Chimeryczny wirus brodawczaka ludzkiego-16 Cząsteczki wirusopodobne prezentujące peptydy P18I10 i T20 z otoczki HIV-1 indukują HPV16 i HIV-1-specyficzną odporność humoralną i zależną od limfocytów T u myszy BALB/c

Abstrakcyjny:

W tym badaniu peptyd CTL HIV-1 P18I10 pochodzący z pętli V3 wirusa HIV-1 gp120 i peptyd antyfuzyjny T20 wirusa HIV-1 gp41 wstawiono do białka kapsydu L1 HPV16 w celu skonstruowania chimerycznych VLP HPV:HIV (L1:P18I10 i L1:T20) przy użyciu układu ekspresji w komórkach ssaczych. HPV: VLP HIV oczyszczono metodą chromatografii. Wykazaliśmy, że insercja peptydów P18I10 lub T20 do pętli DE białek kapsydu HPV16 L1 nie wpływa na stabilność in vitro, samoorganizację i morfologię chimerycznych VLP HPV: HIV. Co ważne, nie wpływało to ani na reaktywność przeciwciał HIV-1 ukierunkowanych na sekwencyjne i konformacyjne peptydy P18I10 i T20 prezentowane na chimerycznych HPV: VLP HIV, ani na indukcję przeciwciał specyficznych dla L1-HPV16 in vivo. Zaobserwowaliśmy, że chimeryczne szczepionki VLP L1:P18I10/L1:T20 mogą indukować HPV16-, ale słabą odpowiedź przeciwciał-1-specyficzną dla HIV i wywoływać HPV16- i T-specyficzne dla wirusa HIV-1- odpowiedzi komórkowe u myszy BALB/c. Ponadto może stanowić potencjalną substancję wzmacniającą zwiększającą odpowiedź komórkową specyficzną dla wirusa HIV w immunizacji heterologicznej po szczepieniu pierwotnym szczepionką BCG.HIVA. Te prace badawcze przyczyniłyby się do opracowania nowej chimerycznej platformy szczepionek opartych na HPV: HIV VLP do zwalczania infekcji HPV16 i HIV-1, która jest pilnie potrzebna w krajach rozwijających się i uprzemysłowionych.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Słowa kluczowe:

HIV-1; HPV16; szczepionka; cząstki wirusopodobne; P18I10; enfuwirtyd T20; BCG.HIVA; Odporność humoralna; Odporność zależna od limfocytów T

1. Wstęp

Ludzki wirus niedoboru odporności-1 (HIV-1), który powoduje zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), został odkryty na początku lat 80. XX wieku i od tego czasu stał się ogólnoświatową epidemią [1]. Chociaż wysoce aktywne leczenie przeciwretrowirusowe (HAART) w połączeniu z profilaktyką przedekspozycyjną (PrEP) może mieć realny wpływ na kontrolę zakażenia wirusem HIV-1, szczepienia nadal stanowią podstawowe podejście służące pożytkowi publicznemu i zakończenie globalnej epidemii HIV-1 [2]. Pomimo ponad trzydziestu lat dokładnych badań-1 nad wirusem HIV i licznych badań klinicznych szczepionek, licencjonowana szczepionka przeciwko wirusowi HIV-1 jest jak dotąd nieosiągalna. Badanie RV144 przeprowadzone w Tajlandii było pierwszym przypadkiem, w którym wykazano niewielką skuteczność wynoszącą 31,2% w zapobieganiu zakażeniu wirusem HIV-1 [3]. Większość innych kandydatów na szczepionki przeciwko HIV-1, które przeszły badania kliniczne, opierała się głównie na DNA, rekombinowanych wektorach wirusowych lub modelach białek podjednostkowych [4,5]. Idealnie byłoby, gdyby skuteczna szczepionka przeciwko HIV-1 była zdolna do wywoływania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, neutralizowania przeciwciał w celu zapobiegania infekcji wirusowej [6], a także odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL) w celu eliminacji zakażonych komórek [7]. Jednakże wywołanie każdej odpowiedzi może wymagać różnych strategii szczepionek, co uzasadnia oddzielne, ale równoległe wysiłki rozwojowe. Wybór immunogenów i wektorów dostarczania będzie miał znaczący wpływ na funkcję i swoistość szczepionek przeciwko HIV1980 [8,9]. Powtarzające się niepowodzenia w stosowaniu standardowych podejść do opracowywania szczepionki przeciwko HIV-1 doprowadziły do ​​uznania znaczenia wyboru wektora dostarczania, schematów szczepienia pierwotnego i przypominającego oraz specyficzności immunogenu zarówno w odpowiedzi humoralnej, jak i komórkowej. Znanych jest już ponad 100 typów wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV). Uważa się, że genotypy 16 i 18 HPV są odpowiedzialne za około 70% przypadków raka szyjki macicy na świecie [10]. Cząstki wirusopodobne HPV L1 (VLP), sklasyfikowane jako rodzaj szczepionek podjednostkowych, mogą głównie indukować porównywalne odpowiedzi humoralne specyficzne dla L1- na wirion typu dzikiego, a także odpowiedzi za pośrednictwem limfocytów T [11–13]. Obecnie na rynku dopuszczone są trzy szczepionki zapobiegawcze przeciwko wirusowi HPV i wszystkie oparte są na cząsteczkach VLP białka kapsydu HPV L1. Dwa z nich, Gardasil (Merck, Rahway, New Jersey, USA) i Gardasil-9 (Merck), są produkowane przez system ekspresyjny drożdży (Saccharomyces cerevisiae), podczas gdy drugi, Cervarix (GSK, Brentford, Wielka Brytania), jest wytwarzany przez układ wektor ekspresyjny bakulowirusa/komórka owada (BEVS/IC) [14]. Do chwili obecnej nie ustalono optymalnych warunków produkcji białek L1 HPV16 w ssaczym układzie ekspresyjnym. Zatem opracowanie szczepionki skojarzonej, która chroniłaby przed infekcjami HPV i HIV, jest logicznym wysiłkiem w walce z tymi dwoma głównymi patogenami na świecie.

W naszej poprzedniej publikacji przeglądowej dotyczącej koncepcji projektowania szczepionek przeciw wirusowi HIV-1 opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) wspomnieliśmy, że VLP bez otoczki, takie jak VLP wirusa brodawczaka, mogą odgrywać funkcjonalną rolę jako wektory dostarczania HIV-1 CTL lub epitopy przeciwciał neutralizujących [15,16]. Hipotezę tę potwierdzono w przypadku kilku chimerycznych bydlęcych wirusów brodawczaka (BPV) L1 VLP prezentujących epitop P18I10 CTL z pętli V3 białka otoczki gp120 HIV-1 (Env) i epitopu 2F5 lub regionu MPER gp41 HIV-1 Env [17–22]. Cecha strukturalna białek kapsydu L1 wirusa brodawczaka ludzkiego typu-16 (HPV16) jest podobna do BPV i może samoorganizować się w jednowarstwowe VLP L1 [23]. Pięć białek L1 HPV16 tworzy pentamer, a 72 z pentamerów samoorganizują się, tworząc VLP HPV16 [24]. Jednakże nadal nie ma wyraźnych dowodów na to, że chimeryczne białka kapsydu HPV16:HIV mogą być stabilne in vitro i samoorganizować się w morfologicznie integralne VLP. Z drugiej strony wykazano, że VLP L1 HPV16 są wysoce immunogenne i zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T i B swoistych wobec antygenu [11–13]. Nie wiadomo jeszcze, czy prezentacja epitopów HIV-1 przez HPV: VLP HIV może być immunogenna. W tym badaniu naszym celem było opracowanie chimerycznej szczepionki HPV: HIV opartej na VLP przy użyciu ludzkich komórek 293F, dobrze ugruntowanego systemu ekspresji w komórkach ssaczych. Białko L1 HPV 16 pełniło rolę strukturalnego rusztowania szczepionki, a peptydy P18I10 i T20 wybrano jako immunogeny HIV-1 i wstawiono do pętli DE białka L1 HPV 16. Immunodominujący epitop CTL P18I10 zawierający 10 aminokwasów (reszty 311–320: RGP GRAFVTI) pochodzi z trzeciej domeny zmiennej (V3) glikoproteiny gp120 otoczki HIV-1. Peptyd P18I10 został zidentyfikowany jako cząsteczka MHC klasy I z ograniczeniem H-2Dd, indukująca odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T (CTL) [25,26]. Peptyd T20, znany jako Enfuwirtyd i zaprojektowany jako przeciwretrowirusowy multimeryczny peptyd fuzyjny, składa się z sekwencji 36 aminokwasów (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) naśladującej C-końcową sekwencję heptady helisy blisko błony0 proksymalny region zewnętrzny (MPER) glikoproteiny otoczki HIV-1 41 (gp41) [27]. Te dwa epitopy na bazie komórek HIV-1 T (P18I10) i B (T20) wybrano jako punkt wyjścia i eksperyment weryfikujący koncepcję dla platformy rozwoju chimerycznej szczepionki HPV: HIV opartej na VLP.

W ciągu ostatniej dekady przetestowano wiele różnych postaci dawki pierwotnej szczepionki przeciwko HIV-1 opartej na VLP [15]. Chociaż większość wcześniejszych strategii szczepień przeciwko HIV-1 VLP [28] lub chimerycznej BPV: HIV VLP [17–22] skupiała się na indukowaniu odpowiedzi immunologicznej poprzez zastosowanie homologicznego schematu szczepienia pierwotnego i przypominającego, dwa wcześniejsze badania sugerowały, że immunizacja heterologiczna składający się z rekombinowanegoMycobacteria bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) wykazujący ekspresję wirusa HIV-1 Gag prime i HIV-1 Gag VLP mogą przyczyniać się do zwiększenia odporności limfocytów T [29,30]. W naszej grupie badawczej wykazaliśmy, że szczepienie pierwotne rBCG wyrażające immunogen HIVA i wzmocnienie rekombinowanym wektorem wirusowym MVA.HIVA było bezpieczne i wywoływało odpowiedź immunologiczną limfocytów T specyficzną dla HIV-1-u myszy BALB/c [31–33]. Immunogen HIVA, zaprojektowany przez dr Tomasa Hanke, składa się z pełnej długości białka Gag HIV-1 połączonego z wieloma epitopami CTL, w tym epitopami P18I10 na C-końcu [34]. Dlatego też chcieliśmy ocenić, czy BCG.HIVA może wzmocnić odpowiedź immunologiczną komórek T indukowaną przez VLP wirusa HIV: HPV (L1:P18I10) u myszy BALB/c.

W tym badaniu zaprojektowano i wytworzono chimeryczne immunogeny HPV:HIV (L1:P18I10 i L1:T20) przy użyciu układu ekspresyjnego 293F. Ekspresję białek chimerycznych L1:P18I10 i L1:T20 potwierdzono metodą barwienia immunologicznego. HPV: VLP HIV następnie oczyszczono metodą 3-etapowej chromatografii, w tym chromatografii kationowej (CEC), wykluczania wielkościowego (SEC) i powinowactwa do heparyny (H-AC). Następnie stabilność in vitro, samoorganizację in vitro i morfologię oczyszczonych VLP HPV: HIV potwierdzono odpowiednio za pomocą nieredukującej SDS-PAGE, testu masy cząsteczkowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Sekwencyjne i konformacyjne peptydy P18I10 i T20 prezentowane na chimerycznych VLP HPV: HIV scharakteryzowano dalej za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 in vitro za pomocą Western blot i pośredniego testu ELISA. Na koniec, immunogenność HPV: VLP HIV oceniano w modelu mysim BALB/c. Wykazaliśmy, że chimeryczne szczepionki oparte na VLP L1:P18I10 i L1:T20 mogą indukować odpowiedź przeciwciał specyficznych dla HPV16- i HIV-1-, a chimeryczne VLP L1:P18I10 mogą indukować HPV16- i HIV{ {37}}specyficzne odpowiedzi komórek T u myszy BALB/c. Ponieważ opracowanie i produkcja immunogennej szczepionki HPV: HIV jest nadal nieosiągalna, badanie to dostarczyło strategii bazowej, która może być warta wsparcia światowych wysiłków na rzecz opracowania nowych chimerycznych szczepionek na bazie VLP do zwalczania zakażeń HPV i HIV-1.

2. Materiały i metody

2.1. Konstrukcja szczepu szczepionkowego BCG.HIVA2auxo.int

Rekombinowany BCG eksprymujący immunogen HIVA został wcześniej skonstruowany przy użyciu integracyjnego wektora wahadłowego p2auxo.int E. coli-mykobakterii. Konstrukcję wektora E. coli/prątków eksprymującego antygen HIVA opisano wcześniej [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int rozcieńczono w PBS-Tween20 do 2 x 107 cfu/ml, poddano działaniu ultradźwięków w celu rozbicia grudek bakterii i zaszczepiono tylną podkładkę z pożywieniem lub myszy BALB/c (50 µl, 106 jtk/mysz).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

2.2. Kultury bakteryjne i transformacja

Komórki auksotroficznego glicynowego szczepu E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), dostarczone przez dr Pau Ferrera, hodowano w minimalnej pożywce pochodnej M9- (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L, KH2PO4, 3 g/L, NaCl, {{10}},5 g/L, NH4Cl, 1 g/L, glukoza, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0,1 mmol/L; tiamina, 0,1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , uzupełniony glicyną (70 µg/ml). Komórki E. coli M151Gly transformowano plazmidami p2auxo.HIVA metodą elektroporacji. W tym celu hodowle E. coli hodowano do gęstości optycznej 0,9 przy 600 nm i transformowano przy użyciu elektroporatora pulsującego genu Bio-Rad przy 2,5 kV, 25 µF i 200 Ω. Transformowane komórki hodowano następnie na płytkach agarowych M9-D (składniki jak opisano wcześniej, z dodatkiem 1,5% baktoagaru) bez dodatku glicyny w celu selekcji lub z dodatkiem glicyny jako kontroli. Auksotroficzny szczep BCG z lizyną, BCG∆lys, dostarczony dzięki uprzejmości WR Jacobsa Jr., BR Blooma i T. Hsu, transformowano plazmidowym DNA p2auxo.HIVAint metodą elektroporacji. Prątki hodowano w pożywce bulionowej Middlebrook 7H9 lub na pożywce agarowej Middlebrook 7H10 uzupełnionej katalazą albuminowo-dekstrozową (ADC; Difco) zawierającą 0,05% Tween 80. Monochlorowodorek L-lizyny (Sigma, Kawasaki, Japonia) rozpuszczono w wodzie destylowanej i stosowany jako suplement w końcowym stężeniu 40 µg/ml. Do transformacji BCG hodowano do gęstości optycznej 1,5 przy 600 nm i transformowano przy użyciu elektroporatora pulsującego genu Bio-Rad przy 2,5 kV, 25 µF i 1000 Ω. Transformanty następnie hodowano na podłożu agarowym Middlebrook 7H10 z dodatkiem ADC, zawierającym 0,05% Tween 80 bez dodatku lizyny.

2.3. Linie komórkowe i hodowla komórkowa

Komórki 293F (Tibco), pochodzące z komórek ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) 293, hodowano w pożywce ekspresyjnej FreeStyle 293 (Tibco) uzupełnionej 5 ml/l penicyliny-streptomycyny (Tibco) i inkubowano w inkubatorze o temperaturze 37°C zawierającym w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 na platformie wytrząsarki orbitalnej obracającej się z szybkością 125 obr./min.

2.4. Produkcja białek L1:P18I10 i L1:T20 przy użyciu systemu ekspresyjnego 293F

Konstrukt pCDNA3.1 zawierał sekwencje kodujące DNA L1:P18I10 lub L1:T20 odpowiadające chimerycznym białkom, odpowiednio, L1:P18I10 i L1:T20. Peptyd HIV-1 P18I10 CTL (RGPGRAFVTI) lub peptyd T20 (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) wstawiono do pętli DE białka kapsydu L1 HPV16. Sekwencję pętli L1 DE HPV16 kodującą 130–136 aminokwasów zastąpiono peptydem P18I10I10 lub T20. Sekwencje kodujące DNA L1:P18I10 lub L1:T20 zmodyfikowano sekwencją Kozaka, zoptymalizowano za pomocą ludzkiego kodonu, otoczono miejscami enzymów restrykcyjnych HindIII i XbaI i wklonowano do wektora pcDNA3.1(+) przy użyciu usług syntezy genów GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Rekombinowany plazmidowy DNA (pDNA) transformowano do kompetentnych komórek E. coli DH5 (Invitrogen) w celu amplifikacji i ekstrahowano przy użyciu zestawów plazmidowych Maxi (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Komórki 293F hodowano z 30 ml podłoża ekspresyjnego FreeStyle 293 w 125 ml kolbie Erlenmeyera (Corning, Nowy Jork, NY, USA) do gęstości 1,0 x 106/ml i przejściowo transfekowano pDNA L1:P18I10 lub L1:T20 przy użyciu rozgałęzionego polietylenoimina o masie cząsteczkowej 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) przy zoptymalizowanym stosunku DNA do PEI 1:3 (w/w) i DNA do podłoża hodowlanego 1:1 (w/v), zgodnie zgodnie z instrukcją producenta [35]. Komórki 293F zebrano 96 godzin po transfekcji. Komórki 293F mogą osiągnąć gęstość konfluencji wynoszącą 3,6 × 106 komórek/ml przy około 50% żywotności.

2.5. Barwienie immunofluorescencyjne

Komórki permeabilizowano na szkiełku za pomocą 100% zimnego acetonu. Następnie utrwalone komórki sondowano przeciwciałem L1 przeciwko HPV16 CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) i wychwytywano za pomocą anty-mysiego IgG-FITC (Sigma). Monowarstwy komórek wybarwionych immunologicznie dokładnie przemyto PBS i przykryto pożywką do mocowania z DAPI (Abcam). Obrazy immunofluorescencyjne sprawdzano pod odwróconym mikroskopem przy powiększeniu 40x. Skuteczność transfekcji określono poprzez stosunek komórek FITC (zielony)-dodatnich do komórek wybarwionych DAPI (niebieski).

2.6. Oczyszczanie HPV: HIV (L1:P18I10 i L1:T20) VLP

Łącznie 108 transfekowanych komórek 293F w 125 ml kolbie Erlenmeyera (30 ml pożywki hodowlanej na kolbę) zebrano przez wirowanie przy 1500 obr./min przez 5 minut i przemyto dwukrotnie PBS. Osad komórkowy ponownie zawieszono w buforze do lizy sporządzonym z 1% Triton X-100, inhibitora proteazy (1:100) (Millipore) i benzonazy (25 U/ml) (Millipore). Lizaty komórkowe klarowano za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 µm PVDF (Millipore). Próbki HPV: HIV (L1:P18I10 i L1:T20) VLP oczyszczono seryjnie za pomocą wymiany kationowej (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), wykluczenia wielkości (Capto Core 700, GE) i powinowactwa (HiTrap Heparin HP , GE) chromatografia. Protokoły chromatograficzne zostały opisane w naszych poprzednich badaniach [36,37] i były zgodne z protokołem producenta [38]. Sygnał białka L1 na każdym etapie oczyszczania scharakteryzowano metodą Western blot i sondowano przeciwciałem L1 anty-HPV16 CAMVIR-1 [39].

2.7. Nieredukująca SDS-PAGE

VLP HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 zmieszano z 2 x buforem do próbek Laemmli (BIO-RAD) przy braku lub w obecności 5% (v/v) 2-merkaptoetanolu ({{11} }ME) i reakcję przeprowadzano w temperaturze pokojowej (RT) przez 24 godziny. Próbki rozdzielono na żelach białkowych wolnych od plam z 8–16% TGX (BIO-RAD). Następnie żele przeniesiono na membrany PVDF. Błony sondowano mAb anty-HPV16 L1 CAMVIR-1 w rozcieńczeniu 1:4000. Następnie membrany inkubowano z koniugatem anty-mysiej peroksydazy IgG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) w rozcieńczeniu 1:4000. Sygnał opracowano i wizualizowano metodą chemiluminescencji przy użyciu zestawu substratów Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA). Obrazy blotowe uzyskano przy użyciu systemu obrazowania Odyssey Fc.

2.8. Analiza masy cząsteczkowej

VLP HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 bez obróbki 2-ME odfiltrowano przez urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) 1000 kDa (SARTORIUS). VLP HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 poddane obróbce 2-ME przepuszczono przez urządzenia do ultrafiltracji 100 kDa MWCO (Amicon). Retentaty odtworzono do pierwotnej objętości i zebrano ze zbiornika próbki urządzenia filtrującego, natomiast przesącze zebrano na dnie probówki wirówkowej. Sygnał L1 mierzono za pomocą analizy punktowej sondowanej mAb L1 anty-HPV16 i wykrywano koniugatem anty-mysiej IgG-peroksydaza (Sigma-Aldrich). Obrazy uzyskano przy użyciu systemu obrazowania Odyssey Fc w kanale chemiluminescencyjnym.

Korzyści z cistanche tubulosa-wzmocnić układ odpornościowy

2.9. Barwienie negatywne i transmisyjna mikroskopia elektronowa

Po naładowaniu siatek miedzianych pokrytych węglem (Sigma-Aldrich) w świetle ultrafioletowym przez 5 minut, dostępne w handlu HPV16 L1 (Abcam), oczyszczone L1:P18I10 i L1:T20 VLP zrównoważone 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl ) absorbowano na siatkach przez 1 minutę i trzykrotnie przemywano wodą miliQ. HPV: HIV VLP barwiono negatywnie 2% octanem uranylu przy pH 4,5 (Sigma-Aldrich) przez 1 minutę. Nadmiar środków barwiących usunięto za pomocą jakościowej bibuły filtracyjnej Whatman (Sigma-Aldrich). Siatki umieszczono w komorze osuszacza na co najmniej 2 godziny przed obserwacją. Obrazy uzyskano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Tecnai Spirit 120 kV) przy powiększeniu odpowiednio SA135K (100 nm) i SA59000 (200 nm).

2.10. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu i analiza Western Blot

Równe ilości (500 ng) białka L1 HPV16 (Abcam), oczyszczone VLP L1:P18I10 i L1:T20 zmieszano z 2 x buforem do próbek Laemmli zawierającym 5% 2-ME i gotowano w temperaturze 95°C przez 5 minut . Próbki rozdzielono w 8–16% żelach białkowych TGX Stain-free, a następnie przeniesiono na membranę PVDF (Millipore, Burlington, MA, USA) przy użyciu urządzenia do transferu Semi-Dry (Bio-Rad). Membranę blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w TBST. Następnie błony sondowano mAb anty-HPV16 L1 CAMVIR-1 w rozcieńczeniu 1:4000, mAb pętli anty-HIV-1 gp120 V3 (NIBSC, EVA3012) w rozcieńczeniu 1: 40 i mAb HIV1 gp41 (2F5) (NIBSC, ARP3063) odpowiednio w rozcieńczeniu 1:4000. Następnie membrany inkubowano z koniugatem anty-mysiej peroksydazy IgG (Sigma-Aldrich) w rozcieńczeniu 1:4000. Do wywołania sygnału wykorzystano zestaw substratu Western ECL (BIO-RAD). Obrazy blot uzyskano stosując system obrazowania Odyssey Fc na kanale chemiluminescencyjnym.

2.11. Immunizacja myszy, pobieranie surowicy i izolacja splenocytów

Jest to wstępne badanie potwierdzające koncepcję mające na celu wykazanie immunogenności HPV: VLP HIV (L1:P18I10 i L1:T20 VLP). Dawka, droga podawania i odstęp czasu między dawkami pierwotnymi naszych HPV: VLP HIV odnosiły się do poprzednich badań, w których immunizowano myszy bydlęcym wirusem brodawczaka (BPV): VLP HIV w celu indukowania odpowiedzi przeciwciał [20,21]. Oczyszczony HPV: VLP HIV emulgowano z równą objętością (225 µg na każdą dawkę 0,5 ml) siarczanu hydroksyfosforanu glinu (Thermo Fisher), aby zapewnić formułę podobną do licencjonowanej szczepionki Gardasil-9 HPV [40]. We wszystkich grupach myszy rozkład płci był równy (mężczyźni n=4 i samice n=4 na grupę). W grupach A i B, myszy BALB/c immunizowano domięśniowo (im) 10 µg, odpowiednio, VLP L1:P18I10 lub L1:T20, stosując homologiczny reżim dawki pierwotnej-dawki przypominającej. W grupie C myszom zaszczepiono śródskórnie 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int (identyfikator, na poduszce z pokarmem) i wzmocniono domięśniowo 10 µg VLP L1:P18I10. W grupie D myszom stanowiącym kontrolę pozytywną zaszczepiono szczepionką pierwotną Gardasil- 9, a następnie dawkę przypominającą szczepionki Gardasil-9 domięśniowo za pomocą 10 µg VLP HPV16 L1. W grupie E myszy stanowiące kontrolę negatywną immunizowano dwukrotnie buforem PBS. Odstęp pomiędzy dawkami pierwotnymi i przypominającymi wynosił 2 tygodnie. Myszy uśmiercono w 28 dniu. Pobrano próbki krwi z serc myszy. Surowice odzyskiwano przez odwirowanie i przechowywano w temperaturze -20°C do testu ELISA. Mysie śledziony usunięto i przeciśnięto pojedynczo przez sitko komórkowe (Falcon) z gumowym tłokiem strzykawki o pojemności 5 ml. Po usunięciu czerwonych krwinek buforem do lizy ACK (Lonza), splenocyty przemyto i ponownie zawieszono w pożywce limfocytowej R10 (RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), penicyliną-streptomycyną, 20 mM HEPES i 15 mM {{ 46}}ME) w stężeniu 2 × 107 komórek/ml.

2.12. Test immunoenzymatyczny

Aby przetestować przeciwciała swoiste dla HPV16 L1- i HIV-1- wiążące się z chimerycznym HPV: konstrukty VLP HIV in vitro, 50 µl o równym stężeniu (200 ng/ml) rekombinowanego białka L1 HPV16 (Abcam, ab119880 ), oczyszczone L1:P18I10 i L1:T20 VLP w 50 mM buforze wodorowęglanowo-węglanowym (pH=9,6) (Sigma) 2-krotnie rozcieńczono seryjnie i naniesiono na płytki Maxisorb (Nunc). Płytki inkubowano w temperaturze 4°C przez noc. Płytki blokowano buforem blokującym (5% odtłuszczonego mleka w TBST) w temperaturze 37°C przez co najmniej 2 godziny. Po dwukrotnym przemyciu TBST, płytki pokryte VLP inkubowano z mAb anty-HPV16 L1 CAMVIR-1 w rozcieńczeniu 1:8000, mAb 2F5 (NIBSC, ARP3063) w rozcieńczeniu 1:8000 i anty-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb pętli HIV-1 gp120 V3 (NIBSC, EVA3012) w rozcieńczeniu 1:40 w buforze blokującym, odpowiednio, w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po trzykrotnym przemyciu TBST, płytki inkubowano z koniugatem rekombinowanej peroksydazy białka G (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) w rozcieńczeniu 1:4000 w buforze blokującym w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. TMB zastosowano do wywołania sygnału testu immunoenzymatycznego (ELISA) i zatrzymano za pomocą 50 µl 2M H2SO4. Zmierzono i zarejestrowano gęstość optyczną (OD) każdej studzienki przy długości fali 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek o absorbancji EL × 800.

Aby zmierzyć przeciwciała indukowane przez VLP u myszy BALB/c, płytki do mikromiareczkowania pokryto 50 µl rekombinowanego białka L1 HPV16 o stężeniu 2 µg/ml (Abcam, ab119880), peptydu HIV-1 P18I10 (NIBSC, ARP734), Peptyd T20 (NIBSC, ARP984), odpowiednio, z 50 mM buforem węglanowo-wodorowęglanowym (pH=9,6). Płytki inkubowano w temperaturze 4°C przez noc. Płytki blokowano buforem blokującym (5% odtłuszczonego mleka w TBST) w temperaturze 37°C przez co najmniej 2 godziny. Jednocześnie surowicę pobraną od myszy immunizowanych grupą AE rozcieńczono 5% odtłuszczonym mlekiem w TBST w stosunku 1:50. Po dwukrotnym przemyciu TBST płytki inkubowano z rozcieńczonymi surowicami w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po trzykrotnym przemyciu TBST, do płytek dodano koniugat rekombinowanego białka G HRP w rozcieńczeniu 1:4000 w buforze blokującym i inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Do wywołania sygnału ELISA użyto TMB i zatrzymano za pomocą 50 µl 2M H2SO4. OD każdej studzienki mierzono przy długości fali 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek o absorbancji EL × 800 (Biotek).

2.13. Test IFN-ELISpot

Test enzymatycznej plamki immunoabsorpcyjnej (ELISpot) przeprowadzono przy użyciu dostępnego w handlu mysiego zestawu IFN-ELISpot (Mabtech, Nacka Strand, Szwecja), zgodnie z instrukcjami producenta. Płytki ELISpot (MSISP4510, 96-płytki dołkowe z membranami z difluorku poliwinylidenu, Millipore, Middlesex County, MA, USA) traktowano 70% EtOH i powleczono oczyszczonym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysim interferonem (IFN-) wychwytującym, rozcieńczonym w solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 5 µg/ml w temperaturze 4°C przez noc. Następnie do każdej studzienki dodano 2,5 x 105 świeżych splenocytów. Następnie komórki z grup A i B stymulowano odpowiednio 2 µg/ml VLP HPV16 L1 i peptydami HIV-1 P18I10. Wszystkie próbki i kontrole umieszczono w podwójnych studzienkach. Testy ELISpot inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 37°C, 5% CO2. Płytki następnie przemyto 5 x PBS, inkubowano przez 2 godziny z biotynylowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-IFN (mAb) rozcieńczonym w PBS 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) do końcowego stężenia 2 µg/ml, przemyto 5 razy w PBS i inkubowano z koniugatem streptawidyna-fosfataza alkaliczna w PBS 2% FCS. Następnie płytki przemyto 5 razy PBS przed inkubacją ze 100 µl roztworu substratu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP)/błękitu nitrotetrazolowego (NBT) (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, USA). Po 5–10 minutach płytki przemyto wodą wodociągową, osuszono i zliczono powstałe plamy za pomocą czytnika ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Niemcy). Dla każdego zwierzęcia od wszystkich studzienek indywidualnie odejmowano średnią odpowiedzi tła, aby umożliwić porównanie komórek tworzących plamki IFN (SFC)/106 pomiędzy grupami. Aby zdefiniować odpowiedzi pozytywne, próg zdefiniowano jako co najmniej pięć plamek na dołek i odpowiedzi przekraczające średnią liczbę plamek w dołkach kontroli negatywnej plus trzy odchylenia standardowe dołków kontroli negatywnej.

2.14. Analiza statystyczna

Całą analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Prism 6 GraphPad (CA, USA). Wykorzystaliśmy dane z eksperymentów przeprowadzonych dla 5 różnych stężeń powłoki płytek ELISA (0, 50, 100, 150, 200 ng/ml) rekombinowanego białka L1 HPV16 (Abcam, ab119880) i HPV: VLP HIV. Zebraliśmy dane z 2 grup (HPV16 L1 i HPV: VLP HIV) i zebraliśmy trzy powtórzenia dla każdego stężenia powłoki. Wykres w Prism pokazał dane w postaci wykresu punktowego pokazującego stężenie powłoki (ng/ml) na osi X i OD450 na osi Y. Ponieważ postawiliśmy hipotezę, że nasze dane ELISA in vitro są powiązane liniowo, przeprowadziliśmy analizę regresji liniowej i porównaliśmy nachylenia obu linii, aby potwierdzić, że zbiór danych-1 i zbiór danych-2 (przeciwciała reaktywność pomiędzy HPV16 L1 i HPV: HIV VLP) różnią się w swoim działaniu. Wybraliśmy 95% przedziały ufności wzdłuż linii najlepszego dopasowania. Prism automatycznie nałożył linię regresji liniowej na oba nasze zbiory danych i wykreślił linię przerywaną reprezentującą 95% przedziały ufności. Podczas analizy regresji liniowej oprogramowanie obliczyło tylko średnią wartość Y naszego zestawu danych, która wskazała dobroć dopasowania. Dodatkowo Prism podzielił się z nami komentarzem, zatem możemy stwierdzić, że różnice pomiędzy obydwoma stokami są niezwykle istotne.

Mieliśmy 5 zestawów (ELISA) i 4 zestawy (ELISPOT) danych zebranych z eksperymentów immunizacji myszy. Te zestawy danych zawierały równą liczbę (mężczyzn n=4 i kobiet n=4) w każdej grupie. Użyliśmy myszy immunizowanych Gardasilem-9-jako grupy kontroli pozytywnej i myszy immunizowanych PBS jako grupy kontroli negatywnej. Dane z naszych zaprojektowanych eksperymentów nie pasowały ani nie były parowane. Przeprowadziliśmy jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), aby sprawdzić, czy te średnie były różne. Najpierw sprawdziliśmy, czy nasze dane pasują do rozkładu normalnego Gaussa. Stwierdziliśmy, że niektóre grupy danych w teście ELISA nie przeszły testu rozkładu normalnego Gaussa. Dlatego przeprowadziliśmy nieparametryczną analizę statystyczną tych danych. Natomiast wszystkie grupy danych w teście ELISPOT przeszły test rozkładu normalnego Gaussa. W związku z tym przeprowadziliśmy parametryczną analizę statystyczną tych danych. Próg istotności i poziom ufności ustalono na 0,05 (co odpowiada 95% przedziałowi ufności). Wartość p pokazująca ogólnie prawdopodobieństwo istnienia różnic pomiędzy grupami. Ponieważ naszą główną troską w tym eksperymencie są różnice między naszymi grupami, wielokrotne porównania w Prism dały nam wynik porównania we wszystkich grupach z każdą inną grupą.

2.15. Oświadczenia dotyczące etyki

Myszy BALB/c w wieku od sześciu do ośmiu tygodni zakupiono od Envigo (Inotiv Company, Chicago, IL, USA) i zatwierdzono przez władze lokalne (Generalitat de Catalunya, numer projektu 11157) i Komisję Etyki Universitat Autònoma de Barcelona. Doświadczenia na zwierzętach były ściśle zgodne z przepisami Generalitat de Catalunya dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Etyki Badań (Procedura 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Wyniki

3.1. Projektowanie immunogenów L1:P18I10 i L1:T20 oraz ocena HPV: ekspresja białka HIV przy użyciu układu ekspresyjnego 293F

Peptyd P18I10 z pętli trzeciej domeny zmiennej HIV-1 Env (V3) i peptyd T20 z bliższego regionu zewnętrznego błony HIV-1 Env (MPER) wprowadzono do białka pętli DE HPV16 L1 w celu wytworzenia chimerycznego L1 Immunogeny :P18I10 i L1:T20. Chimeryczne sekwencje kodujące DNA L1:P18I10 i L1:T20 sklonowano do wektora ekspresyjnego plazmidowego DNA pcDNA3.1 (+) w celu przejściowej transfekcji w komórkach 293F (Figura 1A). Struktury monomerowe białek kapsydu HPV16 L1, chimerycznych L1:P18I10 i L1:T20 wstępnie przewidziano przy użyciu serwera modelu SWISS (ryc. 1B). Główne białko kapsydu HPV16 L1 (7cn2.1.R) zostało wybrane jako szablon strukturalny do zbudowania modelowania homologii białek kapsydu HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20. W porównaniu z konformacją związanego peptydu P18I10 w poprzednim badaniu [41], kierunek głównego łańcucha od N do C-końca peptydu P18I10 na naszym chimerycznym białku L1:P18I10 biegnie od prawej do lewej (Rysunek 1B, środkowy i górny panel), a odsłonięte łańcuchy boczne P18I10 mogą potencjalnie oddziaływać z receptorami komórek T (Rysunek 1B, panel środkowy i dolny). W porównaniu ze strukturą peptydu będącego inhibitorem fuzji HIV-1 w poprzednim artykule przeglądowym [42], wstawiony peptyd T20 do białka kapsydu HPV16 L1 jest przedstawiony jako formacja przypominająca helisę (Rysunek 1B, prawy i górny panel ), a eksponujące łańcuchy boczne T20 mogą potencjalnie zostać rozpoznane przez receptory komórek B (Rysunek 1B, prawy i dolny panel). Ponieważ białka kapsydu HPV16 L1 mogą jednorodnie łączyć się w ikozaedryczną cząstkę T=7 z 72 pentamerycznymi kapsomerami [43], prezentacja peptydów P18I10 lub T20 o dużej gęstości na zewnętrznej powierzchni chimerycznego HPV: VLP HIV jest potencjalnie silnie immunostymulująca w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla epitopu.

Rycina 1. Projektowanie i konstrukcja immunogenów L1:P18I10 i L1:T20 chimerowych HPV:VLP VLP przy użyciu układu ekspresyjnego 293F. (A) Chimeryczne sekwencje kodujące DNA L1:P18I10 i L1:T20 sklonowano odpowiednio do wektorów ekspresyjnych pcDNA3.1+ w celu przejściowej transfekcji w komórkach 293F. (B) Przewidywanie struktur monomerowych HPV16 L1 i chimerycznych białek kapsydu HPV: HIV przy użyciu serwera modelu SWISS. Główne białko kapsydu HPV16 L1 (7cn2.1.R) zostało wybrane jako szablon strukturalny do zbudowania modelowania homologii białek kapsydu HPV16 L1 (lewy panel), L1:P18I10 (środkowy panel) i L1:T20 (prawy panel). Wtórne elementy strukturalne białka kapsydu L1 HPV16 są oznaczone literami h1–h5 oznaczającymi helisy 5 -. Pętle białka kapsydu L1 HPV16 pomiędzy niciami są oznaczone BC, CD, DE, EF, FG i HI. Wtórne elementy strukturalne peptydów L1 HIV-1 P18I10 i T20 są oznaczone strzałkami (górny panel). Część peptydów P18I10 i T20, która wystaje ponad powierzchnię białka kapsydu HPV16 L1, jest zaznaczona strzałkami (panel dolny). (C) Barwienie immunofluorescencyjne białka L1 w komórkach 293F. Następujące pDNA.L1:P18I10 (po lewej), pDNA.L1:T20 (w środku) i pDNA.bez insercji (po prawej) transfekowano do komórek 293F. Transfekowane komórki sondowano mAb L1 anty-HPV16 i wykrywano za pomocą anty-mysiego IgG-FITC (kanał zielony). Jądra komórkowe barwiono DAPI (kanał niebieski). Obrazy immunofluorescencyjne połączono przy użyciu programu Adobe Photoshop

Ponieważ sekwencja końcowa białka C HPV16 L1 pośredniczy w mechanizmach importu jądra komórkowego podczas infekcji [44], we wcześniejszych badaniach zidentyfikowano sygnały lokalizacji jądrowej (NLS) białka L1 HPV16 [45]. Wybrano przeciwciało monoklonalne CAMVIR-1 do rozpoznawania epitopu L1 HPV16 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], a barwnik FITC na bazie fluoresceiny zastosowano jako reporter do monitorowania ekspresji L1:P18I10 i L1: Białka T20. Obrazy immunofluorescencyjne wyraźnie pokazały, że HPV16 L1 (na zielono) był zlokalizowany głównie w jądrach (na niebiesko) komórek 293F. Nie zaobserwowano sygnału L1 w komórkach 293F transciętych plazmidem kontrolnym (plazmid pcDNA3.1 bez wstawki) (Figura 1C). Wyniki sugerują, że zarówno chimeryczne białka kapsydu L1:P18I10, jak i L1:T20 mogą ulegać ekspresji poprzez zastosowanie transfekcji za pośrednictwem polietylenoiminy (PEI) i być rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne HPV16 L1 CAMVIR-1.

3.2. Oczyszczanie L1:P18I10 i L1:T20 VLP przy użyciu metod chromatograficznych

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa i heterologiczny dolny prążek<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figura 2. Oczyszczanie i charakterystyka VLP L1:P18I10 i L1:T20. (A) Schematyczny schemat procesu oczyszczania L1:P18I10 i L1:T20 VLP metodą chromatografii. (B, C) Analiza Western blot próbek L1:P18I10 i L1:T20 VLP z każdego etapu oczyszczania. Sygnał L1 na każdym etapie oczyszczania scharakteryzowano za pomocą analizy Western blot sondowanej mAb L1 anty-HPV16. Strzałka wskazuje masę cząsteczkową ~56 kDa białek L1:P18I10 i ~58 kDa białek L1:T20. Ścieżka 1: sklarowany lizat komórkowy (CCL); Ścieżka 2: przepływ (FT) z chromatografii kationowymiennej (CEC) ładowanie próbki; Ścieżka 3: eluat CEC; Ścieżka 4: FT z etapu regeneracji CEC 2M NaCl; Ścieżka 5: chromatografia wykluczania (SEC) FT-1; Pas 6: SEC FT-2; Ścieżka 7: FT z chromatografii powinowactwa do heparyny (H-AC) ładowanie próbki; Ścieżka 8: eluat H-AC; Ścieżka 9: FT z etapu regeneracji H-AC 2M NaCl; Ścieżka 10: 10-krotna diafiltracja.

3.3. Stabilność in vitro i samoorganizacja VLP L1:P18I10 i L1:T20

W celu potwierdzenia, że ​​oczyszczone VLP HPV: HIV wykazywały podobną stabilność in vitro do VLP HPV16 L1, wykonaliśmy nieredukującą SDS-PAGE w celu oceny sieciowania dwusiarczkowego białek kapsydu HPV: HIV (Figura 3A). Wiadomo, że pH, siła jonowa, temperatura [52] i środowisko redoks korelują z wiązaniami dwusiarczkowymi białek kapsydu L1 HPV16 [53]. VLP HPV L1 mają tendencję do samoorganizacji przy niskim pH i wysokiej sile jonowej. Maksymalny demontaż VLP zazwyczaj wymaga wystawienia na działanie środka redukującego o wysokim stężeniu, takiego jak 5% 2-merkaptoetanol (2-ME) przez stosunkowo długi czas [54]. W przypadku braku środków redukujących 2-ME, tylko niewielka część białek HPV-16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 migrowała do monomerów o pozornej masie cząsteczkowej (MW) 55 kDa . Około 70% białek L1 było połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi w większe dimery lub pentamery, o przewidywanej masie cząsteczkowej wynoszącej 110 kDa i 280 kDa (Figura 3A, ścieżki 2, 4 i 6). Natomiast prawie wszystkie białka HPV-16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 w buforze do demontażu wykazywały struktury monomeryczne w nieredukującej SDS-PAGE (Figura 3A, ścieżki 3, 5 i 7). Wyniki te wskazują, że stabilność in vitro oczyszczonych VLP L1:P18I10 i L1:T20 wykazywała podobne wzorce sieciowania dwusiarczkowego jak VLP HPV16 L1 w tym samym pH, sile jonowej i warunkach termicznych. Wydaje się, że oczyszczone VLP ulegają rozkładowi do poziomu pentamerów, trimerów i dimerów po długotrwałej ekspozycji na wysokie stężenia środków redukujących. Dane te są zgodne z wcześniejszymi badaniami. [53,54] Jednakże rozkład HPV: VLP HIV nadal był daleki od zakończenia (monomery).

Figura 3. Stabilność in vitro VLP L1:P18I10 i L1:T20. (A) Sieciowanie dwusiarczkowe VLP L1:P18I10 i L1:T20 w nieredukującej SDS-PAGE. VLP HPV16 L1, oczyszczone L1:P18I10 i L1:T20 VLP zmieszano z buforem do próbek Laemmli, odpowiednio, w nieobecności lub w obecności 2-merkaptoetanolu (2-ME) i analizowano metodą nieredukującą STRONA SDS. Pozycję monomeru L1 (55 kDa), dimeru L1 (110 kDa) i pentameru L1 (280 kDa) wskazano strzałką. Ścieżka 1: marker masy cząsteczkowej białka; Ścieżka 2: HPV16 L1 VLP; Ścieżka 3: HPV16 L1 VLP traktowane 2-ME; Ścieżka 4: L1:P18I10 VLP; Ścieżka 5: L1:P18I10 VLP traktowane 2-ME; Ścieżka 6: L1:T20 VLP; Ścieżka 7: L1:T20 VLP traktowane 2-ME. (B) Analiza masy cząsteczkowej VLP L1:P18I10 i L1:T20. Złożone VLP nietraktowane 2-ME (ścieżki 2, 4 i 6) odfiltrowano przez urządzenia do diafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) 1000 kDa (górny panel). Zdemontowane VLP poddane działaniu 2-ME (ścieżki 3, 5 i 7) odfiltrowano przez urządzenia filtrujące odśrodkowe o mocy 100 kDa MWCO (dolny panel). Retentaty (R) zbierano ze zbiorników próbek urządzenia filtrującego, natomiast filtraty (F) zbierano na dnie probówek wirówkowych. Sygnał białka L1 wykryto za pomocą analizy punktowej sondowanej mAb L1 anty-HPV16.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) i zakonserwowano w retentatach. Wzór był zbieżny z danymi zaobserwowanymi w nieredukującej SDS-PAGE. Chociaż wszystkie grupy VLP traktowane 2-ME pokazano w prążku monomerycznym (~55 kDa) w nieredukującej SDS-PAGE (Figura 3A, ścieżki 3, 5 i 7). Jednakże odpowiednie zredukowane VLP nie zostały odfiltrowane przez membrany ultrafiltracyjne 100 kDa (Figura 3B, dolny panel). Wyniki te sugerują, że chimeryczne białka HPV:HIV były zdolne do samoorganizacji w większe cząstki, ale maksymalny rozkład VLP na monomery wymagał nie tylko redukcji wiązań dwusiarczkowych, ale także innych czynników denaturujących, takich jak pH lub siła jonowa.

3.4. Charakterystyka morfologiczna VLP L1:P18I10 i L1:T20

Do zbadania konformacji morfologicznej HPV16 L1 i HPV:HIV VLP zastosowano transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Peptydy HIV-1 P18I10 i T20 wstawiono odpowiednio do pętli DE białka L1 HPV16. Te komercyjne białka HPV16 L1 i chimeryczne białka kapsydu HPV: HIV mogą samorzutnie składać się in vitro w integralne cząsteczki VLP o średnicy około 50–60 nm (ryc. 4A – C, prawy panel). W porównaniu z mikrografami elektronowymi VLP HPV16 L1 opublikowanymi w poprzednich badaniach [55,56], ikosaedryczna struktura VLP HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 była tutaj mniej kontrastowa i niejasna. Można to przypisać odczynnikowi do barwienia negatywnego, którego użyliśmy w tym badaniu. W naszym niedawnym badaniu opublikowanym w poprzednim badaniu [37] i innym będącym w toku artykule będącym w trakcie recenzowania (dane nie pokazane), uzyskaliśmy dobrą jakość i rozdzielczość mikrofotografii elektronowych, gdy VLP L1:P18I10 pochodzące z drożdży i bakulowirusów (te same chimeryczne konstrukt) zrównoważono w PBS i wybarwiono ujemnie kwasem fosforowolframowym (PTA). Ponieważ w tym badaniu zastosowaliśmy różne systemy produkcji i oczyszczania VLP, pochodzące z komórek ssaczych VLP L1:P18I10 i L1:T20 zrównoważono Tris-HCl i wybarwiono negatywnie octanem uranylu. Chociaż mikroskopy elektronowe można by ulepszyć, nadal mogliśmy zaobserwować wyraźny wzór, zgodnie z którym większość białek kapsydu HPV16 L1, L1: P18I10 i L1: T20 może samoorganizować się w morfologiczne VLP pod ekranem TEM (Rysunek 4A – C, lewy panel ). Zasadniczo VLP HPV są chronione przed agregacją w warunkach wysokiej zawartości soli [57]. Część wykrywalnej agregacji HPV16 L1 i HPV: VLP HIV w buforze Tris-HCl o niskiej zawartości soli można zobaczyć pod mniejszym powiększeniem (Rysunek 4A – C, lewy panel). Na podstawie tych wyników doszliśmy do wniosku, że modyfikacja częściowej sekwencji pętli L1 DE przez insercję peptydów HIV-1 P18I10 lub T20 nie wpływa znacząco na morfologię HPV: VLP HIV.

Rysunek 4. Mikrografy elektronowe VLP L1:P18I10 i L1:T20. (A) Morfologia VLP HPV16. (B) Morfologia VLP L1:P18I10. (C) Morfologia VLP L1:T20. Oczyszczone VLP absorbowano na naładowanych promieniowaniem UV siatkach miedzianych pokrytych węglem i barwiono ujemnie 2% octanem uranylu. Obrazy uzyskano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym. Słupek przedstawia odpowiednio 200 nm przy powiększeniu 59,000 (lewy panel) i 100 nm przy powiększeniu 135 K (prawy panel)

3.5. Prezentacja i reaktywność epitopów HPV-16 i HIV-1 

Aby potwierdzić, że sekwencyjne epitopy HIV-1 P18I10 lub 2F5 były obecne w oczyszczonych chromatograficznie VLP L1:P18I10 lub L1:T20, przeprowadzono analizę Western blot i pośredni test ELISA przy użyciu mAb specyficznych dla epitopu. Wybraliśmy dobrze znane przeciwciało monoklonalne (mAb), oznaczone jako CAMVIR-1, do rozpoznawania wysoce konserwatywnego epitopu (GFGAMDF, aa 230–236) białka L1 HPV16 [39,58]. Wybrano wcześniej opublikowane mAb skierowane przeciwko epitopowi pętli HIV-1 gp120 V3 (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) do wykrywania kolejnych epitopów P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Z drugiej strony, do charakteryzacji peptydu T20 wybrano szerokie przeciwciało neutralizujące (bnAb) rozpoznające epitop HIV-1 gp41 2F5 (ELDKWA) przeciwko szerokiej gamie laboratoryjnych szczepów HIV-1 [ 60,61]. Test Western blot sondowany mAb HPV16 L1 wykazał prążki 55, 56 i 58 kDa odpowiadające odpowiednio białku HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 (Figura 5A, B, po lewej). Masa cząsteczkowa (MW) białka L1:P18I10 była podobna do białka L1 HPV16 (ryc. 5A, po lewej). Zaobserwowano, że prążek odpowiadający białku L1:T20 jest nieco wyższy niż białku L1 HPV16, jak przewidywano na podstawie dodatkowej sekwencji aminokwasów (Figura 5B, po lewej). Prążki o masie około 56 i 58 kDa, odpowiadające białku L1:P18I10 i L1:T20, wykryto w teście Western blot sondowanym odpowiednio mAb anty-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 (Rysunek 5A, B, po prawej ). Uznaliśmy, że masa cząsteczkowa (MW) białka L1:T20 barwionego anty-2F5- jest prawidłowa i mieści się w oczekiwanym zakresie 58 kDa (Rysunek 5B, po prawej). Jednakże masa cząsteczkowa białka L1:P18I10 wybarwionego anty-HIV-1 gp120 V3- jest nieco niższa (ryc. 5A, po prawej). Można to przypisać heterogenicznej strukturze chimerycznych białek L1:P18I10. Ponieważ konformacja sekwencyjnego epitopu może zostać utracona w warunkach denaturujących w SDS-PAGE. Dlatego przeprowadziliśmy dalej pośredni test ELISA, aby wykazać, że konformacyjny peptyd P18I10 jest prawidłowo prezentowany na naszych chimerycznych VLP L1:P18I10 (Figura 5E). Z drugiej strony, przeciwciało przeciwko pętli V3 wirusa HIV-1, którego użyliśmy, rozpoznawało całą pętlę HIV-1 V3, a nie epitop P18I10. W rezultacie ogólny sygnał anty-V3 był niższy (ryc. 5A, B, prawe panele). Mimo to wyniki te wskazują, że sekwencyjne peptydy HIV-1 P18I10 i T20 są obecne w HPV: VLP HIV.

Rycina 5. Prezentacja epitopów HPV-16 i HIV-1. (A, B) Sekwencyjne wykrywanie epitopów chimerycznych VLP L1:P18I10 i L1:T20. Oczyszczone VLP L1:P18I10 i L1:T20 analizowano metodą Western blot, stosując mAb anty-HPV16 L1, anty-HIV-1 gp120 V3 i 2F5. Jako kontrolę zastosowano VLP HPV16 L1. Masę cząsteczkową białek L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) i L1:T20 (58 kDa) wskazano strzałką. Ścieżka 1: marker masy cząsteczkowej białka; Ścieżka 2: białko L1 HPV16; Ścieżka 3: białko L1:P18I10; Ścieżka 4: Białko L1:T20. (C, D) Wiązanie mAb HPV16 L1 z chimerowymi VLP L1:P18I10 i L1:T20. (E) Wiązanie mAb anty-HIV-1 gp120 V3 z chimerowymi VLP L1:P18I10. (F) Wiązanie mAb-1 2F5 HIV z chimerowymi VLP L1:T20. Wykres liniowy pośrednich testów ELISA wykonano w celu wykrycia epitopów konformacyjnych rekombinowanych VLP HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 związanych odpowiednio z mAb anty-L1, anty-HIV-1 gp120 V3 lub 2F5. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. Przeprowadzono prosty test regresji liniowej w celu porównania różnicy linii oczyszczonych VLP L1:P18I10 i L1:T20 z krzywą standardową dostępnych na rynku VLP L1; ns: nieistotne; ** p < 0,01.

Ponadto, aby określić, czy epitopy konformacyjne HIV{{{50}}}} prezentowane na HPV: VLP HIV można zidentyfikować in vitro za pomocą przeciwciał neutralizujących gp120 V3 i 2F5, przeprowadziliśmy pośredni test ELISA, aby sprawdzić specyficzność i reaktywność wiązania epitopu. Jak pokazano na Figurze 5C, D, VLP HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 rozpoznawano przez mAb anty-L1. Przeprowadziliśmy analizę regresji liniowej, aby porównać nachylenie każdej linii rozcieńczenia. Wyniki ujawniły, że specyficzność wiązania epitopu L1 przez VLP L1:P18I10 lub L1:T20 nie różniła się od VLP L1 HPV16. Co więcej, mAb gp120 V3 anty-HIV-1 było zdolne do wiązania VLP L1:P18I10, ale nie VLP L1 HPV16 (Figura 5E). Ponadto mAb 2F5 może rozpoznawać VLP L1:T20, ale nie VLP L1 HPV16 (Figura 5F). Po analizie regresji liniowej różnica w specyficzności wiązania epitopu gp120 V3 pomiędzy L1:P18I10 i HPV16 L1 była niezwykle znacząca (p < 0,01%). Swoistość wiązania epitopu 2F5 przez VLP L1:T20 była istotnie różna od VLP L1 HPV16 (p < 0,01%). Ten wzór ujawnił, że hydrofobowe lipidy komórkowe nie były konieczne do wiązania przeciwciał neutralizujących 2F5- przeciwko HPV: VLP HIV in vitro. Chociaż reaktywność przeciwciał neutralizujących anty-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 na HPV: VLP HIV jest stosunkowo łagodna, wiązanie mAb anty-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 z HPV: VLP HIV było znacząco specyficzne dla epitopu.

3.6. Immunogenność VLP L1:P18I10 i L1:T20 po immunizacji myszy BALB/c

Oceniliśmy odpowiedź immunologiczną specyficzną dla HPV16- i HIV-1-po immunizacji myszy BALB/c VLP L1:P18I10 i L1:T20. Harmonogram immunizacji przedstawiono na Figurze 6A. Ponieważ immunogenność indukowana przez VLP po podaniu na błonę śluzową była generalnie słabsza niż po podaniu ogólnoustrojowym, myszy immunizowano domięśniowo jedną szóstą dawki szczepionki Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. Adiuwant w postaci hydroksyfosforanu glinu dla dawki (10 µg/100 µl) chimerycznych wirusów HPV: HIV VLP doprowadzono do tego samego stężenia (1 mg/1 ml) co Gardasil-9. Aby ocenić różnicę między płciami w wynikach szczepienia, oceniono porównanie odpowiedzi przeciwciał pomiędzy samcami (n=4) i samicami (n=4). W grupie L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP i Gardasil-9, odpowiedź przeciwciał anty-HPV16 L1 u samic myszy była średnio wyższa niż u samców myszy (Rysunek 6B). U 2 z 4 (50%) samic myszy immunizowanych L1:P18I10 VLP, 3 z 4 (75%) samic immunizowanych L1:T20 VLP i u wszystkich (100%) samic myszy immunizowanych Gardasilem zaobserwowano wyższe miano przeciwciał anty-L1 niż samce myszy. Odpowiedzi anty-L1 wywołane przez samice myszy w grupie Gardasil-9 były znacząco wyższe niż u samców myszy (p=0.0041) (Rysunek 6B). Bardzo niski poziom odpowiedzi przeciwciał anty-L1 wykryto w grupie szczepionki pierwotnej BCG.HIVA i dawki przypominającej L1:P18I10 VLP. Ten wzór odpowiada wcześniejszym odkryciom opisującym, że BCG indukuje głównie odpowiedź limfocytów T, a nie wytwarzanie IgG [63].

Rycina 6. Indukcja humoralnych odpowiedzi immunologicznych przez VLP L1:P18I10 i L1:T20 u myszy BALB/c. Harmonogram immunizacji przedstawiono w (A). We wszystkich grupach myszy rozkład płci był równy (mężczyźni n=4 i samice n=4). Grupy A i B: homologiczna immunizacja pierwotna-przypominająca 10 µg L1:P18I10 lub L1:T20 VLP domięśniowo (im); Grupa C: gruntowanie 106 cfu rBCG.HIVA śródskórnie (id) i wzmocnienie 10 µg L1:P18I10 VLP im; Grupa D: homologiczna szczepionka pierwotna przypominająca szczepionką Gardasil-9 zawierającą 10 µg VLP HPV16 L1 domięśniowo; Grupa E: dwukrotna immunizacja buforem PBS. Odstęp pomiędzy dawkami pierwotnymi i przypominającymi wynosił 2 tygodnie. Punkt końcowy tego badania przypadał na 28 dzień. Pobrano surowice i rozcieńczono je w mianie 1:50 do testu ELISA. (B) IgG specyficzne dla HPV L1-u samców i samic myszy. (C – E) IgG specyficzne dla epitopu indukowane przez VLP L1:P18I10 i L1:T20. Przeprowadzono test ELISA w celu analizy IgG anty-L1, anty-P18I10 i anty-T20 indukowanych przez myszy BALB/c po różnych kombinacjach szczepienia pierwotnego i przypominającego, jak opisano powyżej. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. W celu porównania różnic pomiędzy grupami przeprowadzono jednokierunkowy test ANOVA (nieparametryczny). OD: gęstość optyczna. Ns nieistotne; ** p < 0,01

Oceniliśmy, czy myszy immunizowane VLP L1: P18110 i L1: T20 mogą indukować przeciwciała specyficzne dla HPV-16 L1-i epitopu-1 HIV u myszy BALB/c. Indukowane przez VLP przeciwciała IgG w mysich surowicach mierzono metodą ELISA pokrytą odpowiednio rekombinowanym białkiem L1 HPV16, peptydami P18I10 lub T20. W grupie otrzymującej Gardasil-9 wykryto statystyczną różnicę w stężeniu IgG swoistej dla L1- przy mianie surowicy 1:50 w porównaniu z grupą kontrolną PBS (p=0.0039). Odpowiedzi anty-L1 u myszy immunizowanych VLP Gardasil-9, L1:P18I10 i L1:T20 były podobne i nie różniły się znacząco (Figura 6C). Myszy zaszczepione BCG.HIVA2auxo.int i wzmocnione L1:P18I10 VLP wywołały bardzo niski poziom IgG anty-L1. Wyniki te sugerują, że myszy immunizowane wirusem HPV: HIV VLP wytwarzały ten sam poziom IgG anty-L1, co myszy immunizowane szczepionką Gardasil (Figura 6C). Chociaż wydaje się, że liczba grup VLP L1:P18I10 wykazuje tendencję do wyższego poziomu IgG specyficznego dla epitopu P18I10 niż inne grupy immunizowane, różnice te nie były istotne statystycznie (Figura 6D). U niektórych myszy immunizowanych L1:P18I10 VLP (4 z 8, 50%) zaobserwowano wyższe przeciwciała wiążące anty-P18I10 w porównaniu z myszami immunizowanymi Gardasilem. Alternatywnie, analiza testu T wykazała, że ​​różnica pomiędzy grupą L1:P18I10 VLP a grupą Gardasil-9 była istotna (p=0.005) (danych nie przedstawiono). W grupie L1:T20 VLP wykryto znacząco wyższą odpowiedź przeciwciał przeciwko peptydowi T20 w porównaniu z grupą Gardasil-9 (p=0.0083). Zgodnie z oczekiwaniami miana przeciwciał anty-T20 były niewykrywalne w grupach szczepionych szczepionką Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP i BCG.HIVA w połączeniu z grupami przypominającymi L1:P18I10 VLP (Rysunek 6E). Miano przeciwciała specyficznego dla peptydu T20 było stosunkowo niskie. Jest to prawdopodobnie spowodowane: (1) T20 jest peptydem subdominującym; (2) wywołanie przeciwciał neutralizujących MPER lub 2F5 wymaga koniugatów peptyd-lipid (Figura 6E). Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki wykazały, że VLP L1:P18I10 i L1:T20 mogą indukować u myszy odpowiedź przeciwciał specyficznych dla HPV16-, ale słabą wobec wirusa HIV.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Aby ocenić odpowiedź immunologiczną komórek T specyficznych dla HPV i HIV u myszy, postępowaliśmy zgodnie z harmonogramem immunizacji pokazanym na Figurze 7A. Ponadto porównano heterologiczne szczepienie pierwotne BCG.HIVA2auxo.int i wzmacnianie L1:P18I10 VLP z homologiczną immunizacją L1:P18I10 VLP pierwotną i przypominającą w celu oceny częstotliwości odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla HPV16 i HIV-1 komórek T. Nie było różnic pomiędzy grupami Gardasil-9 i PBS pod względem wydzielania IFN po stymulacji splenocytów VLP HPV16 L1. Różnice w wydzielaniu IFN-specyficznego dla L1- również nie były istotne pomiędzy grupami L1:P18I10 VLP i Gardasil-9. Wywnioskowaliśmy, że słabe wydzielanie IFN-specyficzne dla L1-można przypisać niskiemu stężeniu (2 µg/ml) VLP L1 HPV16 stosowanych jako bodźce. Grupa szczepionki BCG.HIVA2auxo.int i dawki przypominającej L1:P18I10 VLP indukowała wyższą częstotliwość splenocytów wydzielających IFN i zaobserwowano istotne różnice w wydzielaniu IFN w porównaniu z myszami zaszczepionymi grupą Gardasil-9 (p {{36 }}.0103). 3 z 8 myszy (~38%) wywołały najwyższe odpowiedzi IFN specyficzne dla L1- (Figura 7B). Według naszych wcześniejszych badań można to przypisać niespecyficznej adiuwantowości BCG [64–66]. Wyraźny efekt szczepienia pierwotnego, nawet w przypadku BCG typu dzikiego, jest zgodny ze zdolnością pochodnych rBCG do działania jako silne adiuwanty w kolejnych szczepionkach przypominających [64,65]. Jeśli chodzi o odpowiedź limfocytów T specyficzną dla wirusa HIV, największą całkowitą wielkość komórek tworzących plamki IFN (SFC)/106 splenocytów zaobserwowano u myszy zaszczepionych szczepionką BCG.HIVA2auxo.int w porównaniu z myszami otrzymującymi Gardasil.{{54} } szczepionki lub VLP L1:P18I10. Myszy zaszczepione BCG.HIVA i wzmocnione L1:P18I10 VLP wywołały znacząco wyższe wydzielanie IFN w porównaniu z myszami zaszczepionymi homologiczną szczepionką przypominającą L1:P18I10 VLP (p=0.0268). Ponadto zaobserwowano znacznie wyższe wydzielanie IFN- u myszy zaszczepionych VLP L1:P18I10 w porównaniu z myszami otrzymującymi szczepionki Gardasil-9 (p=0.0157) (Figura 7C). Zgodnie z oczekiwaniami wydzielanie IFN- było niewykrywalne w grupach Gardasil-9 i PBS. Wyniki te wykazały, że (1) VLP L1:P18I10 wywoływały odpowiedź immunologiczną limfocytów T specyficzną dla HIV-1-; (2) VLP L1:P18I10 wywoływały odpowiedzi immunologiczne komórek T specyficzne dla HPV i (3) BCG.HIVA2auxo.int mogą wzmacniać odpowiedzi immunologiczne komórek T specyficzne dla HIV-1-wywołane przez VLP L1:P18I10.

Rycina 7. Indukcja odpowiedzi komórek T specyficznych dla HPV16 i HIV-1 przez chimeryczne VLP L1:P8I10 i BCG.HIVA u myszy BALB/c. Harmonogram szczepień przedstawiono w (A). We wszystkich grupach myszy rozkład płci był równy (mężczyzna n=4 i samica n=4). Grupa A: homologiczna immunizacja pierwotna przypominająca 10 µg L1:P18I10 VLP domięśniowo (im); Grupa B: gruntowanie 106 cfu rBCG.HIVA śródskórnie (id) i wzmocnienie 10 µg L1:P18I10 VLP im; Grupa C: homologiczna szczepionka pierwotna przypominająca szczepionką Gardasil-9 zawierającą 10 µg VLP HPV16 L1 domięśniowo; Grupa D: dwukrotna immunizacja buforem PBS. Odstęp pomiędzy dawkami pierwotnymi i przypominającymi wynosił 2 tygodnie. Punkt końcowy tego badania przypadał na 28. dzień. Wyizolowano splenocyty do testu IFN-ELISpot. Odpowiedzi immunologiczne komórek T na HPV16 i HIV-1 oceniano ex vivo metodą IFN-ELISpot po stymulacji splenocytów VLP L1 HPV16 i peptydem P18I10. (B, C) Odpowiedzi komórek T specyficzne dla HPV16 L1- i HIV-1 P8I10-wywołane przez VLP L1:P8I10 i dawkę pierwotną BCG.HIVA w połączeniu ze wzmocnieniem L1:P18I10 VLP. Dane przedstawiono jako medianę ± SD. W celu porównania różnic pomiędzy grupami przeprowadzono jednoczynnikowy test ANOVA. Ns nieistotne; * p < 0,05.

4. Disrozmowa

Zarówno HPV16, jak i HIV-1 są chorobami przenoszonymi drogą płciową i stanowią obecnie przedmiot wielu badań nad szczepionkami. Chociaż szczepionki profilaktyczne przeciwko HPV zostały wprowadzone na rynek, a przenoszenie wirusa HIV-1 zostało w znacznym stopniu kontrolowane za pomocą leczenia przeciwretrowirusowego (ART) i PrEP, pilną potrzebą jest skuteczna, bezpieczna i niedroga chimeryczna szczepionka HPV: HIV przeciwko obu wirusom. W tym badaniu (1) wykazaliśmy, że system ekspresyjny 293F i metoda oczyszczania chromatograficznego mogą stanowić wykonalne podejścia do wytwarzania i oczyszczania chimerycznych VLP L1:P18I10 i L1:T20; (2) potwierdziliśmy, że insercja peptydów P18I10 lub T20 do pętli DE białek kapsydu HPV16 L1 nie wpływa na stabilność in vitro, samoorganizację i morfologię chimerycznych HPV: VLP HIV; (3) Sekwencyjne i konformacyjne peptydy P18I10 lub T20 wystawione na działanie pętli DE chimerycznego HPV: VLP HIV można wykryć za pomocą przeciwciał neutralizujących anty-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 in vitro; (4) Chimeryczne VLP L1:P18I10 i L1:T20 mogą wywoływać HPV, ale słabe przeciwciała wiążące się specyficznie-1-HIV u myszy BALB/c. Ponadto insercja peptydów HIV-1 P18I10 lub T20 do białka L1 HPV16 nie wpływała na indukcję przeciwciał swoistych dla L1-HPV16 in vivo; (5) VLP L1:P18I10 mogą indukować odpowiedź komórek T specyficzną zarówno dla HPV16, jak i HIV; (6) Dawka pierwotna BCG.HIVA i dawka przypominająca L1:P18I10 VLP wywołały największą wielkość splenocytów wytwarzających IFN w porównaniu z homologiczną szczepionką przypominającą L1:P18I10 VLP u myszy BALB/c. Odkrycia te potwierdziły dalszy rozwój szczepionek przeciwko HIV-1 opartych na rBCG i chimerycznych wirusach HPV: VLP HIV. Podsumowując, badanie to zapewnia podstawową strategię, która może być warta wsparcia światowych wysiłków na rzecz opracowania nowych chimerycznych szczepionek na bazie VLP do kontrolowania infekcji HPV i HIV.

W tym badaniu VLP L1:P18I10 i L1:T20 mogły indukować ten sam poziom przeciwciał wiążących anty-HPV16 L1 co szczepionka HPV Gardasil-9. Jednakże VLP L1:P18I10 i L1:T20 wywołują jedynie niskie poziomy odpowiedzi przeciwciał wiążących HIV swoistych dla epitopu P18I10 i T20. Postawiliśmy hipotezę, że może to wynikać z pokrycia płytek testowych ELISA odpowiednio rekombinowanym białkiem L1 HPV16, peptydem HIV-1 P18I10 i peptydem HIV-1 T20. Mysie przeciwciała anty-L1 indukowane przez nasze VLP L1:P18I10 i L1:T20 mogą być ukierunkowane na wiele epitopów wiążących białko L1. Natomiast mysie przeciwciała anty-HIV-1 wywołane przez nasze VLP L1:P18I10 i L1:T20 celują tylko w pojedynczy peptyd HIV (P18I10 lub T20) na HPV: VLP HIV. W rezultacie całkowite maksymalne wartości OD450 przeciwciał wiążących anty-HIV-1 były znacznie niższe niż przeciwciała anty-HPV16 L1.

Powód, dla którego wybraliśmy pętlę DE białka kapsydu HPV16 L1 jako wstępny region insercji immunogenu HIV-1, odnosił się do poprzedniego badania, w którym immunizowano myszy bydlęcym wirusem brodawczaka (BPV): VLP HIV do indukowania odpowiedzi przeciwciał [20]. Wiadomo, że epitopy zlokalizowane w eksponowanych na powierzchni pętlach DE i FG głównych białek kapsydu HPV L1 dominują w wytwarzaniu indukowanych szczepionką przeciwciał neutralizujących krzyżowo [67]. Co więcej, poprzednie badania wykazały, że wprowadzenie HIV-1 MPER do pętli BPV L1 DE może indukować częściowo neutralizujące przeciwciała, które specyficznie rozpoznają natywną konformację MPER w HIV-1 Env [20]. Jednakże żadne dane nie wykazały, czy rekombinowany BPV L1:MPER VLP wpływa na immunogenność i neutralizację przeciwko BPV po insercji HIV-1 MPER do białka L1 BPV. W naszym badaniu z użyciem cząsteczek VLP HPV16 L1 jako wektora dostarczającego antygen HIV zaobserwowaliśmy, że insercja peptydu HIV-1 nie zmodyfikowała struktury HPV L1 i że chimeryczne białka HPV:HIV nadal mają zdolność do tworzenia VLP. Ponadto wdrożyliśmy koncepcję mostkowania immunologicznego, aby wykazać porównywalne odpowiedzi immunologiczne między HPV: kandydatem na VLP HIV (nasz) a zatwierdzoną szczepionką przeciwko HPV opartą na VLP (licencjonowana Gardasil-9). Nasze dane wykazały, że insercja peptydu HIV-1 P18I10 lub T20 do chimerycznych wirusów HPV: HIV VLP może wywołać podobne miano przeciwciał wiążących specyficznie L1-HPV16 w porównaniu ze szczepionką HPV Gardasil-9 szczepionka. Swoiste dla typu przeciwciał wiążących anty-HPV16 L1 zaobserwowane w przypadku licencjonowanej szczepionki HPV Gardasil-9 VLP w porównaniu z chimerowymi wersjami szczepionki HPV Gardasil-9 VLP były zgodne z naszymi danymi.

Długość i miejsce optymalnego obcego antygenu HIV-1 włączonego do cząstek VLP HPV16 L1 oraz stabilność in vitro powstałych chimerycznych cząstek VLP HPV:HIV powinny zostać zweryfikowane przed immunizacją myszy. Nasze obecne badanie wykazało, że insercja peptydów P18I10 lub T20 do białka L1 HPV16 nie wpływa na stabilność in vitro, samoorganizację i morfologię chimerycznych VLP HPV: HIV. Wyniki te były zgodne z wcześniejszymi badaniami wskazującymi, że insercja domeny MPER HIV-1 do sekwencji pętli DE BPV L1 nie wpływa na zdolność białka kapsydu L1 BPV do samoorganizacji do VLP [20]. Zasadniczo epitopy zlokalizowane w eksponowanych na powierzchni pętlach DE i FG białek kapsydu HPV L1 w dominujący sposób przyczyniają się do indukowania L1-specyficznych przeciwciał krzyżowych neutralizujących [67]. Tutaj wykazaliśmy, że insercja peptydów HIV-1 P18I10 lub T20 do pętli HPV16 L1 DE nie wpływa na indukcję przeciwciał L1-specyficznych przez chimeryczne HPV: VLP HIV po immunizacji myszy. Dodatkowo, epitopy HIV-1 P18I10 lub T20 na pętlach DE HPV16 chimerowych HPV:VLP wykryto in vitro i były immunogenne in vivo. VLP HPV16 L1 stanowią potencjalne rusztowanie do prezentacji powierzchniowej epitopu HIV-1 będącego przedmiotem zainteresowania. W tym badaniu przeprowadziliśmy pośredni test ELISA, aby zademonstrować konformacyjne peptydy P18I10 i T20 prezentowane na powierzchni naszych chimerycznych cząstek VLP HPV: HIV. W przyszłości mikroskopia immunoelektronowa może być również dodatkowym podejściem do wykazania lokalizacji strukturalnej i organizacji antygenu P18I10 lub T20 w obrębie HPV: VLP HIV.

Samoorganizacja jest reprezentatywnym wskaźnikiem stabilności in vitro VLP HPV16 L1. Wiadomo, że pH, siła jonowa, temperatura [52] i środowisko redoks korelują z wiązaniami dwusiarczkowymi białek kapsydu L1 HPV16 [53]. Wcześniejsze prace nad VLP wirusa brodawczaka sugerowały znaczenie wiązań dwusiarczkowych dla samoorganizacji głównego kapsydu L1 [68,69]. Tworzenie się dwusiarczków wskazywało na wyższą cysteinę białka kapsydu L1 w odpowiedniej geometrii [53]. Te wiązania dwusiarczkowe łączą reszty 175 i 428 (dla HPV16), które stabilizują wiriony HPV i VLP [70]. W tym badaniu przeanalizowaliśmy wzorce międzycząsteczkowego sieciowania dwusiarczkowego jako pośredni dowód potwierdzający, że nasze białka kapsydu L1:P18I10 i L1:T20 mają tendencję do samoorganizacji in vitro. Na Figurze 3A wykazaliśmy, że oczyszczone VLP L1:P18I10 i L1:T20 wykazywały podobne wzorce międzycząsteczkowego sieciowania disiarczkiem jak VLP HPV16 L1 w tym samym pH, sile jonowej i warunkach termicznych. Na Figurze 3B wykazaliśmy ponadto, że oczyszczone białka L1:P18I10 i L1:T20 były zdolne do samoorganizacji w większe cząstki (większe niż pentamer L1 o masie cząsteczkowej 280 kDa) in vitro. Dlatego też, wraz z morfologicznym wzorem samoorganizacji VLP (chociaż struktura ikozaedryczna nie była całkiem dobra) obserwowanym na Figurze 4, doszliśmy do wniosku, że nasze oczyszczone chimeryczne VLP HPV: HIV są stabilne in vitro. Oprócz stabilności VLP, należy wziąć pod uwagę wiele innych krytycznych czynników, które mogą mieć wpływ na immunogenność chimerycznego HPV: należy wziąć pod uwagę VLP HIV, takie jak miejsce wstawienia immunogenu pomiędzy różnymi pętlami VLP [71], dawka, odstępy czasu pomiędzy szczepieniem podstawowym a szczepieniem przypominającym i droga podawania [22] itp.

Peptydy P18I10 pochodzące z pętli HIV-1 gp120 V3 są prezentowane w komórkach zakażonych wirusem HIV przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC-I) klasy I [26]. CD8+, cytotoksyczne limfocyty T (CTL), mogą rozpoznawać antygeny P18I10 ograniczone do MHC-I i wydzielać różne cytokiny, takie jak IFN-, w celu wyeliminowania komórek zakażonych wirusem HIV [72–75]. Rekombinowany wirusowy lub plazmidowy DNA jest dobrym nośnikiem szczepionki umożliwiającym ekspresję peptydów P18I10 w komórkach gospodarza i indukowanie odpowiedzi komórkowej specyficznej dla P18I10-za pośrednictwem szlaku MHC-I [76–79]. Na przykład łączony schemat pierwotnego DNA i zmodyfikowanej dawki przypominającej wirusa krowianki Ankara (MVA) był wystarczający do indukcji odpowiedzi IFN i CTL przeciwko epitopowi P18I10 [79]. Wręcz przeciwnie, egzogenne peptydy P18I10 nie są skutecznie prezentowane limfocytom T CD8+ na szlaku MHC-I [80,81] i wymagają udziału odpowiednich adiuwantów [82–85] lub nośników antygenów, takich jak VLP. Na przykład immunogenność syntetycznych peptydów P18I10 uzupełnionych adiuwantami była marginalna ze względu na brak determinantów pomocniczych T [82–85]. Donoszono wcześniej, że VLP HIV-1 Gag [86], VLP antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) [87], VLP parwowirusa VP2 [88] i VLP L1 wirusa brodawczaka [17–19] mogłyby działać jako wektory dostarczające dla prezentacji epitopów CTL ograniczonych do MHC-I in vivo. Chociaż mechanizm indukowanych przez VLP odpowiedzi komórek T ograniczonych do MHC-I jest nadal niejasny, cząsteczkowa struktura VLP może korzystnie wpływać na wychwyt endocytarny makrofagów lub komórek dendrytycznych, uzyskując w ten sposób dostęp do cytozolu, a następnie wchodząc do typowego szlaku MHC-I [89, 90]. Ponadto zaobserwowano, że determinanta P18I10 ograniczona do MHC-I indukuje odpowiedzi pomocniczych komórek T CD4+ poprzez szlak MHC-II [91,92]. Hybrydowe VLP BPV1 L1 można stosować jako antygenowe nośniki epitopów w celu wywołania terapeutycznych, specyficznych dla wirusa odpowiedzi CTL poprzez szlaki MHC-I i MHC-II [17,19], zapewniając obiecującą strategię projektowania szczepionki w celu kontrolowania infekcji wirusowej. Niektóre wczesne badania wykazały również, że VLP L1 BPV wyrażają epitop E7 HPV16 lub epitop P18I10 na powierzchniach błony śluzowej indukowanych pętlą HIV-1 gp120 V3, a także ogólnoustrojową, specyficzną dla epitopu VLP odporność humoralną i limfocytów T [18]. Zgodnie z poprzednimi badaniami wstępnie wykazaliśmy, że nasze chimeryczne VLP HPV: HIV (L1: P18I10) mogą indukować odpowiedzi immunologiczne komórek T specyficzne dla HIV u myszy BALB/c po stymulacji splenocytów peptydem P18I10. Ponadto szczepienie pierwotne BCG.HIVA wzmocniło odpowiedź immunologiczną limfocytów T specyficzną dla wirusa HIV u myszy. Jednakże wielofunkcyjne odpowiedzi immunologiczne komórek T indukowane przez VLP L1:P18I10 będą wymagały dalszych badań immunologicznych.

Szersza odpowiedź limfocytów T CD8+ na wiele konserwatywnych epitopów CTL jest korzystna w przezwyciężaniu różnorodności genetycznej wirusa HIV-1 i ucieczce z niego [7,93–100]. Racjonalny projekt immunogenów limfocytów T HIV-1, takich jak HIVA, powinien mieć potencjał reagowania na wiele epitopów CTL [34]. Immunogen HIV-1 HIVA, zaprojektowany przez dr Tomasa Hanke, składa się z pełnej długości białka Gag HIV-1 połączonego z wieloma epitopami CTL, w tym epitopami P18I10 na C-końcu [34]. DNA, MVA i rBCG wybrano jako nośniki dostarczające immunogen HIVA i indukowały dużą wielkość i szeroki zakres odpowiedzi komórkowych specyficznych dla epitopu CTL poprzez zastosowanie heterologicznych schematów szczepienia pierwotnego i przypominającego w modelach myszy i naczelnych innych niż człowiek (NHP) [34,101]. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że szczepionka pierwotna BCG.HIVA w połączeniu ze szczepionką przypominającą MVA.HIVA wywołała u myszy BALB/c limfocyty T CD8+specyficzne dla HIV-1-wytwarzające IFN{23}} [31–33,102]. Co ciekawe, VLP mogą być potencjalnym wzmacniaczem zwiększającym odpowiedzi komórkowe specyficzne dla wirusa HIV w heterologicznej immunizacji szczepionkami rBCG [29,30] lub szczepionkami DNA [103,104]. Na przykład rBCG eksprymujący białko Gag HIV-1 mogłoby skutecznie przygotować układ odpornościowy komórek T do wzmocnienia za pomocą VLP Gag w modelach NHP [29,30]. W bieżącym badaniu wykazaliśmy, że szczepienie pierwotne BCG.HIVA może zwiększyć odpowiedź immunologiczną komórek T indukowaną przez VLP HPV: HIV (L1:P18I10). Będziemy dalej badać wielkość wielofunkcyjnych odpowiedzi CD4+, CD8+ i komórek T pamięci generowanych przez ten reżim dawki pierwotnej rBCG i dawki przypominającej VLP.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Obecnie nasza grupa badawcza koncentruje się na opracowaniu obiecujących rBCG: szczepionek przeciw wirusowi HIV wykazujących ekspresję nowych immunogenów z limfocytów T HIV-1, takich jak tHIVconsvX i immunogen z limfocytów T HIVACAT (HTI), w celu poprawy odporności na wirus HIV-1 dopasowanie wariantu i szerokość odpowiedzi komórek T. Immunogeny HIVconsvX drugiej generacji zaprojektowano poprzez przedefiniowanie konserwatywnych regionów grupy M i wykorzystanie biwalentnego projektu mozaiki w celu maksymalizacji dopasowania potencjalnych 9-merycznych epitopów komórek T w szczepionce do wariantów globalnych [64]. Immunogen HTI zaprojektowano tak, aby obejmował docelowe komórki T, przeciwko którym odpowiedzi komórek T obserwuje się głównie u osób zakażonych wirusem HIV-1-z niskim poziomem wirusa HIV-1 [65,66]. Ponieważ udowodniono, że VLP brodawczaka są nośnikami wielu epitopów CTL [17], naszym celem było skonstruowanie chimerycznych VLP L1 HPV16 niosących wiele konserwatywnych epitopów CTL HIV-1 w połączeniu z rBCG eksprymującymi immunogeny komórek T ThivconsvX lub HTI w celu indukcji szerszych Odpowiedzi immunologiczne CTL przeciwko HIV-1. Wysoka gęstość i liczne kopie epitopu CTL HIV-1 prezentowanego na chimerycznych wirusach HPV: VLP HIV mogą poprawiać dostarczanie antygenu do układu odpornościowego i indukować większą częstotliwość odpowiedzi CTL. Natomiast rekombinowany BCG z większym prawdopodobieństwem wygeneruje niższą częstotliwość odpowiedzi CTL ze względu na powolną replikację in vivo. Ponieważ BCG ma wyraźny wpływ na różnicowanie limfocytów T, co oznacza, że ​​BCG może indukować pamięć limfocytów T CD8+ poprzez udział komórek pomocniczych T CD4+ [105], ta właściwość immunogenna może sprawić, że BCG będzie odpowiedni jako środek pierwotny w heterologicznych schematach szczepienia pierwotnego i przypominającego. W związku z tym spodziewaliśmy się, że nasze VLP HPV: HIV mogą okazać się obiecującym wzmacniaczem zwiększającym wielkość i zakres odpowiedzi CTL wirusa HIV-1 podczas szczepienia pierwotnego rekombinowanym BCG eksprymującym nowy immunogen limfocytów T HIV-1 .

Peptyd T20 zawiera wysoce konserwatywny liniowy epitop 2F5 (ELDKWA). Donoszono, że przeciwciało 2F5 pobrane od pacjentów długoterminowo zakażonych wirusem HIV ma szeroką skuteczność neutralizującą [106,107]. Uważa się, że MPER gp41 jest słabo immunogenny, być może ma to związek z jego położeniem blisko komórkowej i wirusowej dwuwarstwy fosfolipidowej [108]. Stosowanie wektorów DNA prezentujących MPER w środowisku lipidowym jest korzystne w indukowaniu nAb specyficznych dla gp [109–111]. Na przykład wykazano, że szczepionki DNA kodujące HIV-1 T20-opracowane przez dr Brittę Wahren indukują międzykladową odpowiedź przeciwciał neutralizujących (nAb) [109]. Z kolei wiele wczesnych prób indukowania nAb ukierunkowanych na gp41 za pomocą strategii szczepionek peptydowych lub podjednostkowych zakończyło się niepowodzeniem [112–116]. Niedawno niektóre badania wykazały, że VLP BPV L1 wyrażające epitop 2F5 lub MPER indukowanych przez HIV-1 gp41 swoistych przeciwciał 2F5-u myszy powodowały neutralizację między kladami [20,21]. Podobny wzór immunogenności stwierdzono w przypadku fuzji antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) z epitopem-1 2F5 wirusa HIV lub MPER [59,117–119]. Tutaj wykazaliśmy, że prezentacja peptydów T20 i P18I10 HIV-1 w naszym chimerycznym VLP HPV16 L1 może indukować odpowiedź przeciwciał przeciwko HIV-1 i HPV16. Epitopy neutralizujące stabilizowane na rusztowaniu konformacyjnym, takie jak funkcjonalne kolce HIV-1 lub VLP, mogą stanowić główny nurt projektowania immunogenów komórek B w celu uzyskania szerokich przeciwciał neutralizujących (bnAbs) [93]. Jednakże większość nowych epitopów bnAb (około 90%) to regiony nieciągłe i ukonstytuowane, połączone w konfiguracje 3-wymiarowe [120]. Chociaż prezentację nieciągłych epitopów na rusztowaniu białkowym można przewidzieć za pomocą modelowania obliczeniowego [121], osadzenie tych epitopów bnAb w rusztowaniu białkowym L1 HPV16 bez otoczki może stanowić wyzwanie. Natomiast mniejszość immunogenów limfocytów B HIV-1, takich jak MPER (2F5) HIV-1 gp41 lub pętla V3 (P18IIB) gp120, zawiera liniowe epitopy neutralizujące i może być odpowiednia do HPV: szkielet białkowy wirusa HIV. Dlatego wybraliśmy liniowy epitop neutralizujący 2F5, który jest zawarty w przedłużonym peptydzie T20 MPER HIV-1 pod względem struktury korzystnej dla tworzenia -helisy [122]. Peptydy T20 można poddać fuzji i stabilizacji na rusztowaniach kapsydu L1 w celu wywołania odpowiedzi przeciwciał neutralizujących, jeśli można przedstawić natywną konfigurację epitopu 2F5. W tym badaniu odkryliśmy, że nAb 2F5 były związane z chimerowymi VLP HPV:HIV (L1:T20) in vitro. Co więcej, VLP L1:T20 mogą także indukować przeciwciała wiążące specyficzne dla T20-u myszy BALB/c. Pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że przeciwciała indukowane peptydem hamującym fuzję HIV-1 (T20) mają podobne właściwości jak peptyd fuzyjny anty-HIV-1 Enfuwirtyd, ponieważ wiążą się z hydrofobową transbłonową resztą T20 zlokalizowaną w MPER gp41 podczas fuzję wirusa HIV-1 i przyczyniają się do kontroli wirusa [109,123,124]. Zgodnie z naszymi poprzednimi przeglądami, racjonalne projektowanie chimerycznych szczepionek na bazie VLP w celu indukowania odpowiedzi przeciwciał neutralizujących i CTL specyficznych dla HPV i HIV zawsze będzie musiało być rozważane pod kątem selekcji immunogenów, wektorów dostarczania antygenu i schematów szczepień przypominających. Podsumowując, badanie to wykazało alternatywną platformę ekspresyjną opartą na komórkach ssaczych i skalowalną metodę oczyszczania chromatograficznego do inżynierii chimerycznych HPV: VLP HIV. Uważamy, że nasze nowe metody oczyszczania pomogą w odzyskiwaniu antygenowego HPV: VLP HIV z komórek ssaków w celu skrócenia czasu, kosztów i pracy, przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności produkcji przemysłowej. Ponadto wykazaliśmy, że VLP HPV16 L1 mogą działać jako platformę dostarczającą do przenoszenia antygenu peptydowego HIV-1, ponieważ insercja peptydów P18I10 lub T20 do pętli DE białek kapsydu HPV16 L1 nie wpływa na stabilność in vitro, samoorganizację i morfologię chimerycznych HPV: VLP HIV i nie nie zakłócają indukcji przeciwciał specyficznych dla HPV16 L1-in vivo. Z drugiej strony, chimeryczne VLP HPV:HIV mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną komórek B i T specyficzną dla HPV16 i HIV przeciwko obu wirusom. W tym raporcie zbadano możliwość opracowania szczepionek-1 przeciwko HIV w oparciu o rekombinowane BCG wykazujące ekspresję immunogenów-1 HIV i HPV:VLPs HIV, które można stosować do szczepień przeciwko HIV-1 u dzieci. Ponieważ opracowanie skutecznej chimerycznej szczepionki przeciwko HPV16 i HIV-1 nadal stanowi wyzwanie, prace te stanowią krok w kierunku opracowania nowej platformy chimerycznej szczepionki opartej na HPV: HIV VLP do zwalczania HPV16 i HIV{{118 }} infekcja, która jest pilnie potrzebna w krajach rozwijających się i uprzemysłowionych.

Bibliografia

1. Globalne statystyki UNAIDS dotyczące HIV i AIDS-2018 Arkusz informacyjny. 2019. Dostępne w internecie: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (dostęp: 15 czerwca 2020).

2. Baeten, JM PrEP w sprawie HIV: stopień A w przypadku dowodów, ale w oczekiwaniu na wpływ. Nat. ks. Urol. 2019, 16, 570–571. [Odniesienie]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paryż, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; i in. Szczepienia ALVAC i AIDSVAX w celu zapobiegania zakażeniu wirusem HIV-1 w Tajlandii. N.angl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [Odniesienie]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Główne przeszkody naukowe w opracowywaniu szczepionki przeciwko wirusowi HIV: perspektywa historyczna i przyszłe kierunki. Przód. Immunol. 2020, 11, 590780. [Odn.Krzyż]

5. Robinson, HL Szczepionki na HIV/AIDS: 2018. Clin. Farmakol. Tam. 2018, 104, 1062–1073. [Odniesienie]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Ogólnie przeciwciała neutralizujące i projekt szczepionki przeciwko zakażeniu wirusem HIV-1. Przód. Med. 2020, 14, 30–42. [Odniesienie]

7. Collins, Dr.; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ Limfocyty T w kontroli, leczeniu i zapobieganiu HIV. Nat. Ks. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Przewodnik po wakcynologii: od podstawowych zasad do nowych osiągnięć. Nat. Ks. Immunol. 2021, 21, 83–100. [Odniesienie]

9. Shapiro, SZ Wnioski dla ogólnych badań wakcynologii z prób opracowania szczepionki przeciwko wirusowi HIV. Szczepionka 2019, 37, 3400–3408. [Odniesienie]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, Szwajcaria; Alshammari, Floryda; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturksstan, MZ; Aladani, IA Częstość występowania podtypów 16 i 18 wirusa brodawczaka ludzkiego wśród jemeńskich pacjentów chorych na raka szyjki macicy. Azja i Pacyfik J. Rak Poprzednia 2017, 18, 1543–1548. [Odniesienie]

11. Olcese, Wirginia; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Charakterystyka domen pętli HPV16 L1 w tworzeniu specyficznego dla typu epitopu konformacyjnego. BMC Mikrobiol. 2004, 4, 29. [Odn. krzyżowe]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Odporność komórkowa indukowana u myszy przez cząsteczki wirusopodobne HPV 16 L1. Mikrob. Patog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller J.; Lowy, D. Wyjaśnienia dużej siły działania szczepionek profilaktycznych przeciwko HPV. Szczepionka 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Szczepionki przeciw wirusowi brodawczaka ludzkiego. J. Zarażać. Dis. 2021, 224, S367 – S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Koncepcje projektowe szczepionek przeciw HIV-1 opartych na cząsteczkach wirusopodobnych. Przód. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Projektowanie chimerycznych szczepionek na bazie cząstek wirusopodobnych przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego i HIV: wyciągnięte wnioski. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [Odniesienie]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, cząstki wirusopodobne wirusa brodawczaka IH do dostarczania wielu cytotoksycznych epitopów komórek T. Wirusologia 2000, 273, 374–382. [Odniesienie]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Szczepienie błon śluzowych cząsteczkami wirusopodobnymi wirusa brodawczaka wywołuje u myszy odporność ogólnoustrojową i śluzówkową. Wirusologia 1998, 252, 39–45. [Odniesienie]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Cząsteczki wirusopodobne wirusa brodawczaka mogą dostarczać określone epitopy CTL do szlaku MHC klasy I. Wirusologia 1998, 240, 147–157. [Odniesienie]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Włócznia, GT; Qiao, L. Cząsteczki podobne do wirusa brodawczaka bydlęcego prezentujące konserwatywne epitopy z zewnętrznego regionu bliższego błony przeciwciał błonowych i ogólnoustrojowych indukowanych przez HIV-1 gp41. Szczepionka 2013, 31, 5422–5429. [Odniesienie]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Włócznia, GT; Qiao, L. Indukcja błon śluzowych i ogólnoustrojowych przeciwciał neutralizujących przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) przez doustną immunizację chimerycznymi cząsteczkami wirusopodobnymi wirusa brodawczaka bydlęcego-HIV-1 gp41. J. Wirol. 2004, 78, 8342–8348. [Odniesienie]

22. Xiao,SL; Wen, JL; Kong, Nowa Zelandia; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Droga podawania chimerowych VLP BPV1 określa charakter indukowanych odpowiedzi immunologicznych. Immunol. Biol Komórkowy. 2002, 80, 21–29. [Odniesienie]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, WRZOS; Roden, RYSZARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, Dr.; Schiller, JT Efektywna samoorganizacja wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 LI i L1-L2 w cząstki wirusopodobne. J. Wirol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Pottera, CS; Carragher, B.; Landera, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Charakterystyka cząstek wirusopodobnych w GARDASIL® za pomocą kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej. Szum. Szczepionki Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achur, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla antygenu HIV-1 gp160 i syntetycznego peptydu P18IIIB u osoby zaszczepionej HLA-A11-. AIDS Res. Szum. Retrowirusy 1994, 10, 19–25. [Odniesienie]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Analiza molekularna interakcji TCR i peptyd/MHC przy użyciu peptydów pochodzących z P18-I10-z pojedynczym podstawieniem D-aminokwasu. Biofizyka. J. 2007, 92, 2570–2582. [Odniesienie]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identyfikacja i charakterystyka subkieszeni na N-trimerze wirusa HIV-1 Gp41: Implikacje dla przedostania się wirusa i celu leku. AIDS 2015, 29, 1015–1024. [Odniesienie]

28. Peters, BS; Cheingsong-Popow, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Pilotażowe badanie fazy II dotyczące bezpieczeństwa i immunogenności wirusa HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) u bezobjawowych osób seropozytywnych pod względem wirusa HIV. J. Zarażać. 1997, 35, 231–235. [Odniesienie]

29. Chege, GK; Burgery, Waszyngton; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; i in. Silna odporność na auksotroficzne prątki Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost kandydata na szczepionkę przeciwko wirusowi HIV w modelu naczelnych innych niż człowiek. J. Wirol. 2013, 87, 5151–5160. [Odniesienie]

30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamsona, C.; Maclean, J.; Szary, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Schemat immunizacji pierwotnej przypominającej wykorzystujący rekombinowane szczepionki zawierające cząstki wirusopodobne BCG i Pr55gag oparte na podtypie C wirusa HIV typu 1 skutecznie wywołuje odpowiedź specyficzną dla Gag u pawianów. Szczepionka 2009, 27, 4857–4866. [Odniesienie]

31. Józef J.; Saubi, N.; Jestem, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Szczepienie noworodków myszy BCG.HIVA222 + MVA.HIVA wzmacnia odpowiedź immunologiczną specyficzną dla HIV-1-: wpływ wieku i dróg immunizacji. Clin. Rozw. Immunol. 2011, 2011, 516219. [Odn.Krzyżowe]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Inżynieria nowego projektu szczepionki przeciw prątkom dla pediatrycznej szczepionki przeciwko HIV-TB, wektorowanej przez auksotrof lizyny BCG. Mol. Tam. Metody Klin. Rozw. 2014, 1, 14017. [Odn.Krzyż]

33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitart, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Przedkliniczny rozwój BCG.HIVA2auxo.int, zawierającego integracyjny wektor ekspresyjny, do szczepionki pediatrycznej przeciwko HIV-TB. Zwiększenie stabilności i swoistej odporności limfocytów T HIV-1. Szum. Szczepionki Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T.; McMichael, AJ Zaprojektowanie i konstrukcja eksperymentalnej szczepionki przeciwko wirusowi HIV-1 na potrzeby rocznych-2000 badań klinicznych w Kenii. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Wysokopoziomowa i wysokowydajna produkcja rekombinowanego białka poprzez przejściową transfekcję hodowanych w zawiesinie ludzkich komórek 293-EBNA1. Kwasy nukleinowe Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Jednoetapowe oczyszczanie chromatograficzne białka L1 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 z Saccharomyces cerevisiae. Ekspr. białka Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Ekspresja chimerycznego białka L1P18 HPV-HIV w pichia pastoris; oczyszczanie i charakterystyka cząstek wirusopodobnych. Farmaceutyka 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. Wn. Zastosowanie CaptoTM Core 700 i Capto Q ImpRes w oczyszczaniu cząstek wirusopodobnych wirusa brodawczaka ludzkiego. J. Asia’s Pharm. Biofarm. Ind. 2014, 1–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Produkcja i charakterystyka przeciwciała monoklonalnego przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego typu 16 przy użyciu rekombinowanego wirusa krowianki. J. Clin. Patol. 1990, 43, 488–492. [Odniesienie]

40. Monografia produktu Merck Canada Inc. Gardasil®. Szturchać. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achur, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, Kolorado; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Struktura krystaliczna H-2D(d) MHC klasy I skompleksowana z peptydem P{18-110 pochodzącym z HIV-1- przy rozdzielczości 2,4 Å: Implikacje dla komórek T i komórek NK uznanie. Immunitet 1998, 9, 199–208. [Odniesienie]

42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Obecne inhibitory fuzji peptydowej typu HIV-1. Antywirus. Chem. Chemika. 2009, 20. [Odn.Krzyż]

43. Chen, XS; Garcea, Republika Południowej Afryki; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktura małych cząstek wirusopodobnych złożonych z białka L1 wirusa brodawczaka ludzkiego 16. Mol. Komórka 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Dzień, PM; Weisberg, AS; Thompsona, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, Dr.; Schiller, JT Kapsydy wirusa brodawczaka ludzkiego 16 pośredniczą w wejściu do jądra podczas infekcji. J. Wirol. 2019, 93, e00454-19. [Odniesienie]

45. Zhou, J.; Barierka, J.; Słońce, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identyfikacja sygnału lokalizacji jądrowej białka L1 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16. Wirusologia 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Bioprzetwarzanie cząstek wirusopodobnych: wyzwania i możliwości. Farmacja. Bioproces. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Dodatnio naładowane sekwencje białek kapsydu wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 są wystarczające do pośredniczenia w transferze genów do komórek docelowych poprzez receptor siarczanu heparanu. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [Odniesienie]

48. Sasagawa, T.; Puszka, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Synteza i składanie cząstek wirusopodobnych wirusa brodawczaka ludzkiego typu 6 i typu 16 w drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe. Wirusologia 1995, 206, 126–135. [Odniesienie]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Produkcja cząstek wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 w roślinach transgenicznych. J. Wirol. 2003, 77, 9211–9220. [Odniesienie]

50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Łuska, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Skalowalna produkcja białka L1 HPV16 i VLP z liści tytoniu. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [Odniesienie]

51. Aires, Kalifornia; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Willa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Produkcja cząstek wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 L1 przez rekombinowane komórki Lactobacillus casei. Aplikacja Otaczać. Mikrobiol. 2006, 72, 745–752. [Odniesienie]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Wysoki, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; i in. Ocena stabilności termicznej Gardasil®. Szum. Szczepionka. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, Pensylwania; Zlotnick, A. Ilościowy opis składania in vitro cząstek wirusopodobnych wirusa brodawczaka ludzkiego 16. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, poseł; Biały, Wisconsin; Palmer-Hill, Floryda; Koenig, S.; Suzich, JA Ilościowy demontaż i ponowny montaż cząstek wirusopodobnych wirusa brodawczaka ludzkiego typu 11 in vitro. J. Wirol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, Dr.; Schiller, JT Główne białko kapsydu L1 wirusa brodawczaka samoorganizuje się w cząstki wirusopodobne, które są wysoce immunogenne. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 1992, 88, 12180–12184. [Odniesienie]

56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Produkcja immunogennych cząstek wirusa brodawczaka ludzkiego-16 pochodzących z głównego białka kapsydu. Indianin J. Med. Rozdzielczość 2009, 130, 213–218.

57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, Teksas; Wang, N.; Volkin, DB Stabilizacja cząstek wirusa brodawczaka ludzkiego za pomocą niejonowych środków powierzchniowo czynnych. J.Pharm. Nauka. 2005, 94, 1538–1551. [Odniesienie]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, San Francisco; Christensen, Dakota Północna; Galloway, DA Identyfikacja typu wirusa brodawczaka ludzkiego 16-specyficznego epitopu na ramieniu C-końcowym głównego białka kapsydu L1. J. Wirol. 2003, 77, 11625–11632. [Odniesienie]

59. Von Brunn, A.; Marka, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Główna domena neutralizująca HIV-I jest wysoce immunogenna, gdy ulega ekspresji na powierzchni cząstek rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B. Szczepionka 1993, 11, 817–824. [Odniesienie]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parki, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Górny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; i in. Nieneutralizujące HIV-1 gp41 otoczki klastra II Ludzkie przeciwciała monoklonalne wykazują polireaktywność w wiązaniu z fosfolipidami i autoantygenami białkowymi. J. Wirol. 2011, 85, 1340–1347. [Odniesienie]

61. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Hubera, M.; Rehr, M.; Oksenius, A.; i in. Opóźnienie nawrotu wirusa HIV-1 po zaprzestaniu terapii przeciwretrowirusowej poprzez bierny transfer ludzkich przeciwciał neutralizujących. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [Odniesienie]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Niżej.; i in. Korelacja pomiędzy siłą działania myszy a względną siłą in vitro cząstek wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 i próbek szczepionki Gardasil. Szum. Szczepionka. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubi, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Postępy i wyzwania związane z opracowywaniem rekombinowanej szczepionki przeciwko wirusowi HIV na bazie Mycobacterium bovis BCG: wyciągnięte wnioski. Ekspert ks. Szczepionki 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]