Kwas arystolochowy indukuje zwłóknienie nerek i starzenie się u myszy

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakcyjny:Nerki są jednym z najbardziej podatnych narządów na zaburzenia związane z wiekiem. Generalnie starzeniu nerek towarzyszy zwłóknienie nerek, które jest ostatnią powszechną ścieżką przewlekłegochoroby nerek. Kwas arystolochowy (AA), środek nefrotoksyczny, powoduje nefropatię AA (AAN), która charakteryzuje się postępującym zwłóknieniem nerek i pogorszeniem czynności. Chociaż zwłóknienie nerek jest związane ze starzeniem się nerek, to czy AA indukuje starzenie się nerek pozostaje niejasne. Celem niniejszej pracy jest zbadanie potencjalnego wykorzystania AAN jako modelu starzenia się nerek. Tutaj zbadaliśmy czynniki związane ze starzeniem się w modelach AAN poprzez przewlekłe podawanie AA myszom C57BL/6. W porównaniu z grupą kontrolną, grupa AA wykazała starzenienerkafenotypy, takie jak zanik nerek, pogorszenie czynności nerek i zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe. Ponadto AA promował starzenie się komórek, szczególnie wnerkioraz zwiększona ekspresja nerkowego mRNA p16 i aktywność galaktozydazy związanej ze starzeniem się. Ponadto myszy traktowane AA wykazywały nieprawidłowości mitochondrialne w proksymalnych kanalikach, a także akumulację reaktywnych form tlenu. Klotho, gen przeciwdziałający starzeniu, również uległ znacznemu zmniejszeniu wnerkimyszy leczonych AA. Podsumowując, wyniki niniejszego badania wskazują, że AA zmienia czynniki związane ze starzeniem się, a zwłóknienie nerek jest ściśle związane ze starzeniem się nerek.

Słowa kluczowe:przewlekłą chorobę nerek; zwłóknienie nerek; kwas arystolochowy; starzenie się; starzenie komórkowe

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

WstępWraz ze stale wydłużającą się długością życia ludzi coraz więcej osób cierpi na upośledzenia związane z wiekiem.Nerkisą zazwyczaj dotknięte związanym z wiekiem uszkodzeniem tkanki i występowaniem przewlekłychchoroba nerekwzrasta wraz z wiekiem [1]. Starzenie się nerek przyspiesza ogólne starzenie się, co skutkuje krótszą żywotnością. Dlatego konieczne są badania nad starzeniem się nerek, chociaż odpowiednie modele zwierzęce nie zostały w pełni opracowane. Starzeniu nerek towarzyszą różne zmiany patologiczne, w tym zanik nerek, stwardnienie kłębuszków nerkowych i zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe [2]. Zwłóknienie kanalików śródmiąższowych nerki jest ostatnią powszechną drogą w większości postaci postępującej choroby nerek, co sugeruje, że zwłóknienie nerki jest ściśle związane z wiekiem.nerka. W badaniach nad starzeniem się myszy są niezawodnym narzędziem ze względu na bliskość genetyczną człowieka, zdolność do genetycznej manipulacji genomem oraz fakt, że w ciągu życia prezentują podobne fenotypy związane ze starzeniem się ludziom [3]. Obserwacje wzdłużne z użyciem myszy wsobnych są idealnym modelem starzenia się, chociaż obserwowanie myszy przez cały okres ich życia jest czasochłonne. Dodatkowo istnieje kilka genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli starzenia. Mysz z niedoborem Klotho jest modelem przedwczesnego starzenia się, który jest wykorzystywany w badaniach nad starzeniem się. Jednak w tym modelu czynność nerek jest nienaruszona, a kilka narządów innych niż nerki jest upośledzonych [4]. Zatem ten model mysi może być nieodpowiedni do badań nad starzeniem się nerek.Podanie kwasu arystolochowego (AA) powoduje specyficzny rodzaj uszkodzenia nerek zwany nefropatią AA (AAN), który charakteryzuje się rozległym zwłóknieniem śródmiąższowym [5,6]. AA jest toksyczny dla nabłonka kanalików nerkowych, ponieważ sprzyja tworzeniu adduktów DNA w tkankach nerek [7]. Jest mało prawdopodobne, aby AA wpływały na narządy inne niż układ moczowy i mogą być przydatne do oceny:nerka-specyficzne zmiany. Dlatego AA jest powszechnie stosowany do tworzenia modeli zwłóknienia nerek u myszy [8,9]. Jednak pozostaje niejasne, czy zmiany wywołane AA są związane ze starzeniem sięnerki. W tym badaniu zbadaliśmy związane z wiekiem fenotypy i czynniki molekularne w AAN u myszy

Wyniki 2.1. Podawanie AA wywołało znaczną utratę masy ciała, zanik nerek i pogorszenie czynności nerekWyjściowa masa ciała (BW) i skurczowe ciśnienie krwi (BP) były identyczne w grupach kontrolnych z podłożem i AA. Masa ciała w grupie kontrolnej nośnika stale wzrastała przez 8 tygodni. Jednak przyrost masy ciała został zahamowany przez podanie AA, a grupa AA miała znacząco niższą masę ciała w 4 i 8 tygodniu po rozpoczęciu podawania AA (Figura 1A). Nie było istotnej różnicy w skurczowym BP lub częstości akcji serca między grupą kontrolną i AA (ryc. 1B, C). Stosunek masy serca do masy ciała nie wykazał różnicy między grupami po 8 tygodniach od rozpoczęcia podawania AA (ryc. 1D), podczas gdynerkastosunek masy ciała do masy ciała był znacząco niższy w grupie AA po 8 tygodniach od rozpoczęcia podawania AA (Figura 1E). Następnie zbadaliśmy czynność nerek w grupach kontrolnych nośnika i AA. Stężenia kreatyniny i azotu mocznikowego w osoczu (UN) były znacząco wyższe w grupie AA niż w grupie kontrolnej nośnika po 8 tygodniach od rozpoczęcia podawania AA. Dodatkowo, leczenie AA znacząco zmniejszyło klirens kreatyniny w porównaniu z grupą kontrolną nośnika po 8 tygodniach od rozpoczęcia podawania AA (ryc. 1F-H).

2.2. Podawanie AA wywołało jawne zwłóknienie kanalików śródmiąższowych i znaczne zwiększenie ekspresji genów w nerkach związanych z włóknieniemBadanie histologiczne przy użyciu barwienia kwasem nadjodowym-Schiffa (PAS) wykazało, że obszar kłębuszków był znacząco zmniejszony w grupie AA w porównaniu z grupą kontrolną nośnika (Figura 2A). W grupie AA zaobserwowano rozległe zwłóknienie kanalików śródmiąższowych, oceniane za pomocą barwienia trichromem Massona (MT) (ryc. 2B), a także podwyższenie poziomu mRNA genów związanych z zwłóknieniem nerek, kolagenu I i III oraz transformującego czynnika wzrostu ( TGF)- (rysunek 2C-E).

2.3. Podanie AA przyspieszone starzenie się komórek, dysfunkcja mitochondriów i akumulacja reaktywnych gatunków tlenu/genów (ROS) w nerkachAby ocenić starzenie się komórek, zbadaliśmy ekspresję mRNA p53, p21, p16 i glutaminazy (GLS) w nerkach. Grupa AA wykazała znacząco wyższe poziomy mRNA tych genów związanych ze starzeniem się wnerki(Rysunek 3A-D). Ponadto, intensywność barwienia -galaktozydazą związaną ze starzeniem (SA- -gal) wnerkibył podwyższony w grupie AA i prawie nieobecny w grupie kontrolnej nośnika (ryc. 3E). W grupie AA mikroskopia elektronowa wykazała zniknięcie grzebienia mitochondrialnego, fragmentację mitochondriów, wakuolizację cytoplazmatyczną i autolizosomy w komórkach kanalika proksymalnego, wraz z regulacja w dół BCL2/adenowirusa E1B 19-kDa oddziałującego białka 3 (Bnip3), genu związanego z mitochondriami (Figura 3FG). Nerkowa ekspresja mRNA Nox2. składnik oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) był znacząco zwiększony w grupie AA w porównaniu z grupą kontrolną nośnika (Figura 3H). Ponadto analiza Western blot wykazała, że ​​nerkowy poziom 4-hydroksy-2-nominalny(4-HNE) był znacząco podwyższony w grupie AA (Rysunek 3I). Wyniki te wskazują, że podawanie AA indukowało starzenie się komórek, dysfunkcję mitochondriów i akumulację ROS wnerki.

2.4. AA Zmniejszona ekspresja białka Klotho w nerkachZbadaliśmy ekspresję białek przeciwstarzeniowych w nerkach w grupach kontrolnych nośnika i AA. Ekspresja Klotho była znacząco zmniejszona w grupie AA w porównaniu z grupą kontrolną nośnika (Figura 4A), podczas gdy ekspresja nerkowa fosforybozylotransferazy nikotynamidu (NAMPT) i sirtuiny 1 (SIRT1) była podobna między grupami (Figura 4B, C).

3. DyskusjaWedług naszej wiedzy niniejsze badanie jest pierwszym, które koncentruje się na ocenie zmian związanych ze starzeniem się nerek w AAN za pomocą markerów starzenia, takich jak aktywność p16 i SA- -gal. Leczenie AA sprzyjało atrofii nerek, włóknieniu kanalikowo-śródmiąższowemu i pogorszeniu czynności nerek, czemu towarzyszyła regulacja w górę nerkowego p16 mRNA i barwienie SA- -gal. Ponadto grupa AA wykazała cechy mechanizmów związanych ze starzeniem się nerek, takich jak anomalie mitochondrialne, zwiększony stres oksydacyjny i obniżenie poziomu genu przeciwdziałającego starzeniu się Klotho. Podsumowując, nasze obserwacje sugerują, że przewlekłe podawanie AA częściowo naśladuje starzenie się nerek.

Starzenie się komórek to trwałe zatrzymanie proliferacji komórek w odpowiedzi na różne stresory, takie jak uszkodzenie DNA, i przyczynia się do starzenia się i chorób związanych z wiekiem. Ekspresja p16, inhibitora kinazy zależnej od cyklin, jest skorelowana ze starzeniem się różnych narządów, w tym nerek. Ograniczenie kaloryczne zwiększa długość życia poprzez hamowanie ekspresji p16 [10]. Dodatkowo, eliminacja starzejących się komórek z ekspresją p16- u myszy INK-ATTAC poprzez wstrzyknięcie AP20187, dimeryzatora białka wiążącego FK506- [11], powoduje osłabienie fenotypów starzenia nerek, takich jak stwardnienie kłębuszków nerkowych i funkcjonalny spadek. Dlatego p16 jest jednym z najważniejszych czynników związanych ze starzeniem się. Starzejące się komórki można wykryć za pomocą barwienia SA- -gal, które wykazuje zwiększoną aktywność -galaktozydazy przy pH 6,0 [12] i jest szeroko stosowanym biomarkerem starzejących się i starszych komórek. Nerkowa ekspresja mRNA p16 wzrasta u starszych szczurównerkitowarzyszy temu zwiększona aktywność SA- -gal w nabłonku nerki [13I. W niniejszym badaniu wykazaliśmy zwiększoną ekspresję mRNA p16 w nerkach i barwienie SA- -gal, co wskazuje, że AA indukuje starzenie się nerek. Ostatnio doniesiono, że GLS ma zasadnicze znaczenie dla przeżycia starzejących się komórek poprzez zwiększoną glutaminolizę i wewnątrzkomórkową neutralizację pH [14]. Wykazano, że hamowanie zależnej od GLS glutaminolizy u starszych myszy eliminuje starzejące się komórki i łagodzi dysfunkcję narządów związaną z wiekiem. W niniejszym badaniu podwyższenie poziomu mRNA nerkowego GLS wskazywało na akumulację starzejących się komórek w grupie w nerkach. Tak więc przewlekłe podawanie AA powodowało starzenie się komórek w nerkach.

CISTANCHE POPRAWI FUNKCJĘ NEREK/NEREK

Oprócz starzenia się komórek, dysfunkcja mitochondriów jest istotnym mechanizmem leżącym u podstaw uszkodzeń tkanek związanych z wiekiem i towarzyszy jej akumulacja ROS [15,16. Dysfunkcja mitochondriów napędza i utrzymuje starzenie się komórek [17], podczas gdy starzenie się komórek bezpośrednio przyczynia się do dysfunkcji mitochondriów [18]. Bnip3, zlokalizowany głównie w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, może odgrywać rolę w regulacji mitofagii w hodowanych komórkach kanalika proksymalnego nerki w odpowiedzi na stres oksydacyjny i niedotlenienie. U starszych myszy ograniczenie kalorii zwiększa autofagię w komórkach kanalikowych, poprzez regulację w górę Bnip3 i poprawia wywołaną wiekiem degenerację funkcji nerek [19]. W niniejszym badaniu mikroskopia elektronowa ujawniła cechy nieprawidłowości mitochondrialnych, na które może wpływać zmniejszona ekspresja Bnip3 w nerkach lub starzenie się komórek. Mitochondria są głównym wewnątrzkomórkowym źródłem ROS. Aby ocenić wpływ nieprawidłowości mitochondrialnych na ROS w nerkach, zbadaliśmy akumulację 4-HINE w nerkach i wykazaliśmy akumulację ROS indukowaną przez AA wnerki.Oksydazy NADPH są głównym źródłem ROS. W ostrej fazie AAN u myszy nerkowa ekspresja mRNA Nox2 była podwyższona, a dostępność tlenku azotu obniżona, co prowadziło do utrzymywania się hipoksji i niedokrwienia [20. W wieku szczuranerki, akumulacji ROS towarzyszy zwiększona ekspresja Nox2 [21]. Odkrycia te sugerują, że AA może indukować fenotypy związane z wiekiem poprzez akumulację ROS wywołaną dysfunkcją mitochondriów i regulacją w górę oksydaz NADPH.

Ekspresja genu Renal Klotho była obniżona w grupie AA, podczas gdy ekspresja NAMPT i SIRT1 była podobna między grupami. Klotho to gen przeciwstarzeniowy, który koduje jednoprzejściowe białko transbłonowe, które działa jako supresor starzenia. Proces starzenia u myszy z niedoborem Klotho przypominał ten u ludzi, w tym krótsza długość życia, bezpłodność, miażdżyca, zanik skóry, osteoporoza i rozedma płuc [22]. Hipomorficzne zmutowane myszy Klotho wykazywały również fenotyp przyspieszonego starzenia, który został przywrócony przez ablację p16 [23]. Ponieważ Klotho jest ważnym czynnikiem starzenia, myszy zmodyfikowane genem Klotho są szeroko stosowane w badaniach nad starzeniem się. Jednak myszy ze zmodyfikowanym genem Klotho mogą być nieodpowiednie do badań nad starzeniem się nerek ze względu na ogólnoustrojowe zaburzenia związane ze starzeniem się tych myszy oraz fakt, że funkcja nerek nie jest poświadczona (tj. poziom kreatyniny). Natomiast mysi model AAN może być wykorzystany jako wywołany lekiem model starzenia się nerek do celów badawczych, ponieważ ma kilka zalet, takich jak względna łatwość wdrożenia i możliwość oszacowania wpływu interwencji na pogorszenie czynności nerek .

Niniejsze badanie miało pewne ograniczenia. Oceniliśmy starzenie się nerek, skupiając się głównie na starzeniu się komórek, morfologii mitochondriów i ekspresji genów związanych ze starzeniem. Jednak mechanizmy starzenia są złożone i pozostają słabo poznane. Dodatkowo, chociaż ekspresja genu Klotho była obniżona w odpowiedzi na AA, nie mogliśmy wykazać związku przyczynowego z patologicznymi zmianami w AAN. Potrzebne są dalsze badania, aby określić role różnych cząsteczek zaangażowanych w rozwój AAN. Niemniej jednak niniejsze badanie dostarcza nowych informacji na temat wykorzystania Avan jako modelu starzenia się nerek. Należy zauważyć, że zmiany fenotypowe wnerkasą silnie związane z długością życia. Chociażnerkajest podatny na zmiany związane ze starzeniem się, zahamowanie starzenia się nerek może wydłużyć ogólną długość życia. Dlatego dalsze badania nad starzeniem się nerek z wykorzystaniem modeli AAN mogą prowadzić do wydłużenia życia w przyszłości.

4. Materiały i metody4.1. ZwierzątBadanie to zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Yokohama City (numer zatwierdzenia: FA20-027) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Podjęto wysiłki, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie. Myszy trzymano w kontrolowanym środowisku w cyklu 12-h światło/12-h ciemność w temperaturze 25 stopni C. Myszy miały swobodny dostęp do pożywienia i wody.

CISTANCHE POPRAWI INFEKCJE NEREK/NEREK

Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6 zakupiono z Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) i przydzielono do grup kontrolnych z nośnikiem lub AA po 1 tygodniu aklimatyzacji, myszom podawano dootrzewnowo nośnik lub AA (Sigma -Aldrich, St.Louis, MO, USA), który rozpuszczono w niewielkiej ilości dimetylosulfotlenku. Przed obecnym badaniem przeprowadziliśmy wstępne badanie z wykorzystaniem kilku protokołów. Pierwszy protokół obejmował podawanie AA (3 mg/kg) myszom C57BL/6 dootrzewnowo dwa razy w tygodniu przez 4 tygodnie bez czasu przebudowy; w tym protokole AA powodowało jawne ostre uszkodzenia nerek, takie jak poszerzenie kanalików proksymalnych z utratą rąbka szczoteczkowego (rysunek uzupełniający S1). W drugim protokole myszom C57BL/6 podawano dootrzewnowo AA (2,5 mg/kg) raz w tygodniu przez 4 tygodnie, po czym następował czas przebudowy przez 4 tygodnie; kreatynina w osoczu u tych myszy wynosiła 0.19 ± {{20}}.080 mg/dl w porównaniu z 0,18 ± 0,010 mg/dl (odpowiednio kontrola nośnika w porównaniu z AA; średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), p=0.86, niesparowany test t-Studenta, n=4 na grupę) i UN w osoczu wynosiło 31,3 ± 5,95 mg/dl w porównaniu z 30,4 ± 3,87 mg/dl (odpowiednio kontrola nośnika versus AA; średnia ± SEM, p=0,90, niesparowany test t-Studenta, n=4 na grupę). Dlatego też ustaliliśmy, że ten protokół nie był odpowiedni dla modelu uszkodzenia nerek, ponieważ AA nie wywoływał znaczącego pogorszenia czynności nerek. W trzecim protokole myszom C57BL/6 podawano dootrzewnowo AA (3 mg/kg) dwa razy w tygodniu przez 10 tygodni bez czasu przebudowy; u tych myszy śmiertelność w grupie AA wynosiła 83 procent (n=6), podczas gdy żadna z myszy w grupie kontrolnej z nośnikiem nie zmarła (n=4). W tym protokole nie mogliśmy statystycznie ocenić fenotypu nerek indukowanego przez AA ze względu na wysoką śmiertelność. W czwartym protokole myszom C57BL/6 podawano dootrzewnowo AA (3 mg/kg) dwa razy w tygodniu przez 4 tygodnie, po czym następował czas przebudowy przez 4 tygodnie; U myszy tych obserwowano przewlekłe zmiany w nerkach, takie jak zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe, oraz pogorszenie czynności nerek [9]. Dlatego w oparciu o wyniki tych wstępnych badań przyjęliśmy czwarty protokół do przeprowadzenia eksperymentów w niniejszym badaniu.

4.2. Pomiar ciśnienia krwiSkurczowe BP i tętno mierzono wcześniej opisaną metodą z mankietem na ogon (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokio, Japonia) [24,25]. Wszystkie pomiary wykonano między 9:00 a 14:00. U każdej myszy wykonano co najmniej 10 pomiarów, a do analizy wykorzystano wartość średnią.

4.3. Analiza ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym Całkowity RNA wyekstrahowano z tkanek nerek przy użyciu ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japonia), a komplementarny DNA (cDNA) zsyntetyzowano przy użyciu systemu SuperScript IⅢFirst-Strand (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Analizę ilościową PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu systemu wykrywania CFX96 Touch Real-Time PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), a produkty odwrotnej transkrypcji inkubowano z TaqMan PCR Master Mix i niestandardowym TaqMan sondę (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), jak opisano wcześniej [26]. Zastosowano sondy TaqMan wobec następujących genów: kolagen I(Mm00801666_g1), kolagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm{24}}m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) i Nox2 (Mm00627011_m1). Poziomy mRNA znormalizowano do poziomów 18S rybosomalny RNA.

4.4. Analiza Western Blot Ekspresję białka analizowano za pomocą analizy Western blot homogenatów tkankowych, stosując wcześniej opisaną metodę [27,28]. Całkowite ekstrakty białkowe przygotowano z tkanek przy użyciu buforu do próbek zawierającego dodecylosiarczan sodu. Stężenie białka w każdej próbce mierzono przy użyciu zestawu do oznaczania białek zgodnych z detergentem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) i NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), z albuminą surowicy bydlęcej jako standard. Równe ilości ekstraktów białkowych z próbek tkanek frakcjonowano na 5-20 procentowych żelach poliakrylamidowych (ATTO Corp., Tokio, Japonia). Oddzielone białka przeniesiono następnie na membrany z difluorku winylidenu przy użyciu Semi-Dry Transfer System (ATTO Corp., Tokio, Japonia). Błony zablokowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 5% odtłuszczonego mleka w proszku. Błony inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, USA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japonia) i dehydrogenaza fosforanowa-3-gliceraldehydu (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Błony płukano i inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami przez 60 min w temperaturze pokojowej. Miejsca reakcji przeciwciało-antygen wizualizowano stosując wzmocniony substrat chemiluminescencji (Merck, Kenilworth, NJ, USA). GAPDH zastosowano jako kontrolę ładowania. Obrazy analizowano ilościowo przy użyciu ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

4.5. Analiza histologiczna została wykonana jak opisano wcześniej [29]. Tkanki nerkowe myszy utrwalono 4% paraformaldehydem, a następnie zatopiono w parafinie. Skrawki (grubość 4 µm) wybarwiono barwnikami PAS i MT. Aby ocenić obszar kłębuszków, zmierzono i uśredniono 50 kłębuszków na mysz. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japonia).

CISTANCHE POPRAWI DIALIZACJĘ NEREK/NEREK

4.6. SA- -al Barwienie Tkanki nerkowe myszy szybko zamrożono i osadzono w mieszaninie do optymalnej temperatury cięcia （Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokio, Japonia）. Odcinki o grubości 4 μm przygotowano przy użyciu kriostatu (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) i osadzony na szkiełkach. Aktywność SA- -gal mierzono stosując zestaw do wykrywania starzenia (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) zgodnie z protokołami producenta. Próbki oglądano w jasnym polu przy powiększeniu ×100 przy użyciu mikroskopu BZ-9000 (Keyence Corp. 4.7. Mikroskopia elektronowaAnalizę pod mikroskopem elektronowym przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [30]. Myszy znieczulono izofluranem i perfundowano przez prawy łuk aorty heparynizowanym (5 U/ml) roztworem soli fizjologicznej i 2,5% aldehydem glutarowym w 0,1 mol/l buforze fosforanowym o pH 7,4. Próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej zanurzono w 1% tetratlenku osmu na 2 godziny, seryjnie odwadniano w etanolu i zatapiano w mieszaninie Epon. Skrawki UlItrathin wybarwiono octanem uranylu i cytrynianem ołowiu i zbadano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego Hitachi H-7500 działającego przy 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokio, Japonia). Przekroje były obserwowane przy powiększeniu × 5000 i sfotografowane za pomocą aparatu ze sprzężeniem ładunkowym.

4.8.Analiza biochemicznaPróbki krwi pobrano przez nakłucie serca po posiłku. Próbki pełnej krwi wirowano przy 3000 obr/min (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japonia) przez 10 min w 4 stopniach w celu oddzielenia osocza. Otrzymane próbki osocza przechowywano w -80 stopniu. Poziomy kreatyniny w osoczu, ONZ i kreatyniny w moczu mierzono za pomocą autoanalizatora Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokio, Japonia).

4.9. Analiza statystyczna Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Niesparowany test f Studenta zastosowano do porównania różnic między grupą kontrolną pojazdu i grupą AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">

5. WnioskiPrzyczyny administracji AAnerkastarzenie się, wraz z włóknieniem kanalikowo-śródmiąższowym i atrofią nerek. Wyniki sugerują, że zwłóknienie nerek jest ściśle związane ze starzeniem się nerek i że AAN może być przydatny jakonerkaspecyficzny model starzenia.