Kalpastatyna zapobiega uszkodzeniom podocytów za pośrednictwem angiotensyny II poprzez utrzymanie autofagii
Mar 17, 2022
więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, morski Camus1,Matylda Lemoine1, Lea Guyonnet1, Hele'ne Lazaret1, Emmanuel Letavernier2, Carole He'nique1,Pierre-Louis Tharaux1i Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Paryż, Francja; oraz2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paryż, Francja
Silna wartość predykcyjna białkomoczu w przewlekłych patologiach kłębuszków jest mocno ustalona, podobnie jak patogenna rola angiotensyny II w promowaniu progresji choroby kłębuszków ze zmienioną barierą filtracji fi kłębuszków, uszkodzeniem podocytów i bliznowaceniem kłębuszków. Tutaj stwierdziliśmy, że przewlekłe nadciśnienie wywołane angiotensyną II zahamowałoautofagiawypływ w kłębuszkach myszy. Delecja Atg5 (genu kodującego białko zaangażowane w autofagię) specyficznie w podocytach spowodowała przyspieszoną podocytopatię wywołaną dangio tensyną II, nasilenie albuminurii i stwardnienie kłębuszków nerkowych. Wskazuje to, że autofagia jest kluczowym mechanizmem ochronnym w podocytach w tym stanie. Aktywność kalpainy indukowana przez angiotensynę II w podocytach hamujeautofagiaodpływ. Podocyty od myszy z transgeniczną ekspresją endogennego inhibitora kalpainykalpastatynawyświetlany wyższy podocytautofagiana początku badania był oporny na hamowanie zależne od angiotensyny II. Również utrzymująca się autofagia zkalpastatynaograniczone uszkodzenie podocytów i albuminuria. Odkrycia te sugerują, że nadciśnienie ma patogenny wpływ na strukturę i funkcję kłębuszków, częściowo poprzez aktywację kalpain, prowadzącą do zablokowania autofagii podocytów. Odkrycia te ujawniają oryginalny mechanizm, zgodnie z którym nadciśnienie zależne od angiotensyny II hamuje autofagię poprzez wywołaną wapniem rekrutację kalpainy z patogennymi konsekwencjami w przypadku zaburzenia równowagi przezkalpastatynadziałalność. W ten sposób, zapobiegając spadkowi spowodowanemu przez kalpainęautofagiamoże być obiecującą nową strategią terapeutyczną dla nefropatii związanych z wysoką aktywnością układu renina-angiotensyna.
SŁOWA KLUCZOWE: angiotensyna II;autofagia; kalpastatyna; nadciśnienie; podocyt
Oświadczenie tłumaczące
Biorąc pod uwagę kluczową rolę autofagii w rozwojunerkachoroby, modulacja farmakologicznaautofagiamoże być obiecującą strategią zapobiegania i leczenia kilku osóbnerkachoroby. Równolegle stwierdzono, że nadaktywacja aktywności kalpainy w podocytach ma szkodliwy wpływ na funkcję podocytów, podczas gdy jej szkodliwe mechanizmy działania nie zostały zidentyfikowane. Tutaj dostarczamy dowodów, że kalpain łączy szkodliwe działanie angiotensyny II ze szkodliwym blokowaniemautofagiaw podocytach i sugerują, że hamowanie kalpainy może być obiecującym celem terapeutycznym dla chorób podocytów, częściowo poprzez utrzymanie autofagii podocytów.
Kliknij, abyCistanche deserticola ma na przewlekłą chorobę nerek
Nadciśnienie jest drugą po cukrzycy główną przyczyną postępującej przewlekłej chorobynerkachoroby 1-3, a nawet niewielkie podwyższenie ciśnienia krwi jest niezależnym czynnikiem ryzyka schyłkowej choroby nerek.4 Coraz więcej badań eksperymentalnych podkreśla znaczenie podocytów w rozwojunerkauraz. Postępująca utrata podocytów i zmiany mikronaczyniowe pojawiają się wcześnie wraz z upośledzeniem czynności nerek w eksperymentalnej nefropatii nadciśnieniowej.5 Wykazano, że u pacjentów wydalanie z moczem żywotnych podocytów jest czułym i swoistym markerem stanu przedrzucawkowego,6,7, a u pacjentów z mniejsza niż wcześniej gęstość kłębuszkowych podocytównerkadawców.8,9 Co więcej, patogenna rola angiotensyny II (AngII) w promowaniu progresji choroby kłębuszków jest dobrze poznana, nie tylko w stanach nadciśnienia, ale także w kilku chorobach kłębuszków.10–21
Nadciśnienie kłębuszkowe powoduje rozciąganie naczyń włosowatych kłębuszków, uszkodzenie śródbłonka i podwyższoną filtrację białek kłębuszkowych, co powoduje zapaść kłębuszków i stwardnienie kłębuszków nerkowych. Wywiera również bezpośrednie działanie na struktury kłębuszków nerkowych, powodując sygnalizacyjne odpowiedzi regulacyjne mające na celu kompensację. Aktywowany ogólnoustrojowy i lokalny układ renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS) sprzyja hiperplazji mezangialnej i syntezie czynników przepuszczalności naczyń. Jednocześnie podocyty wykazują sygnalizację wapniową22,23 i modyfikują swój kształt pod wpływem stymulacji zależnej od receptora AngII typu 1 (AT1).24-28 Te mechanizmy adaptacyjne stają się nieprzystosowane w dłuższej perspektywie, prowadząc ostatecznie do stwardnienia kłębuszków nerkowych. AT1 pośredniczy w znaczącym zaangażowaniu RAAS w ciśnienie krwi oraz homeostazę soli i wody. Inhibitory konwertazy angiotensyny i blokery AT1 są klinicznie stosowane w leczeniu nadciśnienia i niewydolności serca u pacjentów. Co ciekawe, oba blokery wykazują również działanie ochronne nanerkafunkcjonować.
Wykazano, że autofagia ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania homeostazy komórkowej, szczególnie w komórkach postmitotycznych29,30, a zwłaszcza w podocytach.31-34Autofagiajest lizosomalnym systemem degradacji długo żyjących białek cytoplazmatycznych i dysfunkcyjnych organelli35,36 i obejmuje sekwestrację białek i organelli w autofagosomach. Tworzenie autofagosomów zależy od indukcji kilku genów, w tym Map1lc3a/b, Beclin 1 i Tags. 37 Istnieje coraz więcej dowodów na to, że dysregulacja szlaku autofagicznego jest zaangażowana w patogenezę starzenia się nerek, a kilkanerkachoroby takie jak ostre uszkodzenie nerek, wielotorbielowatość nerek, starzenie się i nefropatia cukrzycowa.31,32,38-41
Regulacjaautofagiaw podocytach, fizjologiczny, a przede wszystkim patologiczny, nie jest dobrze poznany. Niedawno wykazaliśmy, że autofagia podocytów jest niezależna od mechanistycznego celu regulacji rapamycyny (mTOR) w warunkach fizjologicznych, co czyni ten typ komórek wyjątkiem.42 Aktywacja AT1 stymuluje syntezę białek i obrót białek w komórkach. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że aktywacja układu RAAS może również wpływać na stymulację obrotu białka i proteostazę.
W niniejszym badaniu skupiliśmy się na roli sygnalizacji AngII w podocytachautofagiarozporządzenie. Zidentyfikowaliśmy aktywowane wapniem proteazy calpains pośredniczące w chronicznym działaniu blokującym AngII na podocytyautofagia. Ponadto odkryliśmy, że endogenny inhibitor kalpainykalpastatynabył w stanie zapobiec hamowaniu zależnej od AngII autofagii i uszkodzeniu podocytów podczas nadciśnienia.
Odkrycia te ujawniają oryginalny mechanizm, za pomocą którego nadciśnienie zależne od AngII hamujeautofagiapoprzez wywołaną wapniem rekrutację kalpainy z patogennymi konsekwencjami w przypadku braku równowagi przez aktywność kalpastatyny.
METODY
Zwierząt
Kalpastatynamyszy transgeniczne (CSTTg) uprzejmie dostarczył dr E. Letavernier.43 Myszy ze specyficznym dla podocytów przerwaniem genu Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) wygenerowano jak opisano wcześniej31 przez skrzyżowanie myszy Nphs2.cre44 z Atg5lox/lox mouse45 na tle C57BL6/J. W badaniu wykorzystano myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox i kontrolne samce z tego samego miotu, w wieku od 10 do 12 tygodni. Model nadciśnienia indukowano przez infuzję sc AngII (Sigma-Aldrich, A9525) w dawce 1 mg/kg/min przez 4 do 6 tygodni przez minipompy osmotyczne (Alzet Corp, model 2006). Pompy wszczepiono sc na plecy między łopatkami a biodrami. Myszy otrzymywały suplementację soli (3% NaCl) w pożywieniu. Myszy Atg5lox/lox (typu dzikiego [WT]) stosowano jako kontrole we wszystkich badaniach. W przypadku soli octanu dezoksykortykosteronu (DOCA) w modelu redukcji nefronu, dorosłe samce myszy poddano jednostronnej lewej nefrektomii. Dwa tygodnie po nefrektomii otrzymali oni peletki DOC z wszczepionym podskórnie 21-dniowym uwalnianiem (Innovative Research of America). Drugą peletkę wszczepiono 3 tygodnie po pierwszym implancie. Wszystkie myszy otrzymywały 0,9% NaCl w wodzie pitnej ad libitum i zostały zabite po 6 tygodniach podawania DOC.46 Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z francuskimi wytycznymi weterynaryjnymi oraz tymi opracowanymi przez Wspólnotę Europejską do eksperymentalnego wykorzystania zwierząt (L358-86/ 609EWG) i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Badań Naukowych i lokalną uniwersytecką komisję etyki badań naukowych (APAFIS-7646 i -22373).
Eksperyment z pierwotną hodowlą podocytów
Zróżnicowane pierwotne podocyty hodowano jak opisano wcześniej.47,48 W skrócie, świeżo wyizolowaną korę nerkową zmieszano i strawiono kolagenazą I (Gibco, 17100-017) w Roswell Park Memorial Institute 164 0 (Life Technologies, 61870-044). Tkanki przepuszczano następnie przez filtry komórkowe 70 mm i 40 mm (BD Falcon, 352340 i 352350). Kłębuszki, które przylegają do 40 mm sitka do komórek, usunięto solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS; Life Technologies, 10010023) 0,5 procent albuminy surowicy bydlęcej (Eurobio, HALALB07-65) wstrzyknięto pod ciśnieniem, a następnie przemyto dwukrotnie w PBS. Świeżo wyizolowane kłębuszki umieszczono na płytkach dołkowych w 6-dołkach w Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą i 1% penicyliną/streptomycyną (Life Technologies, 15140122), aby umożliwić podocytom wydostanie się z kłębuszków nerkowych i rosnąć. Wzbogacenie podocytów zweryfikowano za pomocą analizy Western blot, jak opisano wcześniej31,48,49 (rysunek uzupełniający S1). Podocyty hodowano pod nieobecność lub w obecności bafilomycyny A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) przez 4 godziny. Do eksperymentów immunofluorescencyjnych pierwotne podocyty wysiano na 4 etykietach płytek (Dutcher, 055071). Podocyty następnie utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut i poddano obróbce immunofluorescencyjnej.
Test aktywności kalpainy
Wewnątrzkomórkową aktywność kalpain oznaczono w pierwotnych podocytach, jak opisano wcześniej.50-52 W sumie 100000 komórek wyhodowano na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w Roswell Park Memorial Institute 1640 uzupełnionych 10% zawartością płodów surowica cielęca i 1 procent penicyliny/streptomycyny. Po wskazanym okresie hodowli pożywkę zastąpiono roztworem wodorowęglanu Krebsa-Ringera HEPES (KRH) (pH 7,4) zawierającym 4 mM CaCl2, z lub bez 10 mM inhibitora kalpainy -1 i inkubowano przez 10 minut przed dodaniem 50 mM substratu kalpainy N-sukcynylo-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metylokumaryny (Sigma-Aldrich, S6510). Po 90-minutowym okresie inkubacji aktywność kalpainy określono jako różnicę między fluorescencją FL (mierzoną przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 430 nm) zi bez inhibitora kalpainy-1.
Zachodnia plama
Pierwotne podocyty zdrapano 80 ml buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego zawierającego fosfatazę i inhibitor proteazy. Stężenie białka mierzono za pomocą zestawu BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Dwadzieścia mikrogramów białek poddano elektroforezie na prefabrykowanym żelu Criterion XT (12% Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Białka przeniesiono na membranę z difluorku poliwinylidenu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Po zablokowaniu w 5% mleku w Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T), błony inkubowano z króliczym poliklonalnym anty-LC3 (1:1 000, Cell Signaling Technology, 2575), króliczym poliklonalnym anty-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), poliklonalne anty-Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10,000, PROGEN, GP62), królicze poliklonalne anty-kalpaina 1 domena IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), królicze poliklonalne anty-kalpaina 2 N-końcowy koniec domeny I (1:1000, Abcam, ab39165), mysie monoklonalne IgG1 anty-kalpaina 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), królik anty podocyna (1:1000, Abcam, ab50339), anty-nefryna świnki morskiej (1:500, PROGEN, GP-N2) i szczurze monoklonalne antytubulina (1:5000, Abcam,ab6160). Po przemyciu membrany inkubowano z przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Wykrywanie określonych sygnałów przeprowadzono przy użyciu zestawu ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) na urządzeniu LAS 4000 (Fuji). Do oceny ilościowej zastosowano analizę densytometryczną za pomocą oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health).
Pomiary ciśnienia krwi i oceny fizjologiczne
Skurczowe ciśnienie krwi myszy rejestrowano stosując metodę mankietu na ogon (Visitech Systems Inc., BP-2000). Wykonano dziesięć pomiarów od każdej myszy, a następnie określono wartość średnią. Skurczowe ciśnienie krwi mierzono na początku (w wieku 12 tygodni), a następnie co tydzień do końca okresu leczenia. Wszystkie myszy umieszczono w klatkach metabolicznych ze swobodnym dostępem do wody na 6-godzinną zbiórkę moczu. Stężenia kreatyniny w moczu i mocznika w osoczu analizowano spektrofotometrycznie metodą kolorymetryczną (Olympus, AU400). Wydalanie albuminy z moczem mierzono stosując specyficzny test immunoenzymatyczny do ilościowego oznaczania albuminy w moczu myszy (Crystal Chem, 80630).
Histologia
Nerkizebrano i utrwalono w 4% formalinie buforowanej PBS. Skrawki zatopione w parafinie (grubość 3- mm) wybarwiono metodą Masson'strichrome w celu oceny morfologii nerek. Nieprawidłowości w nerkach oceniano na podstawie obecności i nasilenia nieprawidłowości składowych, w tym stwardnienia kłębuszków nerkowych, ekspansji mezangialnej, zaniku kanalików lub wałeczków oraz zwłóknienia. Odsetek stwardniałych kłębuszków oceniano za pomocą ślepego badania co najmniej 50 kłębuszków nanerkaSekcja.
Barwienie immunofluorescencyjne skrawków nerki i pierwotnych podocytów
Utrwalone pierwotne podocyty zablokowano w TBS-T 3% albuminie surowicy bydlęcej i inkubowano przez noc w 4 stopniach z pierwotnymi przeciwciałami świnki morskiej anty-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) i króliczymi -zielone białko fluorescencyjne FL (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Po płukaniu TBS-T, przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z fluoroforem FL osioł anty-króliczy IgG AF594-skoniugowane przeciwciało (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) i osioł antykróliczy IgG AF488-skoniugowany ( Zastosowano Invitrogen, A21206). Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss 2 ft, AxioCam HRccamera i oprogramowania Axiovision 4.3.
Do utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)nerkiskrawki (3 mm) odparafinowano i nawodniono, a odzyskiwanie antygenu przeprowadzono w ogrzanym buforze cytrynianowym (pH 6). Skrawki następnie permeabilizowano Triton 0.1% (Euromedex) i blokowano w TBS-T 3% albuminie surowicy bydlęcej przed całonocną inkubacją przeciwciał w 4°C. Użyliśmy koziej anty-nefryny (1:100, PROGEN, GP -N2), anty-SQSTM1/P62 świnki morskiej (1:1000, PROGEN, GP-62C), królicze anty-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kozie anty-podokalyksyna (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) i królicze przeciwciało przeciw guzowi Wilma 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192). Przeciwciałami drugorzędowymi były przeciwciała skoniugowane z Alexa488 i Alexa 568 firmy Invitrogen. Jądra wybarwiono na niebiesko przy użyciu Hoechsta. Slajdy mocowano przy użyciu fluorescencyjnego środka do mocowania (Dako, S3023). Fotomikrografie wykonano za pomocą fotomikroskopu Zeiss Axiohot i oprogramowania Axiovision. Półautomatyczne oznaczenia ilościowe na Fidżi zastosowano do oznaczenia ilościowego obszarów nefryno-dodatnich i PODXLþ na skrawek kłębuszków na co najmniej 30 kłębuszkach na mysz. Liczbę podocytów liczono jako liczbę jąder WT1þ na skrawek kłębuszków w co najmniej 30 kłębuszkach na mysz.
Procedura transmisyjnej mikroskopii elektronowej
Małe kawałki kory nerkowej (1 mm3) utrwalano w 3% aldehydzie glutarowym (Electron Microscopy Sciences) przez 1 do 3 0 dni i przemywano trzykrotnie w PBS. Próbki utrwalano w 1% tetratlenku osmu 0,1 M (Electron Microscopy Science) w 0,1 M PBS (pH 7,4) i przemywano wodą. Próbki odwodniono w jakości alkoholu i 100 procentowym tlenku propylenu (Electron Microscopy Science). Infiltrację żywicą przeprowadzono w następujący sposób: zmieszaj Epikote 812 i tlenek propylenu w stosunku 1:1 przez 30 minut, a następnie zmieszaj Epikote 812 i tlenek propylenu w stosunku 1:2 przez noc w temperaturze pokojowej. Próbki zatopiono w 4 mm kapsułkach żelatynowych w 100% Epikote 812 i spolimeryzowano w piecu ogrzanym do 60°C. Ultracienkie skrawki pocięto za pomocą ultramikrotomu UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) i nałożono na siatki Gilder 200 mesh (Electron Microscopy Science). Barwiono kontrastowo 7% octanem uranylu (dystrybucja LFG) i cytrynianem ołowiu Reynoldsa (LFG). Próbki badano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym JEM1011 (JEOL) z kamerą CCD Orius SC1000 (Gatan), obsługiwaną przez oprogramowanie Digital Micrograph (Gatan) do akwizycji.
Choroba Cistanche-nerki
Ilościowa tablica reakcji łańcuchowej polimerazy
Świeżo wyizolowane kłębuszki zamrożono w odczynniku QIazol Lysis (Qiagen) w stopniu -80. Ekstrakcja całkowitego RNA metodą fenolową została przeprowadzona zgodnie z zaleceniami producenta. cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401), a reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) przeprowadzono przy użyciu macierzy Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) z RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Ilościowe płytki PCR przepuszczono w cyklerze Applied Biosystems StepOnePlus. Każda macierz zawiera kontrolę jakości wydajności odwrotnej transkrypcji i zanieczyszczenia genomowym DNA. Analiza ilościowa PCR została przeprowadzona przy użyciu metody 2-DDCT z pomocą Centrum Analizy Danych GeneGlobe (www.Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) i wyrażona jako log2 krotność zmiany ekspresji genów.
Analiza proteomiczna in silico
Przewidywanie in silico miejsca cięcia kalpainy zostało wykonane za pomocą DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) i CaMPDB (http:// calpain.org/) narzędzia internetowe. Sekwencję aminokwasową mysiego białka uzyskano z firmy Uniprot (https://www.uniprot.org). Wyniki przedstawiono w tabelach uzupełniających S1 i S2.
Analizy statystyczne
Wszystkie wykresy przedstawiają indywidualne wartości i średnią ± SEM. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism, wersja 9. Porównanie między 2 grupami przeprowadzono przy użyciu parametrycznego testu t Studenta, gdy próbki przeszły testy normalności Andersona-Darlinga i D'Agostino oraz test F na równość wariancji. W przeciwnym razie zastosowano nieparametryczny test Manna-Whitneya. Porównanie między wieloma grupami przeprowadzono przy użyciu 1-way lub 2-way analizy wariancji, a następnie testu wielokrotnych porównań z poprawką Simaka. Wartości P < 0.05="" uznano="" za="" znaczące.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Rysunek 1|Nadciśnienie wywołane dietą wysokosolną (HSD) przez angiotensynę II (AngII) D hamuje kłębuszkoweautofagia. (a–c) Immunofluorescencja podokalyksyny (PODXL; czerwona) i P62 (zielona) w kłębuszkach nerkowych (a,a0 ) z myszy typu dzikiego (WT), (b,b0 ) z Myszy WT po 6 tygodniach AngII þ HSD i (c,c0) z myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox wykazujące akumulację P62 w podocytach podczas nadciśnienia i w ATG specyficznym dla podocytów{{1{{12 }}}}myszy z niedoborem. Groty strzałek wskazują kropki P62þ w WT w (a0). Jądra wybarwiono kontrastowo Hoechst (niebieski). Podczęści rysunku z liczbą pierwszą wskazują większe powiększenie. Pręty=50 mm. (d) Powiązana kwantyfikacja obszaru P62þ wyrażona jako procent obszaru kłębuszkowego. n=4 myszy WT i n=5 WT z AngII þ HSD i myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Test Manna-Whitneya: *P=0.0159. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
WYNIKI
Nadciśnienie wywołane dietą wysokosolną AngII D hamowało autofagię podocytów
Podocyty prezentują wysoki poziomautofagiain vivo, jak pokazuje silna ekspresja GFP u myszy transgenicznych z fuzją GFP do LC3 (myszy GFP-LC3), kluczowego markera autofagii (rysunek uzupełniający S2A). Autofagia to dynamiczny proces z ciągłym tworzeniem autofagosomów i degradacją autofagolizosomów. Blokowanie degradacji autofagosomalnej za pomocą chlorochiny skutkowało akumulacją kropek GFPþ, co wskazuje na wysoki wypływ autofagiczny w podocytach (rysunki uzupełniające S2A i B). Potwierdzenie, że kropki GFPþ są autofagosomami, zostało pokazane przez podwójną fluorescencję immuno-FL dla GFP i SQSTM1/P62, białka opiekuńczego degradowanego przezautofagia(Rysunek uzupełniający S2C i D). Ponownie, traktowanie chlorochiną indukowało akumulację kropek GFPþ P62þ, wykazując istotny wypływ autofagiczny w podocytach. Wreszcie, wysoki wypływ autofagiczny był zachowany in vitro, jak wykazała ekspresja GFP i P62 w pierwotnych podocytach izolowanych od myszy GFP-LC3 oraz silna akumulacja kropek GFPþ i P62þ pod wpływem leczenia bafilomycyną A1, kolejny bloker degradacji autofagosomalnej (rysunek uzupełniający S2E-H) .
Zdolność nadciśnienia do modulowania autofagicznych odpowiedzi podocytów oceniano następnie u myszy, którym wstrzyknięto AngII z dietą wysokosolną (HSD) przez 6 tygodni oraz u myszy bez nadciśnienia. Jak pokazano na rycinie 1, AngII þ HSD indukował akumulację P62 w kłębuszkach z silną akumulacją w podocytach, co sugeruje, że AngII þ HSD był odpowiedzialny za podocytautofagiablokada (rysunek 1a–d). Co ciekawe, akumulacja P62 w podocytach była podobna do tej obserwowanej u myszy z niedoborem autofagii podocytów (myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox). W innym modelu nadciśnienia, modelu soli DOC, zaobserwowaliśmy również postępującą akumulację P62 w podocytach w czasie choroby (rysunek uzupełniający S3).
Usunięcie Atg5 w szczególności w podocytach powoduje zwiększoną albuminurię, utratę podocytów i uszkodzenie kłębuszków w modelu AngII D HSD
Następnie zbadaliśmy, czyautofagiablokada tylko w podocytach (myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox) wpływa na uszkodzenie kłębuszków w modelu AngII þ HSD. Po raz pierwszy potwierdziliśmy, że Nphs2. Myszy cre Atg5lox/lox miały normalne ciśnienie krwi, normalnenerkai brak kłębuszkowych zmian histologicznych do 10 miesiąca życia, jak wcześniej opisano (rysunek uzupełniający S4).32 Następnie Atg5lox/lox (WT) i Nphs2. Myszom cre Atg5lox/lox podawano przez 6 tygodni infuzję AngII z HSD. Co ważne, skurczowe ciśnienie krwi było podobne w 2 grupach po wlewie AngII w trakcie badania (ryc. 2a), chociaż metoda mankietu na ogon stosowana do pomiaru ciśnienia krwi może nie być w stanie rozwiązać małych różnic ciśnienia krwi. Infuzja AngII z HSD znacznie zwiększyła stosunek albuminy moczowej do kreatyniny u myszy WT, a efekt ten był dalej znacząco zwiększony u myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox (Figura 2b). Myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox z nadciśnieniem również wykazywały znacznie zwiększone stwardnienie kłębuszków nerkowych w porównaniu z miotami WT (ryc. 2c-e). Zgodnie ze zmierzonym białkomoczem, wałeczki białkowe i rozszerzenie kanalików były znacznie bardziej rozpowszechnione u myszy z niedoborem podocytów w ATG5 (ryc. 2f–h).
Rysunek 2|Usunięcie Atg5 specyficznie w podocytach powoduje znaczny wzrost albuminurii,nerkauraz i utrata podocytów po 6 tygodniach infuzji angiotensyny II (AngII) D dieta wysokosolna (HSD). (a) Skurczowe ciśnienie krwi u myszy Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox podczas 36 dni AngII þ HSD. n=9 myszy na genotyp. Wartości przedstawiono jako średnie ±SEM. Dwukierunkowa analiza wariancji (ANOVA): ns. U (b–m), n=10 myszy na genotyp. W (b,g,h,k) wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią ±SEM. (b) AngII þ HSD (ciąg dalszy)
Rysunek 2|(ciąg dalszy) spowodował dramatyczny wzrost albuminurii w Nphs2. myszy cre Atg5lox/lox w porównaniu z myszami kontrolnymi Atg5lox/lox. Dwuczynnikowa ANOVA: genotyp, P=0.013; czas, P=0.0018. (c–f) Reprezentatywne obrazy skrawków kłębuszków barwionych trichromem Massona z myszy kontrolnych Atg5lox/lox i myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox po 6 tygodniach AngII þ HSD. Pręty=50 mm w (c,d). Pręty=100 mm w (e,f). (g,h) Porównanie (g) proporcji stwardniałych kłębuszków i (h) liczby odlewów rurkowych na pole mikroskopowe. Test Manna-Whitneya: **P=0,0026 cala (h), ***P=00,003 cala (g). (i,j) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji guza Wilmsa 1 (WT1; czerwony) i podokalyksyny (PODXL; zielony) w kłębuszkach z kontroli Atg5lox/lox i myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII þ HSD przez 6 tygodni. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręty=50 mm. (k) Ilościowe określenie liczby komórek WT1þ na skrawek kłębuszkowy. Test Manna-Whitneya: **P=0,0029 w (l,m). Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji CD44 (zielony) w kłębuszkach z kontroli Atg5lox/lox i myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII þ HSD przez 6 tygodni. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręty=50 mm. (n,o) Reprezentatywne fotomikrografie z transmisyjnej mikroskopii elektronowej skrawków kłębuszków z kontroli Atg5lox/lox i myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII þ HSD przez 6 tygodni, pokazujące zatarcie wyrostka podocytowego (groty strzałek) w nadciśnieniowych Nphs2. cre myszy Atg5lox/lox. Pręty=1 mm. n=3 myszy na genotyp. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.kidney-international.org.
Rysunek 3|Ekspresja i aktywność Calpain w podocytach. (a) Analiza Western blot ekspresji kalpainy-1, kalpainy-2 i kalpainy-4 w pierwotnych podocytach. Ekspresja tubuliny służy jako normalizacja. (b) Aktywność kalpainy mierzono na pierwotnych podocytach traktowanych lub nietraktowanych angiotensyną II (AngII; 100 nM) przez 24 godziny z lub bez kalpeptyny (10 mM). n=5 niezależnych eksperymentów. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA): leczenie, P=0.0035. Test wielokrotnych porównań Sidaka: *P=0.0128 dla AngII versus linia bazowa, ##P=0.0056 dla AngII þ kalpeptyna versus AngII. (c) Aktywność kalpainy zmierzono na pierwotnych podocytach z typu dzikiego (WT) lubkalpastatynamyszy transgeniczne (CSTTg) traktowane lub nietraktowane AngII (100 nM) przez 24 godziny. n=7 niezależnych eksperymentów. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Dwuczynnikowa ANOVA sparowana do leczenia: genotyp, P=0.0483. Test wielokrotnych porównań Sidaka: ***P=0.0009 dla WT AngII w porównaniu z linią podstawową, *P=0.0420 dla CSTTg AngII w porównaniu z linią podstawową, #P=0.0424 dla WT w porównaniu z CSTTg AngII. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
Liczba podocytów na kłębuszki była znacząco obniżona w Nphs2. Myszy cre Atg5lox/lox traktowane AngII þ HSD (Figura 2i-k). Uszkodzenie podocytów u myszy Nphs2.cre Atg5lox/lox z infuzją AngII þ HSD rozwinęło się nawet do ogniskowego i segmentowego stwardnienia kłębuszków nerkowych, jak pokazano przez ekspresję markera aktywacji komórek nabłonka ściennego (PEC) w kłębuszkach (Figura 2l i m). Analiza mikroskopii elektronowej zidentyfikowała znaczące zmiany związane z niedoborem ATG5 po przewlekłym wlewie AngII z HSD, w tym wymazywanie wyrostków stóp w nadciśnieniowych Nphs2. cre myszy Atg5lox/lox. W przeciwieństwie do tego, w podocytach myszy WT stwierdzono niewiele defektów ultrastrukturalnych nawet po 10 tygodniach infuzji AngII z HSD (Figura 2n i o), co wskazuje, że autofagiczna aktywność podocytów jest wymagana do ich odporności na uszkodzenia wywołane przez AngII þ HSD. W sumie nasze wyniki wskazały, że w modelu AngII þ HSD,autofagiahamowanie nasila uszkodzenie i utratę podocytów i indukuje późniejsze ogniskowe i segmentowe stwardnienie kłębuszków nerkowych.
AngII D HSD aktywuje aktywność kalpainy w podocytach, co przyczynia się do blokady autofagii
Ponieważ stwierdzono, że aktywność kalpainy (i) jest aktywowana przez AngII w kilku typach komórek i (ii) rozszczepia kilkaautofagiabiałek pokrewnych,53 zastanawialiśmy się, czy blokowanie autofagii za pośrednictwem AngII þ HSD można przypisać zwiększonej aktywności kalpainy indukowanej przez AngII. Najpierw odkryliśmy, że pierwotne podocyty wyrażały 3 wszechobecne formy kalpain (ryc. 3a). Następnie wykazaliśmy, że AngII stymuluje aktywność kalpainy w pierwotnych podocytach. Ten wzrost aktywności kalpainy był blokowany przez selektywny inhibitor kalpainy (Figura 3b). Użyliśmy wbijanej myszy z dodatkowymikalpastatynaekspresja transgenu (prowadząca do zmniejszenia aktywności kalpain)43 w celu oceny roli kalpain w AngII þ HSD za pośrednictwemnerkauraz i blokada autofagii. Pierwotne podocyty z myszy CSTTg wykazywały zmniejszoną aktywność kalpainy w odpowiedzi na AngII w porównaniu z podocytami z myszy kontrolnych (Figura 3c). Zatem,kalpastatynanadekspresja w podocytach zmniejszyła aktywację kalpainy za pośrednictwem AngII.
Następnie ocenialiśmyautofagiapoziomy w podocytach myszy CSTTg. Wygenerowaliśmy myszy CSTTg z transgenem GFP-LC3. Reporter LC3-GFP umożliwił zliczanie autofagosomów jako kropek GFPþ/P62þ. P62 będzie gromadzić się w agregatach w komórkach, gdy wypływ autofagiczny zostanie zablokowany. W stanie podstawowym policzyliśmy mniej kropek GFPþ P62þ (Rysunek 4a, b i e) i mniejszą akumulację P62 (Rysunek 4c, d i f) w podocytach myszy CSTTg GFP-LC3 niż w podocytach normalnych myszy GFP-LC3 , co sugeruje zwiększony wypływ autofagiczny w podocytach myszy z dużą obfitością kalpastatyny.
Rysunek 4|Ocena wypływu autofagicznego w podocytachkalpastatynamyszy transgeniczne (CSTTg). (a,b) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego FL (GFP) (zielony) i P62 (czerwony) w kłębuszkach z 12-tygodniowych myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. Groty strzałek wskazują autofagosomy GFPþP62þ. (c,d) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji P62 (zielony) i podokalyksyny (PODXL; czerwony) w kłębuszkach z 12-tygodniowych myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. Podczęści rysunku z liczbą pierwszą wskazują większe powiększenie. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręty=50 mm. (e) Kwantyfikacja liczby kropek LC3þP62þ na podocyt. Test Manna-Whitneya: **P= 0.0065. (f) Kwantyfikacja obszaru P62þ na sekcję kłębuszkową. Test Manna-Whitneya: *P=0.0420. U (e,f), n=5 myszy GFP-LC3 i n=8 myszy CSTTg GFP-LC3. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
Wypływ autofagiczny można monitorować poprzez pomiar konwersji postaci cytoplazmatycznej LC3, LC3-I do rozszczepionej autofagosomalnie i sprzężonej z fosfatydyloetanoloaminą postaci LC3, LC3-II, metodą Western blot . Podocyty z myszy CSTTg wykazywały zwiększoną konwersję LC3-I do LC3-II i zmniejszoną ekspresję P62, zarówno w obecności, jak i pod nieobecność bafilomycyny A1 (Figura 5a i b), co wskazuje na zwiększony wypływ autofagiczny u podocyty z nadekspresją kalpastatyny. Wreszcie, akumulacja kropek GFPþ P62þ w podocytach po podaniu chlorochiny była ważniejsza u myszy CSTTg GFP-LC3 niż u myszy GFP-LC3, co potwierdza, żekalpastatynanadekspresja indukuje autofagiczny wypływ w podocytach in vivo (ryc. 5c-e). W sumie nasze dane sugerują, że AngII stymuluje aktywność kalpainy w podocytach, coautofagiajest hamowany przez kalpainę w podocytach, a hamowanie endogennej aktywności kalpainy przez nadekspresję kalpastatyny wystarcza do stymulowania autofagicznego wypływu w podocytach.
Myszy CSTTg są chronione przed uszkodzeniem podocytów wywołanym przez AngII D HSD
Myszy CSTTg nie wykazały żadnychnerkazmiana do ukończenia co najmniej 12 miesiąca życia (rysunek uzupełniający S5). Przeanalizowaliśmy uszkodzenie podocytów u myszy CSTTg podczas leczenia AngII þ HSD. Chociaż u myszy WT rozwinęło się łagodne stwardnienie kłębuszków nerkowych i uszkodzenie podocytów po 4 tygodniach nadciśnienia, na co wskazuje nieprawidłowa ekspresja podokaliksyny i nefryny, myszy CSTTg wykazywały mniej stwardniałych zmian kłębuszkowych (ryc. 6a i b) i zachowaną ekspresję podokaliksyny i nefryny (ryc. 6c-h). . Takie różnice w fenotypie podocytów zaobserwowano na etapie, w którym gęstość jąder podocytów nie różniła się między myszami WT i CSTTg z nadciśnieniem (ryc. 6i–k).
Rysunek 5|Blokowanie degradacji autofagosomalnej potwierdziło zwiększony wypływ autofagiczny podocytów wkalpastatynamyszy transgeniczne (CSTTg). (a) Analiza Western blot ekspresji LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 i ATG5 w pierwotnych podocytach myszy typu dzikiego (WT) lub CSTTg. Ekspresja tubuliny służy jako normalizacja. Podocyty traktowano lub nie traktowano bafilomycyną A1 (BafA1; 100 nM) przez 4 godziny przed zatrzymaniem hodowli. (b) Kwantyfikacja stosunków LC{{10}}II/tubulina i P62/tubulina. n=10 myszy WT i n=8 myszy CSTTg. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Dwukierunkowa analiza wariancji sparowanych dla leczenia: dla LC3-II/tubulina: genotyp, P=0.{{30}}008; leczenie, P < 0,0001;="" dla="" p62/tubulina:="" genotyp,="" p="0.0884;" leczenie,="" p="">< 0,0001.="" test="" wielokrotnych="" porównań="" sidaka:="" dla="" lc3-ii/tubulina:="" ***p="">< 0,0001="" dla="" wt="" plus="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" dla="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}},0028="" dla="" wt="" þ="" bafa1="" kontra="" csttg="" þ="" bafa1;="" dla="" p62/tubulina:="" ***p="">< 0,0001="" dla="" wt="" plus="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" dla="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,d)="" reprezentatywne="" obrazy="" immunofluorescencyjne="" ekspresji="" zielonego="" białka="" fluorescencyjnego="" fl="" (gfp;="" zielonego)="" i="" p62="" (czerwonego)="" w="" kłębuszkach="" z="" 12-="" tygodniowych="" myszy="" gfp-lc3="" i="" csttg="" gfp-lc3.="" podczęści="" rysunku="" z="" liczbą="" pierwszą="" wskazują="" większe="" powiększenie.="" jądra="" wybarwiono="" hoechst="" (niebieski).="" pręty="50" mm.="" myszy="" traktowano="" chlorochiną="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" godziny="" przed="" uśmierceniem.="" groty="" strzałek="" wskazują="" autofagosomy="" gfpþp62þ.="" (e)="" kwantyfikacja="" liczby="" kropek="" lc3þp62þ="" na="" podocyt.="" n="5" myszy="" na="" genotyp.="" wartości="" są="" prezentowane="" jako="" indywidualne="" wykresy="" i="">±SEM. Niesparowany test t z równym SD: *P=0.0302. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
Rysunek 6 |Kalpastatynanadekspresja zapobiega uszkodzeniu podocytów, w którym pośredniczy angiotensyna II (AngII) D w diecie wysokosolnej (HSD). (a,b) Reprezentatywne obrazy skrawków kłębuszków barwionych trichromem Massona z myszy typu dzikiego (WT) i myszy transgenicznych kalpastatynowych (CSTTg) po 6 tygodniach AngII þ HSD. Pręty=50 mm. (c,d,f,g) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji (c,d) podokalyksyny (PODXL) i (f,g) nefryny (NPHS1) u myszy WT i CSTTg po 6 tygodniach AngII þ HSD i (e ,h) powiązane kwantyfikacje. Pręty=50 mm. (i,j) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji guza Wilmsa 1 (WT1; zielony) i PODXL (czerwony) w kłębuszkach od myszy WT i CSTTg po 6 tygodniach AngII þ HSD i (k) powiązanej ilościowej ocenie liczby WT1þ komórek na sekcję kłębuszkową. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręty=50 mm. W (e,h,k) wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. n=9 myszy WT i n=7 myszy CSTTg. Niesparowany test t z równym SD: **P=0,0095 w (e), *P=00,0249 w (h), P=0,7891 w (k). Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
Podobnie, po 6 tygodniach nadciśnienia, myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 wykazywały uszkodzenie podocytów, ale zmiany były bardziej widoczne u myszy GFP-LC3 (Figura 7). Stosunek albuminy w moczu do kreatyniny był wyższy u myszy GFP-LC3 po 4 tygodniach AngII þ HSD (Figura 7a). Liczba podocytów nie różniła się między 2 genotypami, ale ekspresja nefryny była znacznie bardziej obniżona u myszy GFP-LC3 (kontrola) (Figura 7b-e). Korelacja zkalpastatyna-za pośrednictwem ochrony, analiza ultrastrukturalna wykazała łagodne i ogniskowe zatarcie wyrostka podocytowego stopy u myszy GFP-LC3 leczonych AngII þ HSD z lepszym zachowaniem zanikania wyrostka racicowego u myszy CSTTg, chociaż globalna kwantyfikacja liczby wyrostków racicowych na podstawę kłębuszków długość błony (GBM) nie różniła się statystycznie, najprawdopodobniej dlatego, że uszkodzenie podocytów w naszym modelu jest ogniskowe i segmentowe (ryc. 7f–h). Warto zauważyć, że naciek makrofagów i limfocytów T wnerkinie różniły się między grupami (rysunek uzupełniający S6). Podsumowując, wyniki te wykazały, żekalpastatynazapobiegał uszkodzeniu podocytów wywołanemu przez AngII þ HSD.
Nadekspresja kalpastatyny przywraca autofagiczny wypływ w podocytach myszy po leczeniu AngII D HSD
W końcu zastanawialiśmy się, czykalpastatynapośredniczona ochrona kłębuszków w modelu AngII þ HSD implikowała utrzymanie autofagii w podocytach. Co ciekawe, indukowana przez AngII þ HSD akumulacja P62 w podocytach została uniemożliwiona u myszy CSTTg i GFP-LC3 CSTTg (ryc. 8a-d), co wskazuje, że kalpastatyna zapobiegała blokadzie podocytówautofagia. Warto zauważyć, że liczba kropek znakujących GFPþ P62þ autofagosomów była podobna w podocytach od myszy z nadciśnieniem GFP-LC3 i GFP-LC3 CSTTg, co sugeruje, że AngII þ HSD indukował raczej spowolnienie autofagicznego wypływu podocytów niż całkowite zatrzymanie (ryc. 8e– g).
Przewidywanie in silico miejsca cięcia kalpainy w białkach podocytów
Wykorzystaliśmy kilka narzędzi in silico do przewidywania potencjalnych celów kalpain w podocytach (tabele uzupełniające S1 i S2). Porównano trzy internetowe bazy danych: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 i DeepCalpain.56 Analiza in silico zidentyfikowała kilka białek podocytowych, wśród nich nefrynę i podocynę, które mogą być rozszczepiane przez kalpainy. Zatem,kalpastatynaOchrona kłębuszków, w której pośredniczy, może być powiązana ze zmniejszeniem aktywności enzymatycznej kalpainy, co prowadzi do zmniejszonej degradacji niektórych białek podocytów.
Ponadto co najmniej 3autofagiaBiałka pokrewne są bezpośrednim celem kalpain. ATG5 jest cięte przez kalpainy, co prowadzi do zaburzenia tworzenia kompleksu ATG12-ATG5.57,58 Podawanie inhibitorów kalpainy in vivo zapobiegało również rozszczepieniu białka autofagii Beclin-1.59 Analiza in silico przypuszczalne miejsce cięcia na białkach związanych z autofagią wspiera hipotezę, że kalpaina może regulować autofagię poprzez enzymatyczne rozszczepienie białek autofagii.
Funkcja Cistanche-nerki
Ekspresja mRNA retikulum endoplazmatycznego (ER) i markerów stresu oksydacyjnego w kłębuszkach z myszy leczonych AngII plus HSD
Oceniliśmy stres retikulum endoplazmatycznego (ER) i stres oksydacyjny metodą ilościowej PCR w kłębuszkach podczas leczenia AngII þ HSD (Tabela 1). Na początku nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian w ekspresji mRNA analizowanych genów w kłębuszkach myszy WT i Nphs2.cre Atg5lox/lox (rysunek uzupełniający S7). Po 6 tygodniach nadciśnienia kłębuszki z Nphs2. Myszy cre Atg5lox/lox wykazywały inny profil mRNA genów stresu ER i szlaków stresu oksydacyjnego ze zwiększoną ekspresją Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 i Hsp90b1 w porównaniu z kłębuszkami WT, co sugeruje, żeautofagiaubytek w podocytach sprzyjał indukowanemu przez AngII HSD stresowi ER i stresowi oksydacyjnemu. Odwrotnie, kłębuszki z myszy CSTTg wykazywały regulację w dół kilku genów stresu ER i szlaków stresu oksydacyjnego, a także zmniejszoną ekspresję niektórych genów proapoptotycznych (Figura 9).
Podsumowując, wyniki te wskazują, żekalpastatynanadekspresja może zapobiec uszkodzeniu kłębuszków poprzez zmniejszenie ER i stresu oksydacyjnego wywołanego przez AngII þ HSD.
DYSKUSJA
W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że w nadciśnieniu indukowanym AngII þ HSD autofagia podocytów jest znacznie obniżona. Ponadto myszy ze specyficzną dla podocytów delecją Atg5 były bardziej podatne na indukowane przez AngII HSD stwardnienie kłębuszków nerkowych i utratę podocytów, co pokazuje, żeautofagiaw podocytach zapobiega rozwojowi nefropatii nadciśnieniowej, podkreślając kluczową rolę autofagii w uszkodzeniu podocytów indukowanym AngII þ HSD. Niewiele wiadomo na temat bodźców zewnątrzkomórkowych regulujących autofagię komórkową, a wyniki te rzucają światło na patofizjologiczną regulację autofagii podocytów przez AngII.
W większości kłębuszków nerkowych u ludzi zatarcie wyrostka podocytowego stopy jest cechą charakterystyczną uszkodzenia kłębuszków prowadzącego do białkomoczu. Autofagia prawdopodobnie odgrywa zasadniczą rolę w utrzymaniu funkcji podocytów, ponieważ te terminalnie zróżnicowane komórki wykazują wysokie wskaźnikiautofagianawet przy braku stresu. Poprzednie badanie wykazało, że AngII promuje autofagię poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu w warunkowo unieśmiertelnionych mysich podocytach linii komórkowej 60. Wytwarzanie reaktywnych form tlenu jest rzeczywiście ogólnym induktorem autofagii w wielu typach komórek, a przyczyny takiej rozbieżności z naszymi ustaleniami są następujące: niejasny. W przeciwieństwie do tego ostatniego badania, zastosowaliśmy mysie pierwotne hodowane podocyty zachowujące ekspresję podocyny i nefryny oraz podejścia in vivo, a nie mysie linie komórkowe. Potwierdzamy wcześniejsze doniesienia, że podocyty postmitotyczne wykazują niezwykle wysoki poziom konstytutywnyautofagia. Pomiar zwiększonej ilości LC3-II po stymulacji AngII w obecności lub nieobecności inhibitorów lizosomów jest niezbędny do określenia, czy wypływ autofagiczny jest zwiększony czy zablokowany. Wcześniejsze badania pomijały to zjawisko60
Rysunek 7 |Kalpastatynanadekspresja zapobiega uszkodzeniu podocytów za pośrednictwem diety wysokosolnej (HSD) u myszy z zielonym białkiem fluorescencyjnym FL (GFP)–LC3. (a) AngII þ HSD spowodował dramatyczny wzrost albuminurii u myszy GFP-LC3 w porównaniu z myszami CSTTg (transgeniczne kalpastatyna) GFP-LC3. n=8 do 13 myszy na genotyp. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Dwukierunkowa analiza wariancji: genotyp, P=0.0429; czas, P=0.0165. Test wielokrotnego porównania Sidaka: *P=0.0453 dla myszy GFP-LC3 versus CSTTg GFP-LC3 w dniu 28. (b,c) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji guza Wilma 1 (WT1; zielony) i nefryny (NPHS1) (czerwony) w kłębuszkach 18-tygodniowych myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 po 6 tygodniach infuzji AngII þ HSD. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręty=50 mm. Ocena ilościowa (d) obszaru NPHS1þ na skrawek kłębuszkowy i (e) liczby komórek WT1þ na skrawek kłębuszkowy u 18-tygodniowych myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 po 6 tygodniach infuzji AngII þ HSD. n=19 myszy GFP-LC3 i n=25 myszy CSTTg GFP-LC3. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Niesparowany test t z równym SD: **P=0.0010 w (d), P= 0.1158 w (e). (f,g) Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej kłębuszków nerkowych od myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 po 6 tygodniach AngII þ HSD. Groty strzałek wskazują na zatarcie wyrostka. Pręty=1 mm. (h) Ilościowe określenie liczby wyrostków stóp na mikrometr błony podstawnej kłębuszków (GBM). n=3 myszy na genotyp. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnie SEM. Każdy wykres przedstawia średnią liczbę podocytów na mikrometr GBM na 1 ciągłej długości GBM. Niesparowany test t z równym SD: P=0.7512. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
Tutaj zastosowaliśmy model nadciśnienia oparty na perfuzji AngII i HSD. Podocyty wykazują receptory AT1 i są eksponowane na swobodnie filtrowane peptydy, takie jak AngII.13,16,26,61-65 Przypuszcza się, że obserwowane renoprotekcyjne działanie hamowania RAAS może być przynajmniej częściowo spowodowane blokadą tego podocytu. specyficzne RAAS. Podobnie, badania in vivo potwierdziły wpływ AngII na uszkodzenie podocytów i ukierunkowanie AT1 na gen specyficzny dla podocytów wykazały, że aktywacja receptorów AT1 w kłębuszkach w eksperymentalnym toczniowym zapaleniu nerek jest wystarczająca do przyspieszenianerkauraz przy braku nadciśnienia.66,67autofagiarozregulowanie w naszym modelu może być związane z bezpośrednią sygnalizacją AngII-AT1 na podocytach lub być konsekwencją nadciśnienia. Możemy udzielić wczesnej odpowiedzi na to pytanie. Rzeczywiście, w modelu soli DOC, stwierdziliśmy również akumulację P62 w podocytach myszy z nadciśnieniem (rysunek uzupełniający S3). Sugeruje to, że w tym modelu w podocytach występuje blokada autofagii, która ma być niezależna od AngII.68 Dalsze badania oceniające uszkodzenie podocytów związane z aktywnością kalpainy i wypływem autofagii u myszy z selektywnym niedoborem AT1 w podocytach byłyby konieczne do określenia, czy taka regulacja autofagii podocytów zależy od bezpośredniego lub pośredniego wpływu AngII.
Rysunek 8 |Kalpastatynanadekspresja zapobiega indukowaniu przez angiotensynę II (AngII) D diety wysokosolnej (HSD)autofagiaregulacja w dół w podocytach. (a,b) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji P62 (zielony) i podokalyksyny (PODXL; czerwony) w kłębuszkach z zielonego białka fluorescencyjnego FL (GFP)–LC3 i CSTTg (kalpastatynatransgeniczne) myszy GFP-LC3 po 6 tygodniach AngII þ HSD. Podczęści rysunku z liczbą pierwszą wskazują większe powiększenie. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręty=50 mm. (c,d) Kwantyfikacja obszaru P62þ na przekrój kłębuszkowy. n=9 myszy typu dzikiego (WT) i n=7 myszy CSTTg w (c) i n=16 myszy GFP-LC3 i n=16 myszy CSTTg GFP-LC3 w lit. d). Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Test Manna-Whitneya: **P=00,033 w (c), **P=0,0011 w (d). (e,f) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji GFP (zielony) i P62 (czerwony) w kłębuszkach z myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 po 6 tygodniach AngII þ HSD. Podczęści rysunku z liczbą pierwszą wskazują większe powiększenie. Groty strzałek wskazują autofagosomy GFPþP62þ. (g) Kwantyfikacja liczby kropek LC3þP62þ na podocyt. n=11 myszy GFP-LC3 i n=16 myszy CSTTg GFP-LC3. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnią±SEM. Niesparowany test t z równym SD: P=0.1014. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.
Tabela 1|Niestandardowa macierz RT2 Profiler PCR
Calpain-1 i calpain-2 to wszechobecne proteazy prozapalne, których aktywność jest kontrolowana przezkalpastatyna, ich specyficzny inhibitor. Rzeczywiście, kalpastatyna selektywnie hamuje kalpainy i jak dotąd żadnych innych proteaz. Aktywacja Calpain została ostatnio połączona znerkauraz w kilku patologicznych kontekstach.69,70 Stwierdzono, że kanał C6 transportera kanału wapniowego dla receptora przejściowego aktywuje kalpainę-1 w podocytach poprzez aktywację Ca2þ/kalcyneuryna. Nerki pacjentów z ogniskowym i segmentowym stwardnieniem kłębuszków nerkowych miały zwiększoną ekspresję przejściowego potencjału receptorowego kanału C6, zwiększoną aktywność kalpainy i kalcyneuryny oraz zmniejszoną ekspresję docelowej taliny kalpainy -1, która ma kluczowe znaczenie dla stabilności cytoszkieletu podocytów.71 C6 wiąże się również bezpośrednio z kalpainą-1 i kalpainą-2. Ta interakcja ma kluczowe znaczenie dla regulacji cięcia taliny-1 i kontroli ruchliwości podocytów.72
Transgeniczne myszy z nadekspresjąkalpastatynasą chronione przed przebudową naczyń i zapaleniem zależnym od AngII73; przeciw zapaleniu w modelach kłębuszkowego zapalenia nerek,43 posocznicy74 lub odrzucenia przeszczepu allogenicznego75; oraz przeciwko zapaleniu związanemu z wiekiem.76 Uszkodzenie podocytów u tych myszy nie zostało zbadane. Peltiera i in. pokazał, że nadekspresjakalpastatynazapobiegał zapaleniu okołonaczyniowemu zależnemu od AngII w nerkach.43 Zatem w ochronie nerek u myszy CSTTg może pośredniczyć, przynajmniej częściowo, mechanizm przeciwzapalny. Oceniamy naciek makrofagów i limfocytów w naszym modelu i nie znaleźliśmy znaczącej różnicy wnerkazapalenie między CSTTg a myszami kontrolnymi podczas analizy globalnejnerkanaciek leukocytów (rysunek uzupełniający S6).
Calpain był ostatnio zaangażowany w regulację autofagii (recenzowaną niedawno w Weber i wsp. 53) z interesującymi i bioprotekcyjnymi właściwościami hamowania kalpainy w kontekście cukrzycowym poprzez przywrócenieautofagia.77 Tutaj pisaliśmy, że hamowanie kalpainy poprzezkalpastatynanadekspresja (i) zapobiegła uszkodzeniu podocytów podczas nadciśnienia i (ii) przywróciła autofagię w podocytach, podkreślając w ten sposób nową szkodliwą rolę aktywacji kalpainy podczas nadciśnienia poprzez hamowanieautofagia.
Wykazano, że prawie wszystkie białka ATG są cięte przez kalpainy in vitro. 78 Tutaj postulowaliśmy, żeautofagiaw utrzymaniu u myszy CSTTg z nadciśnieniem pośredniczyło hamowanie kalpainy. Aby poprzeć naszą hipotezę, wykazaliśmy, że podocyty z CSTTg mają zmniejszoną aktywność kalpainy po prowokacji AngII in vitro (Figura 3c). Stwierdziliśmy podwyższony poziom białka ATG5 w podocytach myszy CSTTg, co sugeruje, że nadekspresja kalpastatyny zapobiegała w tym kontekście rozszczepieniu ATG5 za pośrednictwem kalpainy (Figura 5a). W przeciwieństwie do tego wykazano, żekalpastatynapośredniczone hamowanie kalpainy może być niezależne od hamowania ich aktywności proteazowej79; tak więc nie mogliśmy wykluczyć regulacji autofagii przez kalpastatynę niezależnie od aktywności enzymatycznej kalpainy.
Podsumowując, odkrycia te ujawniły wcześniej nierozpoznaną rolękalpastatynaw regulacji podocytówautofagiai dostarczyła wskazówek dla badań nad nowymi strategiami terapeutycznymi zwiększającymi przeżywalność podocytów podczas nefropatii nadciśnieniowych.
UJAWNIENIE
Wszyscy autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.
PODZIĘKOWANIE
Praca ta była wspierana przez Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) i Université de Paris. IB był wspierany przez stypendium dla absolwentów z Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL był finansowany z nagrody European Foundation for the Study of Diabetes (EFSD) wspieranej przez EFSD/Novo Nordisk Program for DiabetesResearch in Europe oraz grant z Société Francophone duDiabète (SFD). BR i CH zostały sfinansowane ze środków Starting Grant 107037 Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych i Unii Europejskiej (P-LT). YS był wspierany przez stypendium dla absolwentów z Fondation de France.
Dziękujemy Elizabeth Huc, Nicolasowi Perezowi, Corinie Suldac i zespołowi ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paryż, Francja) za pomoc w opiece i obchodzeniu się ze zwierzętami, Nicolasowi Sorhaindo za pomiary biochemiczne (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Paryż, Francja) oraz Alain Schmitt i Jean-Marc Masse za transmisyjną mikroskopię elektronową (Institut Cochin, Paryż, Francja). Dziękujemy Morgane Le Gall (Cochin proteomic facility 3P5, Paryż, Francja) za pomoc w analizie in silico. Dziękujemy za wsparcie administracyjne Véronique Oberweis, Bruno Pillarda i Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paryż, Francja).
MATERIAŁ UZUPEŁNIAJĄCY
Plik uzupełniający (PDF)
Rysunek S1. Pierwotna hodowla podocytów wyraża markery podocytów. Analiza Western blot ekspresji markerów podocytów NPHS1 i NPHS2 w pierwotnej hodowli podocytów od myszy WT i CSTTg. Tubulin (TUBA) służy jako kontrola załadunku. Przedstawiciel n=4 myszy na genotyp.
Rysunek S2. Wysoki podstawowy poziom podocytówautofagia. (A, B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji GFP (zielony) i NPHS1 (czerwony) w kłębuszkach nerkowych z myszy GFP-LC3 traktowanych lub nie CQ (80mg/kg) 4 godziny przed uśmierceniem. Groty strzałek pokazują autofagosomy GFPþ. (C,D) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji GFP (zielony) i P62 (czerwony) w kłębuszkach nerkowych od myszy GFP-LC3 traktowanych lub nie CQ (80 mg/kg) 4 godziny przed uśmierceniem. Groty strzałek pokazują autofagosomy GFPþ P62þ. (A–D) (0 ) reprezentują większe powiększenie. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręt=50 mm. N=4 myszy na stan (E-H) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji GFP (zielony) i P62 (czerwony) w pierwotnych podocytach z myszy GFP-LC3 leczonych (F, H) lub nie (E, G ) z Bafifilomycyną A1 (100 nM) przez 4 godziny. N=5 myszy na stan.
Rysunek S3. P62 gromadzi się w podocytach w modelu nadciśnienia tętniczego z solą DOC. (A-C) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji P62 (zielony) i PODXL (czerwony) w kłębuszkach z myszy WT po 2 do 6 tygodniach modelu soli DOC. (0) reprezentują większe powiększenie. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). Pręt ¼ 50 mm. (D) Kwantyfikacja powierzchni P62 na powierzchnię podocytów (procent). N=5–6 myszy na stan. Jednokierunkowa analiza wariancji: czas P=0,0059, test wielokrotnych porównań Sidaka: D42 kontra D14 **P=00.0055, D28 kontra D14 P=0.8590.
Rysunek S4. Podocytautofagiajest niezbędny do rozwoju podocytów. (A) Skurczowe ciśnienie krwi, (B) stosunek albuminy w moczu do kreatyniny i (C) poziomy azotu mocznika we krwi u myszy Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 myszy na genotyp. Wartości są prezentowane jako indywidualne wykresy i średnie±SEM. Test Manna-Whitneya: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) i P=0.6623 (C). (D-E) Reprezentatywne obrazy wycinków kłębuszków Massona barwionych trichromem u myszy Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F-G) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji PODXL (zielony) i WT1 (czerwony) u myszy Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. Jądra wybarwiono Hoechst (niebieski). (D–G) Pręt=50 mm. N=6 myszy na genotyp. (H–I) Reprezentatywne fotomikrografie skrawków z transmisyjnej mikroskopii elektronowej kłębuszków myszy Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. Sztabka=1 mm. N=3 myszy na genotyp.
Rysunek S5.Kalpastatynanadekspresja nie ma wpływunerkafunkcja wyjściowa. (A) poziomy azotu mocznikowego we krwi i (B) albuminy w osoczu u 12-tygodniowych myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. N=5 GFP-LC3 i N=6 CSTTg GFP-LC3. Wartości są prezentowane jako indywidualne wykresy i średnie±SEM. Test Manna-Whitneya: P=0.6623 (A) i P=0.9307 (B). (C,D) Reprezentatywne obrazy wycinków kłębuszków nerkowych barwionych trichromem Massona z myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. (E–H) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne ekspresji PODXL (E, F) i NPHS1 (G, H) u myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. (C–H) Pręt=50 mm. (I, J) Powiązana kwantyfikacja obszaru PODXL i NPHS1 na przekrój kłębuszkowy. N=5 GFP-LC3 i N=6 CSTTg GFP-LC3. Wartości są prezentowane jako indywidualne wykresy i średnie±SEM. Test Manna-Whitneya: P=0.1898 (A) i P=0.8413 (B).
Funkcja Cistanche-nerki
Rysunek S6.Kalpastatynanadekspresja nie wpływa na globalne zapalenie nerek. Reprezentatywna immunohistochemia ekspresji F4/80 (A, B) i CD3 (D–E) u myszy GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 po 6 tygodniach angiotensyny II þHSD. Pręt=200 mm. (C, F) Powiązana kwantyfikacja powierzchni F4/80 i CD3 pernerkaSekcja. N=7 CSTTg GFP-LC3 i N=8 myszy GFP-LC3. Wartości przedstawiono jako indywidualne wykresy i średnie SEM. Test Manna-Whitneya: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Rysunek S7. Podocytautofagiadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tabela S1. Przewidywanie in silico miejsc rozszczepienia kalpain. Miejsca cięcia kalpainy przewidywano w białkach związanych z podocytami i autofagią za pomocą GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) i DeepCalpain Predict (http://deepcalpain). Cancerbio.info/help.php). Plik dodatkowy (Excel)
Tabela uzupełniająca S2. Pełny plik dotyczący przewidywania in silico miejsc rozszczepienia kalpain. Miejsca cięcia kalpain przewidywano w podocytach iautofagiabiałek powiązanych z GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) i DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Miejsca cięcia predykcyjnego są wznawiane dla każdego białka dla GPS-CCD i DeepCalpain Predict.
BIBLIOGRAFIA
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, i in. Częstość występowania przewlekłychnerkachoroba w Stanach Zjednoczonych. JAMA. 2007;298:2038-2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C i in. Do kogo należy skierować badania przesiewowe w kierunku PChN? Wpływ cukrzycy, nadciśnienia tętniczego i chorób układu krążenia. Am J Nerki Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, i in. Czynniki ryzyka ESRD u osób z zachowanym oszacowanym GFR z albuminurią i bez albuminurii: wyniki Programu Wczesnej Oceny Nerek (KEEP). Am J Nerki Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Podwyższone ciśnienie krwi i ryzyko schyłkowej niewydolności nerek u osób bez wyjściowej choroby nerek. Arch Intern Med. 2005;165:923-928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S i in. Uszkodzenie podocytów leży u podstaw glomerulopatii u szczurów z nadciśnieniem soli Dahla i jest odwracane przez bloker aldosteronu. Nadciśnienie. 2006;47:1084-1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST i in. Wydalanie podocytów z moczem jako marker stanu przedrzucawkowego. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podocyturia poprzedza białkomocz i kliniczne cechy stanu przedrzucawkowego: podłużne badanie prospektywne. Nadciśnienie. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC i in. Utrata podocytów w stwardnieniu nerek z nadciśnieniem u ludzi. Jestem J Hypertens. 2009;22:300-306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM i in. Donerkowa ekspresja miRNA u pacjentów z nadciśnieniową stwardnieniem nerek. Jestem J Hypertens. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Przewlekłe nefropatie białkomoczowe: wyniki i odpowiedź na leczenie w prospektywnej kohorcie 352 pacjentów z różnymi wzorcami uszkodzenia nerek. Am J Nerki Dis. 2000;35:1155-1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Zależna od angiotensyny II trwała utrata podocytów z destabilizowanych kłębuszków powoduje progresję schyłkowej fazynerkachoroba. Nerka wewn. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Wpływ blokerów receptora angiotensyny II na uszkodzenie podocytów i apoptozę kłębuszkową w szczurzym modelu eksperymentalnej nefropatii cukrzycowej wywołanej streptozotocyną. Acta Histochem. 2011; 113: 826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Angiotensyna II przyczynia się do uszkodzenia podocytów poprzez zwiększenie ekspresji TRPC6 za pośrednictwem szlaku sygnałowego pozytywnego sprzężenia zwrotnego, w którym pośredniczy NFAT. Jestem J Patholem. 2011;179:1719-1732.
14. Grupa badawcza EUCLID. Randomizowane, kontrolowane placebo badanie lizynoprylu u pacjentów z prawidłowym ciśnieniem tętniczym z cukrzycą insulinozależną i normoalbuminurią lub mikroalbuminurią. Lancet. 1997;349:1787-1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Proteinuria, cel renoprotekcji u pacjentów z nefropatią cukrzycową typu 2: wnioski z RENTAL. Nerka wewn. 2004;65:2309-2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Zmiany w selektywności perm kłębuszkowej indukowane przez angiotensynę II implikują dysfunkcję podocytów i rearanżację białka szczelinowej przepony. Nefrol nasienia. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Charakterystyka podtypów receptora angiotensyny II w podocytach. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ i in. Proteinuria i ekspresja białka przepony szczelinowej podocytów, nefryny, w nefropatii cukrzycowej: skutki hamowania enzymu konwertującego angiotensynę. Diabetologia. 2002;45:1572-1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S i in. Wpływ inhibitora konwertazy angiotensyny, antagonisty receptora angiotensyny II i antagonisty wapnia na podocyty w moczu u pacjentów z nefropatią IgA. Jestem J Nephrol. 2000; 20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG i in. Angiotensyna II zwiększa aktywność wapnia cytozolowego w podocytach szczura w hodowli. Nerka wewn. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Długotrwałe korzystne efekty hamowania enzymu konwertującego angiotensynę u pacjentów z białkomoczem nerczycowym. Am J Nerki Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S i in. Angiotensyna II zwiększa wewnątrzkomórkową aktywność wapnia w podocytach nienaruszonego kłębuszka nerkowego.Nerkawewn. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. Angiotensyna II moduluje funkcje komórkowe podocytów. Nerka Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Stretch zmniejsza ekspresję nefryny poprzez mechanizm zależny od angiotensyny II-AT(1) w ludzkich podocytach: efekt rozyglitazonu. Am J Physiol Fizjol nerek. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Rozciąganie, napięcie i adhezja – mechanizmy adaptacyjne cytoszkieletu aktynowego w podocytach. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Aktywacja miejscowego tkankowego układu angiotensyny w podocytach przez obciążenie mechaniczne. Nerka wewn. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. Cykliczna siła rozciągająca selektywnie zwiększa transformację izoform czynnika wzrostu beta w hodowanych szczurzych komórkach mezangialnych. Jestem J Patholem. 1996;148:1915-1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Uszkodzenie podocytów jest krytycznym etapem w rozwoju stwardnienia kłębuszków nerkowych u szczura z nadciśnieniem tętniczym z nefrektomią i dezoksykortykosteronem. Archiwum Virchows. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, et al. Utrata autofagii zmniejsza masę i funkcję komórek beta trzustki, co prowadzi do hiperglikemii. Metab. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M i in.Autofagiajest ważny w homeostazie wysepek i kompensacyjnym wzroście masy komórek beta w odpowiedzi na dietę wysokotłuszczową. Metab. 2008;8:325-332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C i in. Autofagia komórek śródbłonka i podocytów synergistycznie chroni przed stwardnieniem kłębuszków nerkowych wywołanym cukrzycą. Autofagia. 2015;11:1130-1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Autofagia wpływa na podatność na choroby kłębuszków nerkowych i utrzymuje homeostazę podocytów u starzejących się myszy. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A i in. Dwa rodzaje autofagii w podocytach w próbkach z biopsji nerki: badanie ultrastrukturalne. J Submikrosc Cytol Pathol. 2006;38:167-174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, obiecujący marker autofagosomalny, jest przetwarzany podczas różnicowania i odzyskiwania podocytów z nerczycy PAN. FASEB J. 2003;17:1165-1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Autofagiawalczy z chorobą poprzez samotrawienie komórkowe. Natura. 2008;451:1069-1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, et al. Wadliwa autofagia wątroby w otyłości sprzyja stresowi ER i powoduje insulinooporność. Metab. 2010;11:467-478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Tworzenie autofagosomów: rdzeń maszynerii i adaptacje. Nat Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Wykrywanie składników odżywczych, autofagia i nefropatia cukrzycowa. Cukrzyca. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H i in. Autofagia: nowy cel terapeutyczny dlanerkachoroby. Clin Exp Nefrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Pojawiająca się rolaautofagiaw funkcjonowaniu nerek, chorobach i starzeniu. Autofagia. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Implikacje autofagii dla starzenia się i choroby kłębuszków. Res. tkanki komórkowej. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K i in. Podocyty utrzymują wysoki podstawowy poziom autofagii niezależnie od sygnalizacji mtor. Autofagia. 2020;16:1932–1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Aktywacja i wydzielanie kalpainy sprzyjają uszkodzeniu kłębuszków nerkowych w eksperymentalnym kłębuszkowym zapaleniu nerek: dowody zkalpastatyna-myszy transgenicznych. J Am Soc Nefrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Specyficzna dla podocytów ekspresja rekombinazy Cre u myszy transgenicznych. Geneza. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M i in. Tłumienie podstawowej autofagii w komórkach nerwowych powoduje chorobę neurodegeneracyjną u myszy. Natura. 2006;441: 885-889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O i in. Tetraspanina CD9 kontroluje migrację i proliferację komórek nabłonka ściennego i progresję choroby kłębuszków nerkowych. Społeczność Nat. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S i in. Receptor naskórkowego czynnika wzrostu sprzyja uszkodzeniu kłębuszków nerkowych i niewydolności nerek w szybko postępującym półksiężycowym zapaleniu kłębuszków nerkowych. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Bezpośrednie działanie endoteliny-1 na podocyty sprzyja stwardnieniu kłębuszków nerkowych w przebiegu cukrzycy. J Am Soc Nefrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. Jądrowy czynnik erytroidalny 2-czynnik 2 związany z podocytem kieruje specyficzną dla podocytów ekspresją receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów g, niezbędnego do oporności na GN półksiężyca. J Am Soc Nefrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R i in. Calpainy uwalniane przez limfocyty T rozszczepiają TLR2 w celu kontrolowania ekspresji IL-17. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. Kalpain/kalpastatynasystem ma przeciwstawne role we wzroście i rozsianiu przerzutów czerniaka. PLoS Jeden. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D i in. Calpains przyczyniają się do naprawy naczyń w szybko postępującej postaci kłębuszkowego zapalenia nerek: potencjalna rola ich eksternalizacji. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E i in. Zabicie Dwóch gniewnych ptaków jednym kamieniem:autofagiaaktywacja poprzez hamowanie kalpain w chorobach neurodegeneracyjnych i nie tylko. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X i in. GPS-CCD: nowatorski program obliczeniowy do przewidywania miejsc cięcia kalpain. PLoS Jeden. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: źródło kalpainy i proteolizy modulacyjnej. Informacje o genomie. 2010;22:202-213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Precyzyjne przewidywanie miejsc cięcia kalpainy i ich odchyleń spowodowanych mutacjami w raku. Przód Genet. 2019;10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I i in. Rozszczepienie Atg5 za pośrednictwem kalpainy przełącza autofagię w apoptozę. Nat Biol. 2006;8:1124-1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. Kontrola podstawowej autofagii przez cięcie ATG5 za pośrednictwem kalpainy1.Autofagia. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Rozszczepienie Beclin za pośrednictwem kalpainy-1 i deregulacja autofagii po uszkodzeniu niedokrwiennym siatkówki in vivo. Śmierć komórki Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S i in. ANG II promujeautofagiaw podocytach. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Transaktywacja receptora naskórkowego czynnika wzrostu przez angiotensynę II w kłębuszkowych podocytach. Nefron Exp Nefrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM i in. Immunohistochemiczna lokalizacja receptora ANG II AT1 u dorosłego szczuranerkaprzy użyciu przeciwciała monoklonalnego. Jestem J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Funkcjonalna ekspresja układu renina-angiotensyna w ludzkich podocytach. Am J Physiol Fizjol nerek. 2006;290:F710–F719.
64. Nagroda Pavenstadt H. Franz Volhard 2000: sygnalizacja angiotensyny II w podocytach. Ciśnienie krwi nerki Res. 2000;23:156-158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Układ renina-angiotensyna-aldosteron w podocytach. Nefrol nasienia. 2012;32:377-384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. Wlew angiotensyny II wywołuje zmiany ekspresji nefryny i apoptozę podocytów. Jestem J Nephrol. 2008;28:500– 507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Kłębuszkowe receptory angiotensyny typu 1 nasilają uszkodzenie nerek i stan zapalny w mysim autoimmunologicznym zapaleniu nerek. J Clin Invest. 2009; 119:943-953.
68. Song K, Stuart D, Abraham N i in. Pobieranie reniny z przewodu nie pośredniczy w nadciśnieniu związanym z solą DOCA ani w uszkodzeniu nerek. PLoS Jeden. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Ochronna rola nokautu śródbłonka kalpain w ostrych indukowanych lipopolisacharydaminerkauszkodzenie poprzez osłabienie szlaku p38-iNOS i produkcji NO/ROS. Exp Mol Med. 2020;52:702– 712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Aktywność kalpainy-10 leży u podstaw indukowanej angiotensyną II produkcji aldosteronu w modelu komórek kłębuszka nadnerczy. Endokrynologia. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Zależna od wapnia proteaza kalpaina-1 łączy aktywność TRPC6 z uszkodzeniem podocytów. J Am Soc Nefrol. 2018;29:2099–2109.
72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. TRPC6 wiąże się i aktywuje kalpainę, niezależnie od jej aktywności kanałowej i reguluje cytoszkielet podocytów, adhezję komórek i ruchliwość. J Am Soc Nefrol. 2019;30: 1910-1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Celowanie w układ kalpaina/kalpastatyna jako nowa strategia zapobiegania przebudowie układu sercowo-naczyniowego w nadciśnieniu indukowanym angiotensyną II. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Kalpastatynakontroluje sepsę wielodrobnoustrojową poprzez ograniczenie uwalniania mikrocząstek prokoagulujących. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M i in. Krytyczna rola równowagi kalpaina/kalpastatyna w ostrym odrzuceniu przeszczepu allogenicznego. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Specyficzne hamowanie kalpainy chroninerkaprzeciw zapaleniu. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY i in. Przywraca hamowanie kalpainyautofagiai zapobiega fragmentacji mitochondriów w ludzkim modelu iPSC endoliopatii cukrzycowej. Rep. Komórek Macierzystych 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. Cięcie in vitro wysokich białek przez proteazy śmierci komórkowej. Autofagia. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Różnicowa regulacja kompleksu kalpaina-kalpastatyna przez domenę Lkalpastatyna. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
