Beta-glukan wzmocnił odpowiedź immunologiczną na szczepionkę przeciwko rzekomemu pomorowi drobiu i zmienił ekspresję MRNA w śledzionie u kurcząt

ABSTRAKCYJNY

Niniejsze badanie przeprowadzono w celu zbadania wpływu doustnego podawania b-glukanu (G70), produktu otrzymywanego ze ściany komórkowej drożdży, na miana hamowania hemaglutynacji (HI) specyficznego dla wirusa rzekomego pomoru drobiu (NDV), proliferację limfocytów i Rola subpopulacji limfocytów T u kurcząt leczonych żywą szczepionką NDV. Ponadto badano wpływ b-glukanu na ekspresję genów śledziony poprzez sekwencjonowanie transkryptomu. Wyniki wykazały, że suplementacja b-glukanem zwiększyła miano NDV HI w surowicy, zwiększyła wskaźnik stymulacji NDV limfocytów we krwi obwodowej i przewodzie pokarmowym oraz sprzyjała różnicowaniu limfocytów T do limfocytów T CD4+. Analiza sekwencjonowania RNA (RNA-seq) wykazała, że ​​G70 zwiększył ekspresję mRNA związaną z receptorem sprzężonym z białkiem G i polipeptydem MHC klasy I oraz obniżył ekspresję mRNA związaną z katelicydyną i betadefenzyną. Immunomodulujące działanie G70 może działać poprzez szlak sygnalizacyjny kinazy białkowej aktywowanej mitogenami. Podsumowując, G70 może zwiększyć skuteczność immunologiczną żywej szczepionki NDV u kurcząt i może być stosowany jako potencjalny kandydat na adiuwant w przemyśle drobiarskim.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Słowa kluczowe: szczepionka przeciwko rzekomemu pomorowi drobiu, beta-glukan, adiuwant, kurczak o czarnej kości, sekwencja RNA

WSTĘP

Polisacharydy ściany komórkowej drożdży powstają bezpośrednio ze ściany komórkowej Saccharomyces cerevisiae i są szeroko stosowane jako stymulatory wzrostu, środki przeciwdrobnoustrojowe lub immunomodulatory u drobiu w celu poprawy produkcji i zdrowia (Schiavone i in., 2017; Hasted i in., 2021). Wcześniej wykazano, że produkt o nazwie PW220, który zawiera polisacharydy ściany komórkowej drożdży, wzmacnia odpowiedź immunologiczną wywoływaną przez wirusa rzekomego pomoru drobiu (NDV) i zmienia społeczność drobnoustrojów w jelicie ślepym kurcząt po podaniu doustnym (Bi i in., 2020). ). Polisacharydy ściany komórkowej drożdży składają się głównie z b-glukanu i mannanooligosacharydów (Wang i in., 2018). W niniejszym badaniu badano wpływ b-glukanu na odpowiedź immunologiczną na szczepionkę NDV u kurcząt. Śledziona jest kluczowym narządem inicjującym odpowiedź immunologiczną. Niedawne badania wykazały, że PW220, będący produktem ściany komórkowej drożdży, zwiększa ekspresję mRNA TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 i T-bet w śledzionie kurcząt ( Bi i in., 2022). Należy jednak wyjaśnić konkretny mechanizm. Sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) to jedna z technologii o dużej przepustowości, którą można zastosować do ilościowego oznaczania ekspresji genów i zapewniając analizę różnych profili ekspresji na poziomie całego transkryptomu (Zhao i in., 2018). Dzięki zaletom związanym z wysoką czułością i niskim kosztem sekwencja RNA jest szeroko stosowana w badaniach na zwierzętach gospodarskich i drobiu (Teixeira i in., 2019; Yuan i in., 2020). Zatem w tym badaniu oceniano wpływ podawania b-glukanu na miana hamowania hemaglutynacji (HI) specyficznego dla NDV, proliferację limfocytów i subpopulacje limfocytów T u kurcząt szczepionych doustnie szczepionką NDV. Ponadto analizę transkryptomu wykorzystano do oceny wpływu b-glukanu na ekspresję genów i podstawowe szlaki przekazywania sygnału w śledzionie kurcząt.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Zwierząt

Jednodniowe komercyjne kurczęta z czarną kością (samce) zakupiono od Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, Chiny). Kurczaki umieszczono w drucianych klatkach zapewniających swobodny dostęp do paszy i wody. Przez pierwsze 7 dni temperaturę w pomieszczeniu utrzymywano na poziomie od 33 stopni C do 35 stopni Cand, a następnie stopniowo obniżano o 1 stopień C co 2 dni aż do 27 stopni C. Wszystkie kurczaki były przetwarzane zgodnie ze standardami ustalonymi przez Southwest University Animal Care i Komisja ds. użytkowania (numer certyfikatu etycznego: IAC-2021-0057). Wszystkie ptaki doświadczalne poddano eutanazji CO2 na koniec badania.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Szczepionka

Żywa szczepionka NDV (szczep La Sota) została dostarczona przez firmę Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Chiny).

Odczynniki 

Produkt ściany komórkowej drożdży (YP) G70 otrzymano ze ściany komórki drożdży (Saccharomyces cerevisiae), która zawiera b-glukan (większy lub równy 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Chiny). Surowice antygenowe i kontrolne do pomiaru miana HI specyficznego dla NDV zakupiono w Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, Chiny). Środek przeciw kurczakom CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) i CD8- PE (L{{14 }}TH49T) u szczurów oferowała firma Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Chiny).

Eksperymentalny projekt

Czterdzieści osiem kurczaków o czarnej kości w wieku 5 dni losowo przydzielono do 3 grup (Tabela 1) i podano im dietę podstawową (Tabela 2) lub dietę podstawową zawierającą 0,1% G7{{10} } (b-glukan, 0,7 g/kg) suplementacja na czas trwania niniejszego badania. Grupę H (szczepionka G70 +) i grupę C (szczepionka) immunizowano doustnie szczepionką NDV odpowiednio w 14 i 28 dniu. Grupę S (Sailne) poddano działaniu równej objętości soli fizjologicznej. Próbki krwi pobrano poprzez nakłucie żyły skrzydeł w wieku 5, 7, 14, 21, 28, 35 i 42 dni w celu zbadania miana HI. Siedem dni po szczepieniu przypominającym wybrano losowo 8 kurczaków z każdej kolumny i uśmiercono je przez uduszenie przy użyciu CO2. Limfocyty oddzielono zarówno z krwi obwodowej, jak i jelita czczego, aby przeprowadzić analizę proliferacji limfocytów i cytometrii przepływowej. W przypadku pobrania próbki z jelita czczego punktem początkowym jelita czczego było więzadło zawieszające dwunastnicy, a od punktu początkowego jelita czczego pobrano odcinek o długości 5 cm. Śledzionę szybko zamrożono w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w temperaturze -80 do RT-qPCR i profilowania sekwencji.

Tabela 1. Projekt eksperymentu

Tabela 2.1 Skład i zawartość składników odżywczych w eksperymentalnych dietach podstawowych dla brojlerów.

Cześć, studium

Oznaczenie mian HI swoistego dla NDV w surowicy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (Ball i in., 2019). W skrócie, surowicę rozcieńczono solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) od 1:2 do 1:1024 na płytce do mikromiareczkowania z 96-dołkiem w kształcie litery V. Następnie dodano 25 ml rozcieńczenia NDV na studzienkę i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Następnie do każdej studzienki dodano 25 ml 1% zawiesiny erytrocytów koguta i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Wszystkie próbki badano dwukrotnie, a na każdej płytce znajdowała się zarówno kontrola pozytywna, jak i negatywna. Miana HI oparto na największym rozcieńczeniu, które spowodowało całkowite zahamowanie hemaglutynacji. W każdej grupie mierzono średnie miano HI i błąd standardowy (SE).

Izolacja limfocytów z krwi obwodowej

Limfocyty wyizolowano i zebrano z limfocytów krwi obwodowej przy użyciu zestawu Lymphocyte Separation Medium Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Chiny). Następnie limfocyty przechowywano w zawiesinie z pożywką RPMI 1640 (Solarbio, Pekin, Chiny) zawierającą 5% płodową surowicę cielęcą i 25 mM HEPES (pH 7,0).

Izolacja limfocytów z Jejunum

Proces przypisania przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, z niewielkimi modyfikacjami (Yuan i in., 2020). Krótko mówiąc, użyj filtra komórkowego 70 mm, aby podzielić jelito na 4 ml zimnego PBS. Następnie zawiesinę komórek próbki wirowano przy 4500 obr./min przez 12 minut, usuwając supernatant. Następnie ponownie zawiesić komórki jelitowe w pełnej pożywce (Solarbio Co., Pekin, Chiny) składającej się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, Chiny). Na koniec zestaw do izolacji limfocytów z kurczaka (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) w celu oddzielenia limfocytów. tkankę jelita podzielono na 4 ml zimnego PBS przy użyciu filtra komórkowego 70 mm. Następnie zawiesinę komórek próbki odwirowano przy 4500 obr./min przez 12 minut, a supernatant odrzucono. Następnie komórki jelitowe ponownie zawieszono w RPMI 1640 (Solarbio Co.) zawierającym 5% FBS (Sijiqing Co.). Na koniec limfocyty oddzielono przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów kurczaka (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Proliferacja limfocytów 

Komórki wysiano na płytki z 96-studzienkami (5£105 na studzienkę), stymulowano antygenem inaktywowanego NDV przez 4 jednostki hemaglutynacji lub taką samą objętość soli fizjologicznej. Każdą próbkę badano w 3 powtórzeniach. Komórki i antygen inkubowano przez 44 godziny w temperaturze 37 stopni w 5% CO2, a następnie do każdej studzienki dodano 50 ml metylotiazolilotetrazolu (MTT) (2 mg/ml) i inkubowano przez kolejne 4 godziny. Próbki wirowano przy 1200 funtów g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usunięto supernatant i do każdej studzienki dodano 100 ml DMSO. Płytki wytrząsano przez 8 minut w celu całkowitego rozpuszczenia kryształów. Na koniec zarejestrowano średnią gęstość optyczną (OD) przy 570 nm. Wskaźnik stymulacji (SI) uzyskano za pomocą równania: wartości OD dołków stymulowanych/wartości OD dołków niestymulowanych (Cui i in., 2020).

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Analiza cytometrii przepływowej subpopulacji limfocytów T

Zawiesiny komórek limfoidalnych izolowano i przemywano dwukrotnie PBS. Stężenie komórek zmodyfikowano do 106 /ml i następnie trzymano na lodzie. Każdą próbkę barwiono 2 ml szczurzego CD3-APC, CD4- FITC i szczurzego CD8-PE w warunkach odpornych na światło przez 30 minut, a następnie przez 2 przemycia PBS. Komórki badano metodą cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym (BD Bioscience, San Jose, Kalifornia).

Analiza RT-qPCR

Całkowity RNA uzyskano ze śledziony przy użyciu odczynnika TRIzol (Takara, Shiga, Japonia) zgodnie z wytycznymi producenta, a następnie przekształcono w cDNA przy użyciu PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Chiny) w termocyklerze T100 (Bio-Rad, Herkules, Kalifornia). Jako gen kontroli wewnętrznej zastosowano kurzą beta-aktynę. RT-qPCR wybranych genów przeprowadzono w systemie Multiple Real-Time PCR System (AB, Carlsbad, Kalifornia) z SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Do oceny zmienności ilościowej zastosowano względną metodę ilościową (244CT) (Bi i in., 2022). Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 3.

Ekstrakcja RNA

Każdą z 3 próbek śledziony z grupy H (szczepionka G70 +) i grupy C (szczepionka) użyto do sekwencji RNA z odczynnikiem TRIzol (Takara). Następnie RNA badano pod kątem zanieczyszczenia i degradacji za pomocą 1% żelu agarozowego, a czystość RNA analizowano za pomocą spektrofotometru NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, Kalifornia). Stężenie RNA określono przy użyciu zestawu Qubit RNA Assay Kit w Qubit 2.0 Fluorometrze (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia). Integralność RNA mierzono przy użyciu zestawu RNA Nano 6000 Assay Kit systemu Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia). Wyniki wykazały, że RNA było kompletne i pozbawione zanieczyszczeń DNA.

Analiza transkryptomu

Sekwencjonowanie transkryptomu, składanie sekwencji i analizę danych dostarczyła firma Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Pekin, Chiny). Główne procedury dotyczące transkryptomu wymieniono w następujący sposób: 1) Oczyszczanie mRNA z całkowitego RNA przeprowadzono przy użyciu kulek magnetycznych dołączonych do oligo poli-T. Fragmentację przeprowadzono przy użyciu kationów dwuwartościowych w buforze reakcyjnym syntezy następnej pierwszej nici NEB (5X) w wysokiej temperaturze. 2) Zsyntetyzowano wielkość pierwszej nici cDNA przy użyciu losowego startera heksamerowego i rewersu wirusa mysiej białaczki Moloneya (M-MuLV). Następnie syntezę drugiej nici cDNA przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA I i RNazy H. 3) Pozostałe wystające fragmenty przekształcono w tępe końce poprzez aktywność egzonukleazy/polimerazy. Następnie poddano ligacji strukturę pętli o strukturze spinki do włosów NEB Next Adapter w celu przygotowania do hybrydyzacji po adenylacji końca 3' fragmentów DNA. 4) Otrzymano fragmenty cDNA o wielkości około 250 do 300 bp i bibliotekę oczyszczono przy użyciu systemu AMPure XP firmy Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Następnie nałożono 3 ml enzymu NEBU SER (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) z wybranym pod względem wielkości, ligowanym adaptorem cDNA w temperaturze 37 stopni C przez 15 minut, a następnie 5 minut w 95 stopniach. Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA Phusion High-Fidelity. Na koniec produkty PCR oczyszczono (system AMPure XP) i oszacowano jakość biblioteki za pomocą systemu Agilent Bioanalyzer 2100. Grupowanie próbek oznaczonych indeksem przeprowadzono na TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, Kalifornia). Następnie przeprowadzono sekwencjonowanie na platformie Illumina Novaseq i wygenerowano odczyty sparowanych końców o długości 150 bp. Pliki adnotacji dotyczące genomu referencyjnego i modelu genu pobrano ze strony internetowej poświęconej genomowi (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ i ftp://ftp. ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Indeks genomu referencyjnego ustalono przy użyciu HISAT2 (wersja 2.0.5), a odczyty czystego końca sparowanego dopasowano do genomu referencyjnego. Liczbę odczytów odwzorowanych na każdy gen i liczbę fragmentów na kilobazę na milion (FPKM) dla każdego genu w oparciu o długość genu i liczbę odczytów odwzorowanych na gen obliczono za pomocą funkcji Feature Counts wer. 1.5.{{38} }p3. Różnicową ekspresję pomiędzy grupą H (szczepionka G70 +) i grupą C (szczepionka) uzyskano przy użyciu pakietu DESeq2 R (1.16.1). Geny z P <0,05 i |log2 (krotna zmiana)| > 1 zdefiniowano jako geny zróżnicowanej ekspresji (DEG).

Tabela 3. Sekwencje starterów do RT-qPCR.

Ilościowa walidacja PCR w czasie rzeczywistym 

Do porównania grupy H (szczepionka G70 +) z grupą C (szczepionka) wybrano dwa DEG z regulacją w górę i 4 DEG z regulacją w dół w celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania transkryptomu za pomocą RT-qPCR. RNA przekształcono w cDNA przy użyciu PrimeScript RT Master Mix (Takara) w termocyklerze T100 (Bio-Rad). Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 3. B-aktynę kurczaka zastosowano jako gen kontroli wewnętrznej. RT-qPCR wybranych genów przeprowadzono w systemie Multiple Real-time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia) z SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Do oceny zmienności w ocenie ilościowej zastosowano względną metodę ilościową (244CT). Wszystkie próbki wykonano w trzech powtórzeniach do analizy.

Analiza statystyczna

Do wielokrotnych porównań między grupami zastosowano jednoczynnikową analizę ANOVA z testem post hoc Duncana przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Dane wyrażono jako średnią § SE. Za istotną statystycznie uznano wartość P < 0,05.

WYNIKI Wpływ b-glukanu na miano przeciwciał w surowicy

Jak pokazano na Figurze 1, miana HI specyficznego dla NDV spadły we wszystkich grupach przed szczepieniem i wzrosły w grupach H (szczepionka G70+) i C (szczepionka) po immunizacji. Co ciekawe, wyższe miana HI zaobserwowano w grupie H (G70+Szczepionka) w 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) i 42 (P > 0,05) dni niż w grupie C (szczepionka).

Wpływ b-glukanu na proliferację limfocytów

Wpływ G70 na proliferację limfocytów krwi obwodowej przedstawiono na Rycinie 2A. SI w limfocytach krwi był zwiększony u ptaków uzupełnionych szczepionką G70 (szczepionka G70 +) w 7 dniu (P < 0,05) immunizacji przypominającej w porównaniu z grupą otrzymującą szczepionkę. Co więcej, SI w limfocytach jelita czczego był znacząco zwiększony po 7 dniach (P < 0,05) po immunizacji przypominającej w porównaniu z grupą otrzymującą szczepionkę (Figura 2B).

Wpływ b-glukanu na stosunek limfocytów T CD4 + do limfocytów T CD8 + we krwi obwodowej 

Ryciny 3A i 3B przedstawiają bramkowanie limfocytów i komórek CD3 +, a Ryciny 3C do 3E przedstawiają stosunek limfocytów T CD4 +/CD8 + w G70, odpowiednio szczepionki i grupy soli fizjologicznej. Jak pokazano na Rycinie 3F, nie było zauważalnej różnicy pomiędzy grupą otrzymującą szczepionkę a grupą otrzymującą sól fizjologiczną po immunizacji przypominającej (P > 0.05), podczas gdy proporcja CD4 +/CD{{12} } Liczba limfocytów T była oczywiście wyższa w grupie G70 (szczepionka G70 +) niż w grupie szczepionki (P < 0,05).

Rycina 1. Wpływ doustnego podania b-glukanu na miano przeciwciał w surowicy przeciwko szczepionce NDV. Dane wyrażono jako średnią § SE.

Powiązana ekspresja genów

Jak pokazano na rycinie 4, znacząco wzrosła ekspresja mRNA TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) i TLR5 (P <{16}}.05) wykryto w śledzionie kurcząt leczonych G70 (szczepionką G70 +) w porównaniu z grupą otrzymującą szczepionkę. Nie stwierdzono istotnej różnicy w ekspresji mRNA IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) i TLR3 (P > 0,05) w śledzionie pomiędzy szczepionką G70 (G70 +) a szczepionką grupy.

Analiza danych sekwencjonowania RNA 

Sekwencjonowanie RNA z 8 bibliotek śledziony dało 24,1 G surowych danych, jak przedstawiono w Tabeli S1 materiału dodatkowego. CN oznacza szczepionkę grupy, a HN oznacza szczepionkę grupy G70 +. Biblioteki C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 i H4 składają się odpowiednio z 45 591 492, 47 424 782, 46 193 492, 54 403 376, 47 118 476, 45 899 262, 45 841 884 i 45 504 43 8 oryginalnych odczytów. Po aptamerze usunięto sekwencje niejednoznaczne i sekwencje niskiej jakości, pozostawiając 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 44 113 172 i 44 026 960 czystych odczytów. Ponad 96% czystych odczytów należało do oryginalnych odczytów, a 8 bibliotek dopasowano przy użyciu HISAT2 do odczytów sekwencjonowania z referencyjną bazą danych składającą się z genomu Gallusa. Co więcej, czyste odczyty zostały zmapowane do tej bazy danych w ponad 95% przypadków. Specyficzne dla bibliotek z C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 i H4 były 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46 905 784 (90,03%), 42 444 112 (93,2) %), odpowiednio 40 213 444 (90,23%), 40 922 895 (92,77%) i 40 971 972 (93,06%) odczytów przypisano jednoznacznie do referencyjnej bazy danych.

Geny o zróżnicowanej ekspresji

Jak wskazano na Figurze 5A, zidentyfikowano w sumie 198 genów o zróżnicowanej ekspresji, w tym 47 genów o regulowanej w górę i 151 genach o regulowanej w dół. DEG zostały szczegółowo opisane w dodatkowej tabeli S2. Figura 5B wskazuje, że DEG charakteryzują się dobrą powtarzalnością zabiegów.

Analiza klasyfikacji ontologii genów i Encyklopedia z Kioto wzbogacania genów i genomów

Geny ulegające zróżnicowanej ekspresji sklasyfikowano w 3 głównych kategoriach funkcjonalnych w oparciu o system klasyfikacji Gene Ontology (GO): proces biologiczny, składnik komórkowy i funkcja molekularna. 10 najpopularniejszych terminów GO w 3 kategoriach przedstawiono na rycinie 6. Przewaga genów związanych z „odpowiedzią na humoralną odpowiedź immunologiczną”, „odpowiedzią na chemokiny”, „odpowiedzią na humoralną substancję przeciwdrobnoustrojową”, „odpowiedzią obronną przed bakterią, „„reakcja immunologiczna na humor przeciwdrobnoustrojowy za pośrednictwem peptydów przeciwdrobnoustrojowych”, „reakcja obronna przeciwko bakteriom Gram-ujemnym” i „reakcja obronna przeciwko bakteriom Gram-dodatnim” w kategorii procesów biologicznych. Ponadto, w kategorii funkcji molekularnych, niezwykły stosunek genów był powiązany z „wiązaniem receptora chemokin motywu CC (CCR), receptorem chemokin”, „wiązaniem receptora chemokin” i „wiązaniem lipopolisacharydu”. Co więcej, „mitochondrialny kompleks łańcucha oddechowego I”, „kompleks dehydrogenazy NADH” i „łańcuch oddechowy” były najbardziej dominującymi terminami wzbogaconymi w kategorii składników komórkowych. Przeprowadzono także analizę szlaku szlaków genów i genomów w Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes na genach ulegających zróżnicowanej ekspresji. Wyniki sugerują, że geny pogrupowano głównie w 7 szlaków, w tym „interakcja neuroaktywny ligand-receptor”, „połączenie szczelinowe”, „szlak sygnalizacyjny kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK), „transportery ABC”, „biosynteza aminokwasów” „Metabolizm leków” i „Eksport białka”.

Rycina 2. Wpływ doustnego podania b-glukanu na wskaźnik stymulacji limfocytów (SI). (A) Limfocyty krwi obwodowej; (B) limfocyty jelitowe. Dane wyrażono jako średnią § SE.

Rycina 3. Wpływ doustnego podania b-glukanu na stosunek komórek CD4+/CD8+ we krwi obwodowej. (A) Brama na limfocytach; (B) bramka na limfocytach T CD3+; (C) częstość występowania limfocytów T CD3+ CD4 + CD8 + w grupie szczepionki G70+; (D) częstość występowania limfocytów T CD3+ CD4 + CD8 + w grupie szczepionek; (E) częstotliwości limfocytów T CD3+ CD4 + CD8 + w grupie soli fizjologicznej; (F) bardiagram przedstawiający stosunek CD4+/CD8+. Dane wyrażono jako średnią § SE.

Rycina 4. Wpływ doustnego podawania b-glukanu na ekspresję mRNA w śledzionie kurcząt. Dane wyrażono jako średnią § SE.

Rysunek 5. Podsumowanie danych RNA-Seq. (A) Lista genów ulegających różnej ekspresji, (B) mapa grupowania DEG.

Weryfikacja genów ulegających zróżnicowanej ekspresji za pomocą RT-qPCR

Poziomy 6 DEG, które uległy zwiększeniu lub obniżeniu, potwierdzono metodą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wynik sugerował, że dane z RT-qPCR były ogólnie zgodne z danymi dotyczącymi seq RNA, co wskazywało na wiarygodny wynik sekwencjonowania (Rysunek 7). Ekspresja mRNA genów powiązanych ze szlakiem MAPK Jak pokazano na Figurze 8, znacząco obniżona ekspresja mRNA FAS (P <{8}}.05) i CACNA2 (P <{20}}.05) została zmniejszona wykryty w śledzionie kurcząt z grupy G70 (szczepionka G70 +) w porównaniu z grupą szczepionek. Ponadto wykryto liczbowo zwiększoną ekspresję mRNA DUSP5 i DUSP4 oraz liczbowo zmniejszoną ekspresję mRNA p38, JNK i ERK w grupie G70 (szczepionka G70 +) w porównaniu z grupą szczepionki (P > 0,05). .

DYSKUSJA

Na fermach kurczaków szeroko zaszczepia się żywą szczepionkę przeciwko ND, a mimo to w uodpornionych stadach drobiu nadal zdarzają się sporadyczne ogniska rzekomego pomoru drobiu (Zhang i in., 2022). Optymalne szczepionki definiuje się jako stymulujące odporność komórkową i śluzówkową, a także skuteczną odporność humoralną (Shan i in., 2019). Dlatego coraz większą uwagę zwracano na adiuwanty, które mogą wywoływać śluzówkową i komórkową odpowiedź immunologiczną (Chen i in., 2014; Yu i in., 2015). W porównaniu z drogą wstrzyknięcia, podawanie doustne jest łatwiejszym podejściem, które zmniejsza koszty i powoduje mniejszy stres u kurcząt brojlerów (Boyaka i in., 2003; Zhang i in., 2008). Wyniki tego badania wykazały, że dieta uzupełniona b-glukanem znacząco zwiększała poziom mian HI swoistych dla NDV w surowicy kurcząt, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami (Horst i in., 2019). Przeciwciało specyficzne dla NDV jest niezbędne do rozwoju humoralnej odpowiedzi odpornościowej chroniącej kurczęta przed zakażeniem NDV (Martinez i in., 2018; Li i in., 2020). Limfocyty B wytwarzają przeciwciała, a limfocyty T namnażają się w odpowiedzi na mitogen (Bohacova i in., 2021). W niniejszym badaniu wskaźnik stymulacji limfocytów krwi obwodowej kurcząt wobec NDV w grupie G70 był oczywiście wyższy niż w grupie szczepionki, co wskazuje, że aktywowano więcej limfocytów T. Dominującymi subpopulacjami limfocytów T są limfocyty T CD4 + i CD8 + (Cui i in., 2020). Limfocyty T CD4 + wytwarzają głównie cytokiny i sprzyjają dojrzewaniu komórek B, podczas gdy limfocyty T CD8 + są powiązane z zabijaniem komórek docelowych (Zhang i in., 2021b). W tym badaniu stosunek limfocytów T CD4 +/CD8 + wykrytych w grupie G70 wyraźnie wzrastał, co sugeruje, że G70 może aktywować więcej limfocytów T CD4 + z krwi obwodowej. Ponadto zaobserwowaliśmy znacznie wyższy wskaźnik stymulacji limfocytów jelitowych w grupie G70 niż w grupie szczepionki, co potwierdziło, że b-glukan może również stymulować limfocyty jelitowe. Nasze poprzednie eksperymenty potwierdziły, że ekstrakt ze ściany komórkowej drożdży PW220 znacząco zwiększa liczbę komórek sIgA i IgA+ specyficznych dla jelit (Bi i in., 2020). Oznacza to, że zarówno b-glukan G70, jak i PW220 skutecznie promują odporność błony śluzowej jelit.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Donoszono już wcześniej o poprawie odporności zwierząt po podaniu b-glukanu. Guo i in. (2003) potwierdzili, że podawanie b-glukanu poprawiło u kurcząt wskaźnik przeciwciał swoistych dla kaletki i NDV. Levine i in. (2018) zasugerowali, że suplementacja b-glukanem może zwiększyć regulację jelitowego MHC Ⅱ i zwiększyć liczbę komórek CD45 +, aby złagodzić uszkodzenie jelit.

Li i in. (2005) ujawnili, że b-glukan z diety może zwiększać poziom ekspresji mRNA IL-8 i TGF-b w przewodzie pokarmowym świń. Mechanizm immunomodulującego działania b-glukanu nie jest jasny. Kim i in. (2010) wykazali, że b-glukan promuje dojrzewanie komórek dendrytycznych poprzez zwiększenie ekspresji CD40, CD80 i CD86. Ponadto Lee i Kim (2014) oraz Su i in. (2020) podali, że b-glukan aktywował receptory rozpoznawania wzorców, takie jak receptor Dectin-1, receptor Toll-podobny i CR3 (Baert i in., 2015). Śledziona jest organem krytycznym inicjującym odpowiedź immunologiczną i odgrywa zasadniczą rolę zarówno w odporności wrodzonej, jak i nabytej (Bronte i Pittet, 2013). Jednakże istnieje niewiele badań opartych na analizie sekwencji RNA ekspresji mRNA w śledzionie po doustnym podaniu polisacharydów drożdży. W niniejszym badaniu analiza szlaków przeprowadzona w Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes sugeruje, że geny te pogrupowano głównie w 2 szlaki, w tym „interakcję neuroaktywny ligand-receptor” i „ścieżkę sygnalizacji MAPK”. Receptory rozpoznawania wzorców ukierunkowane na b-glukan zostały wzbogacone na powierzchni komórek odpornościowych (Goodridge i in., 2009). Po rozpoznaniu b-glukanu kinaza tyrozynowa i czynnik jądrowy kappaB (NF-kappaB) zostały pobudzone przez te receptory, co spowodowało indukcję wydzielania cytokin prozapalnych i aktywację odpowiedzi immunologicznych (Kankkunen i in., 2010; Masuda i in. ., 2012; Xu i in., 2016; Bode i in., 2019). MAPK, jako rodzina kinaz białkowych serynowo-treoninowych, odgrywa kluczową rolę w procesach zapalnych i produkcji cytokin u kurcząt. Byun i in. (2016) wykazali, że b-glukan zwiększa produkcję interferonu-g i interleukiny-2 i powoduje znacznie wyższy poziom fosforylacji MAPK p38 w makrofagach otrzewnowych. Wang i in. (2014) podali, że b-glukan osłabia odpowiedź zapalną w komórkach THP-1 poprzez hamowanie aktywacji p38 MAPK. W tym badaniu w szlaku sygnałowym MAPK zidentyfikowano 13 DEG, w tym DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB i EGFR, co sugeruje, że b-glukan może regulować odpowiedź immunologiczną śledziony poprzez MAPK u kurcząt. MAPK to konserwatywna klasa kinaz Ser/Thr w komórkach, które biorą głównie udział w odpowiedziach komórkowych, takich jak odpowiedź immunologiczna, apoptoza i proliferacja. Rodzina MAPK obejmuje co najmniej 3 podrodziny: kinaza c-Jun N-końcowa (JNK), p38 MAPK i kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) (Hong i in., 2020; Zhang i in., 2021a). DUSP4 i DUSP5 to fosfatazy o podwójnej specyficzności, które specyficznie hamują aktywność członków rodziny MAPK, takich jak p38, JNK i ERK, odgrywając ważną rolę regulacyjną w zapobieganiu nadmiernej reakcji zapalnej i promowaniu regresji stanu zapalnego w organizmie (Imasato i in. ., 2002; Talreja i in., 2021). Ponadto doniesiono, że mały niekodujący RNA o nazwie gga-miR-200a-3p tłumi ekspresję czynników prozapalnych i w ten sposób reguluje odpowiedź autoimmunologiczną gospodarza poprzez ujemną regulację szlaku MAPK i jego dalsze cząsteczki sygnalizacyjne (Pham i in., 2017). W niniejszym badaniu analiza RT-qPCR wykazała, że ​​ekspresja mRNA P38, JNK i ERK spadła, a ekspresja mRNA DUSP4 i DUSP5 wzrosła u kurcząt karmionych b-glukanem (G70). Wyniki te sugerują, że wzmacniający odporność wpływ b-glukanu (G70) na szczepionkę przeciwko rzekomemu pomorowi drobiu może być powiązany z regulacją z ujemnym sprzężeniem zwrotnym czynników prozapalnych, w której pośredniczy MAPK. Ponadto FAS jest niezbędną substancją pośredniczącą w apoptozie i niezbędną dla homeostazy układu odpornościowego (Krueger i in., 2003; Guegan i Legembre, 2018). Tymczasem CACNA2 jest zależną od napięcia podjednostką kanału wapniowego, która ma promocyjny wpływ na proliferację, migrację i inwazję komórek (Sun i in., 2020). W tym badaniu poziomy FAS i CACNA2 uległy znacznemu obniżeniu u kurcząt otrzymujących suplementację b-glukanem (G70), co wskazuje, że b-glukan (G70) wywiera działanie wzmacniające odporność, głównie poprzez hamowanie apoptozy komórek odpornościowych i równoważenie autoimmunizacji. Odkrycia te stanowią teoretyczne odniesienie do stosowania b-glukanu (G70) jako środka wzmacniającego odporność w warunkach klinicznych. Jednakże mechanizm b-glukanu wzmacniającego odpowiedź immunologiczną poprzez efekt ujemnego sprzężenia zwrotnego szlaku MAPK wymaga dalszych dowodów. Warto zauważyć, że geny kodujące katelicydynę obejmującą CATH3, CATH1, CATH2 i geny kodujące b-defensynę, w tym AvBD6, AvBD7, AvBD1 i AvBD4, zostały znacząco obniżone w porównaniu H (szczepionka grupy G) vs. kontrola (szczepionka grupowa). Peptydy obronne gospodarza (HDP) to cząsteczki efektorowe odgrywające kluczową rolę we wrodzonym układzie odpornościowym (Cuperus i in., 2013). Peptydy te odkryto u różnych gatunków zwierząt, od ssaków po ptaki. U kurcząt występują 4 katelicydyny, składające się z CATH1, CATH2, CATH3 i CATHB1, które skutecznie zabijają różne bakterie (Hamad i in., 2017). Ptasie beta-defensyny (AvBD), alternatywnie nazywane gallinacean, to małe peptydy kationowe z 3 wiązaniami disiarczkowymi cysteiny pomiędzy resztami cysteinowymi i odgrywają ważną rolę we wrodzonym układzie odpornościowym (Yoshimura, 2015). Zmniejszenie ekspresji katelicydyn i beta-defensyny prawdopodobnie wyjaśniono regulacją ze sprzężeniem zwrotnym, w ramach której polisacharydy ściany komórkowej drożdży zmniejszały populacje bakterii i parabakterii (Bi i in., 2020). Podobne wyniki uzyskano w innych badaniach. Shao i in. (2016) wykazali, że suplementacja b-glukanu drożdżowego u kurcząt brojlerów hamowała infekcję Salmonellą i zmniejszała ekspresję HDP za pomocą ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym. W tym badaniu produkt G70 składający się głównie z b-glukanu zwiększał poziom przeciwciał swoistych dla NDV w surowicy, zwiększał wskaźnik stymulacji NDV limfocytów krwi obwodowej i limfocytów jelitowych oraz promował różnicowanie limfocytów T krwi obwodowej do CD{{ 123}} Limfocyty T. Ponadto analiza seq RNA wykazała, że ​​G70 zwiększyła ekspresję mRNA związaną z receptorem serotoninowym sprzężonym z białkiem G i polipeptydem MHC klasy I oraz obniżyła ekspresję mRNA związaną z katelicydyną i beta-defensyną. Biorąc pod uwagę wzmocniony wpływ G70 na szczepionkę ND u kurczaków, można dalej badać wpływ G70 na inne szczepionki dla drobiu, takie jak szczepionka przeciwko ptasiej grypie.

Rysunek 6. Analiza szlaku KEGG.

Rysunek 7. Potwierdzenie RT-qPCR wybranych kandydatów na DEG. Dane wyrażono jako średnią § SE.

Rycina 8. Względna ekspresja mRNA w śledzionie. Całkowity RNA ekstrahowano ze śledziony. Jako gen kontroli wewnętrznej podano b-aktynę kurczaka. Dane wyrażono jako średnią § SE.

BIBLIOGRAFIA

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt i E. Cox. 2015. Specyficzne dla typu komórek różnice w rozpoznawaniu i sygnalizacji b-glukanu we wrodzonych komórkach układu odpornościowego świń. Rozw. komp. Immunol. 48:192–203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere i K. Ganapathy. 2019. Porównawcza odporność ochronna zapewniana przez żywe szczepionki przeciwko rzekomemu pomorowi drobiu lub metapneumowirusowi ptaków podawane jednocześnie z klasycznymi i wariantowymi szczepami wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli jednodniowym kurczętom brojlerów. Szczepionka. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He i J. Ni. 2020. Produkt ściany komórkowej drożdży wzmocnił jelitową odpowiedź IgA i zmienił gatunek mikroflory jelita ślepego po doustnym szczepieniu kurcząt. Kurczątko. Nauka. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li i L. Cao. 2022. Ściana komórkowa drożdży zwiększyła komórkową odpowiedź immunologiczną na szczepionkę przeciwko wirusowi rzekomego pomoru drobiu. Kurczątko. Nauka. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd i PH Krammer. 2019. Wiązanie się dektyny-1 z aneksynami na komórkach apoptotycznych indukuje obwodową tolerancję immunologiczną poprzez oksydazę NADPH-2. Komórka. Rep. 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan i E. Javorkova. 2021. Różnica między stymulowanymi mitogenami limfocytami B i T w nieswoistym wiązaniu przeciwciał skoniugowanych z R-fikoerytryną. J. Immunol. Metody. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo i JR McGhee. 2003. Terapeutyczna manipulacja układem odpornościowym: wzmocnienie wrodzonej i nabytej odporności błony śluzowej. Aktualny Farmacja. Projekt. 9:1965–1972.

Bronte, V. i MJ Pittet. 2013. Śledziona w lokalnej i ogólnoustrojowej regulacji odporności. Odporność. 39:806–818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung i E. Byun. 2016. Napromieniowany promieniami gamma b-glukan indukuje immunomodulację i działanie przeciwnowotworowe poprzez szlaki MAPK i NF-kB. J.Sci. Żywność. rolnictwo 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou i X. Li. 2014. Wpływ płynu doustnego epimedium polisacharyd-propolisflawon na odporność błon śluzowych kurcząt. Wewnętrzne J. Biol. makromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu i S. Hu. 2020. Wzmocniona odpowiedź immunologiczna na podstawie analizy proteomicznej surowicy owiec hu przeciwko szczepionce przeciwko pryszczycy emulgowanej w adiuwancie z oleju roślinnego. Szczepionki. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk i HP Haagsman. 2013. Peptydy obronne ptasiego żywiciela. Rozw. komp. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf i DM Underhill. 2009. Rozpoznawanie beta-glukanu przez wrodzony układ odpornościowy. Immunol. Obj. 230:38–50.

Guegan, J. i P. Legembre. 2018. Nieapoptotyczne funkcje Fas/CD95 w odpowiedzi immunologicznej. FEBS J 285: 809–827.

Guo, Y., RA Ali i MA Qureshi. 2003. Wpływ beta-glukanu na odpowiedź immunologiczną u kurcząt brojlerów. Immunofarm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong i RA Dalloul. 2017. Porównawcza ekspresja peptydów obronnych gospodarza u piskląt indyków. Kurczątko. Nauka. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin i MS Diarra. 2021. Potencjał immunostymulujący owoców i ich ekstraktów u drobiu. Przód. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj i YH Hong. 2020. B-defensyna 8 ptaków kurzych moduluje odpowiedź immunologiczną poprzez szlaki sygnalizacyjne kinazy białkowej aktywowanej mitogenami w linii komórkowej makrofagów kurzych. Kurczątko. Nauka. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick i C. Hofacre. 2019. Wpływ beta- 1,3-glukanu (AletaTM) na odpowiedź na szczepienie u kurcząt brojlerów. Kurczątko. Nauka. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira i J. Li. 2002. Hamowanie p38 MAPK przez glukokortykoidy poprzez indukcję fosfatazy MAPK-1 wzmaga nietypowaną ekspresję receptora Toll-podobnego wywołaną wpływem Haemophilus 2. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teirilá, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff i S. Matikainen. 2010. (1,3)-beta-glukany aktywują zarówno inflamasom dektynowy-1, jak i NLRP3 w ludzkich makrofagach. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim i S. Han. 2010. Aktywacja komórek dendrytycznych przez glukan wyizolowany z pępka esculenta. Odporny. Sieć 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann i PH Krammer. 2003. Rola CD95 w regulacji apoptozy obwodowych komórek T. Immunol. Obj. 193:58–69.