupełnić dodatkowym polipem.

Rozszerzony ssDNA wiązał błękit metylenowy i sprzyjał jego asocjacji z powierzchnią złota, tworząc w ten sposób sygnał elektrochemiczny. Dodatkowo system zawierał egzonukleazę I (Exo I), która jest specyficzna dla ssDNA. Kiedy aptamer został usunięty z kompleksu binarnego wraz z jego uzupełnieniem poprzez związanie się z oligomerem -syn, nici komplementarne zostały strawione przez Exo I, zapobiegając gromadzeniu się błękitu metylenowego na powierzchni złota i w ten sposób zmniejszając sygnał elektrochemiczny.

Granica wykrywalności wynosiła 10 µM (S/N=3), a odzysk sygnału w obecności 10% i niższych stężeń surowicy był bardzo akceptowalny 95,3–107% [105]. Jednakże jego złożoność i włączenie enzymów sprawiają, że układ ten jest mniej stabilny podczas przechowywania i odtwarzalny w terenie. Połączenie elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas (CE-MS) z ekstrakcją do fazy stałej (SPE) w celu wstępnego zatężenia celu z mikrowkładem modyfikowanym aptamerem w dużej objętości wstrzykniętych próbek obniżył granicę wykrywalności 100--krotnie w porównaniu z systemami CE-MS.

W tym nowatorskim systemie próbka jest oczyszczana, a objętość minimalizowana w celu usprawnienia analizy poprzez zastosowanie mikrowkładu, który selektywnie zatrzymuje cel. Stwierdzono, że sorbent powinowactwa aptameru (AA) we wkładzie jest lepszą alternatywą dla przeciwciała sorbent na bazie immunopowinowactwa (IA), jako że elektrolity tła wymagane do płukania układu powodują również denaturację przeciwciał.

Opracowanie AA-SPE-CE-MS osiągnięto poprzez modyfikację mikrowkładu aptamerem DNA M5-15. System wykazał LoD wynoszący 2,8 nM i miał liniowy zakres detekcji pomiędzy 7 a 140 nM -syn w próbce krwi.

Również identyfikacja wolnych i N-acetylowanych proteoform -syn była możliwa dzięki bardzo dokładnemu wykrywaniu masy i zdolności rozdzielczej MS. Wreszcie stwierdzono, że mikrowkład jest stabilny nawet w przypadku kwaśnego BGE i można go zastosować w około 20 analizach z niskim prawdopodobieństwem błędnej ilościowej oceny celu [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com