Rozdział 5 Zmiany aktywności enzymu podczas fermentacji enzymu

Rozdział 5 Zmiany aktywności enzymu podczas fermentacji enzymu

 

Proteaza, lipaza idysmutaza ponadtlenkowa (SOD)są głównymi enzymami funkcjonalnymiMikrobiologiczny enzym zdrowia. Wśród nich,proteazaodgrywa rolę wPromowanie hydrolizy białka w żywnościw ludzkim ciele. Ponadto może również rozłożyć niektóre umierające komórki, usunąć brud na powierzchni skóry i porach oraz odgrywać rolę w złuszczaniu, dzięki czemu jest szeroko stosowany w produktach do kąpieli. Lipaza działa na wiązanie estrowe między kwasami tłuszczowymi i glicerolem, a substrat hydrolizy to ogólnie naturalne oleje. Dlatego jest to widoczne w wielu produktach do odchudzania i produktów zdrowotnych. Wiele kobiet jest bardzo zaniepokojonych tematem utraty wagi, dlatego enzymy szybko stały się popularne na całym świecie.Enzymy są bogate w lipazę, co oznacza, że ​​mają one wysoką wartość badań i potencjalnych klientów aplikacji.DARŃjest specjalnym enzymem metalowym, który katalizuje reakcję rozebraniarodniki anionowe nadtlenku, w ten sposóbusuwanie rodników anionowych nadtlenkowychw ciele. Jest to bariera ochronna dla organizmów, więc jest szeroko stosowana w dziedzinie medycyny.
Ten rozdział przyjmuje enzym Apple jako przykład. Zaczynając od początkowego etapu fermentacji,Działania dysmutazy nadtlenkowejAmylaza, lipaza, proteaza i celulazy w grupie eksperymentalnej i grupie kontrolnej mierzono co 15 dni w celu kompleksowego i systematycznego odzwierciedlenia zmieniającego się trendu aktywności enzymu podczas całego procesu fermentacji.

Nowe ziół Cistanche

Kliknij, aby uzyskać więcej szczegółów

 

Wspierająca obsługa Wecistanche-największy eksporter Cistanche w Chinach:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Materiały i metody

5.1.1 Materiały

(1) Materiały eksperymentalne

Umyj świeże jabłka sterylną wodą w sterylnych warunkach, wysusz je naturalnie na sterylnym stole operacyjnym, obieraj je i pokrój do późniejszego użycia. Dodaj biały cukier i jabłka do sterylizowanego szklanego słoika w stosunku masowym 1: 1. Aktywuj bakterie wymagane do eksperymentu i zaszczepiaj je enzymem zgodnie z optymalnym schematem (ten etap operacji jest pominięty dla grupy kontrolnej), uszczelnij ją i umieść w chłodnym i suchym miejscu. Po 3 miesiącach fermentacji temperatury pokojowej weź próbkę, aby uzyskać całą ciecz enzymu zawierającą miazgę i odfiltruj ją. Weź supernatant jako próbkę eksperymentalną. Po odwirowaniu próbki na 10, 000 obr / min przez 15 minut w szybkiej wirówce, służy do pomiaru odpowiednich danych. Warto zauważyć, że w trakcie tworzenia enzymów, aby uniknąć niepotrzebnego zanieczyszczenia, wszystkie nasze operacje przeprowadzono w sterylnych warunkach.

(2) Główne instrumenty
Instrumenty wymagane do eksperymentu są takie same jak 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metody

(1) Określenie aktywności dysmutazy nadtlenkowej (SOD) [66]
Roztwór pirogalolu podgrzewano w łaźnie wodnej o stałej temperaturze o stałej temperaturze przez pewien czas. Zgodnie z tabelą 5.1 do rurki testowej dodano odpowiednią ilość buforu, wody destylowanej i tej samej objętości kwasu solnego lub roztworu pirogalolu. Kąpienia wodne o stałej temperaturze ustawiono na 25 stopni na 2 0 min. Po szybkim wstrząśnięciu mieszanej cieczy natychmiast wstrzyknięto ją do kuwety. Wartość absorbancji A0 próbki mierzono co 30 sekund przy długości fali 325 nm za pomocą spektrofotometru.

Tab.5.1 Dodaj ilość sąsiedniego benzenu odczynnika fenolowego do określania szybkości autoksydacji

 

Metoda określania aktywności SOD jest zasadniczo taka sama jak powyższa operacja. Jedyną różnicą jest to, że przed dodaniem pirogalolu {{0}}. 5 ml roztworu próbki enzymu o różnych stężeniach. Jednocześnie dodaje się tę samą objętość wody destylowanej. Zmierzona absorbancja to ASOD. Szybkość hamowania i aktywność enzymu SOD są obliczane zgodnie z wzorem 5.1 i wzorem 5.2: Szybkość hamowania (%)=(△ A 0- △ ASOD)/△ A 0 × 100 (5.1) Aktywność enzymu (u/ml) =}}}} RATH/50% × V1/V2 × (5.2) gdzie: V1 jest całkowitą objętością rozwiązania, ml; V2 to objętość roztworu próbki enzymu, ML; △ A0 to szybkość automatycznego utleniania pirogalolu; △ ASOD to szybkość zmiany wartości absorbancji próbki; N jest rozcieńczeniem wielokrotne (2) oznaczanie aktywności amylazy W badaniu wykorzystano metodę kolorymetryczną jodu starchą do określenia aktywności amylazy. Konkretne kroki operacji odnoszą się do „Krajowej procedury operacji laboratorium klinicznego” [67]. Jest to głównie podzielone na następujące dwa punkty:

 

① Przygotowanie roztworu
Buforowane rozwiązanie skrobi ({{0}}. 4G/L): Dokładnie waży 9 g chlorku sodu, 22,6 g bezwodnego fosforanu wodoru disodium i 12,5 g bezwodnego fosforowego fosfosfory dihydrogenu potasu, i wyniku dystasu, i wynikającego wody, i wyścig dystasu, i wodoodporne, i wyścig dystasium, i termin dystasium, i wyścig dystasium, i termin. dopóki roztwór się nie zagotuje; Dokładnie zważyć 0,4 g rozpuszczalnej skrobi, rozpuść ją w 10 ml wody destylowanej, wymieszaj równomiernie i dostosuj się do pasty; Wstrzyj roztwór skrobi dostosowany do pasty do powyższego roztworu wrzenia i myj zlewkę wielokrotnie, aż skrobia zostanie całkowicie przeniesiona do wrzącej wody. Po równomiernym mieszaniu szklanym prętem, ostygnie do temperatury pokojowej, dodaj 5 ml 37% roztworu formaldehydu włosów i rozcieńcz do 1L wodą destylowaną. Wartość pH roztworu wynosi 7,0 ± 0,1 i jest umieszczana w lodówce do użycia.
Rozwiązanie podstawowe jodu (0. 1 mol/l): Dokładnie waży 1,7835 g joda potasu i 22,5 g jodku potasu w czystym 500 ml
Zlewka, powoli i równomiernie dodaje 4,5 ml skoncentrowanego kwasu solnego, mieszając ciągle podczas procesu dodawania, rozcieńczają skalę wodą destylowaną i równomiernie mieszaj. Umieść go w lodówce do użytku i przechowuj w brązowej butelce odczynnika.
Rozwiązanie aplikacji jodu ({{0}}. 01mol/l): Weź określoną ilość rozwiązania podstawowego jodu (0,1 mol/l), rozcieńcz go 10 razy wodą destylowaną, umieść do lodówki do użycia i przechowuj do 1 miesiąca.

② Eksperymentalne kroki operacji
Weź roztwór enzymatyczny i rozcieńcz go 10 razy fizjologiczną solą fizjologiczną i działaj zgodnie z tabelą 5.2. Dobrze wymieszaj, długość fali spektrofotometru wynosi 660 nm, a światła ścieżki kolorymetrycznej kubka wynosi 10 mm. Zero z wodą destylowaną i odczytaj absorbancję każdej rurki. Oblicz aktywność amylazy na podstawie podstawowego wzoru obliczeń 5.3.

 

Tab.5.2 Kroki działania określania amylazy

 

(3) Określenie aktywności lipazy

Metodę określenia przeprowadzono zgodnie z QB/T {{0}} [68]. 2% rozwiązanie testowe enzymatyczne przygotowano z 0. 0 Bufor fosforanu mol/l (pH 7,5), fenoloftaleinę zastosowano jako wskaźnik, a kwasy tłuszczowe miareczkowano standardowym roztworem wodorotrydowym sodu. Aktywność lipazy obliczono na podstawie objętości wodorotlenku sodu spożywanego w eksperymencie. Zasada wynosi: przy pH 7,5 i temperaturze otoczenia 40 stopni, 1 ml ciekłego roztworu enzymu hydrolizy lipazy przez 1 minutę w celu wytworzenia 1 μmol kwasu tłuszczowego, który jest jedną jednostką aktywności lipazy, wyrażonej jako U/ml. Następnie aktywność lipazy obliczono zgodnie z wzorem 5.4: aktywność enzymu (u/ml)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × n (5.4) gdzie: B jest objętością standardowego rozwiązania sodu, ML; A jest objętością standardowego roztworu wodorotlenku sodu zużywanego w grupie kontrolnej pustej, ML; C jest stężeniem standardowego roztworu wodorotlenku sodu, mol/L; 0,05 jest współczynnikiem konwersji stężenia roztworu standardowego wodorotlenku sodu; 50 to zawartość kwasu tłuszczowego w roztworze wodorotlenku sodu; 15 minut to czas reakcji; n jest wielokrotnym rozcieńczaniem.

(4) Określenie aktywności proteazy

Patrz GB/T 23527-2009 [69] z niewielkimi modyfikacjami.
① Przygotowanie standardowej krzywej
Weź 1 ml standardowego roztworu tyrozyny o różnych stężeniach masy, które są 0, 1 0, 20, 30, 40 i 50 mg/l oraz dodaj 5 ml 0,4mol/l roztworu węglanu sodu i 1 ml roztworu foliowego odczynnika. Reaguj przez 20 minut w temperaturze 40 stopni. Po zakończeniu reakcji usuń roztwór reakcyjny i zmierz wartość absorbancji roztworu o długości fali 680 nm za pomocą spektrofotometru. Narysuj krzywą standardową tyrozyny o stężeniu tyrozyny jako osi poziomej i wartość absorbancji jako oś pionowej.

Nowe ziół Cistanche z silną siłą przeciwutleniającą

② Określenie aktywności proteazy
Grupa eksperymentalna: Weź 1 ml roztworu kazeiny ze stężeniem 10 g/l i równomiernie wymieszaj z 1 ml roztworu próbki, który ma zostać przetestowany, i reaguj przez 10 minut w temperaturze otoczenia 40 stopni; Filtruj i uzyskaj filtrat po staniu, weź 1 ml filtratu, 5 ml roztworu węglanu sodu i 1 ml odczynnika foliowego, wymieszaj równomiernie i reaguj przez 20 minut w temperaturze otoczenia 40 stopni; Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć wartość absorbancji roztworu o długości fali 680 nm.
Grupa kontroli pustej: weź 1 ml roztworu próbki do przetestowania, dodaj kwas trichlorooctowy, reaguj w pełni, aby inaktywować proteazę, a inne metody działania są takie same jak grupa eksperymentalna.

Oblicz aktywność proteazy zgodnie ze wzorem 5.5:
Aktywność proteazy (u/ml)=AK × 4/10 (5.5) Gdzie: A jest absorbancją roztworu enzymatycznego w grupie eksperymentalnej; K jest ilością tyrozyny, gdy absorbancja jest równa 1; 4 to całkowita objętość roztworu reakcyjnego, ML; 10 to czas reakcji, min.

(5) Określenie aktywności celulazy [70]

Aktywność celulazy w enzymach jest ogólnie wyrażana przez ilość glukozy uwalnianej przez określoną ilość roztworu enzymu na jednostkę czasu. Zasada zastosowania metody bibuły filtracyjnej do pomiaru aktywności celulazy jest to, że celulazy może rozkładać celulozę w bibule filtracyjnym w celu wytworzenia wtórnych metabolitów, takich jak glukoza i glukoza, może reagować z 3, 5- kwas dinakrowoslutycylowy z tworzeniem żółtego kompleksu. Kolor tej reakcji jest stosunkowo jasny, co może dobrze określić ilość wytworzonych glukozy i innych wytwarzanych cukrów redukujących.

 

①3, 5- środek kolorymetryczny kwasu dintrosalicylowy
Dokładnie ważyć 1 0 g z 3, 5- kwas dintrosalicylowy o temperaturze topnienia 168-169, rozpuszczaj go destylowaną wodą, dodaj 20 g wody sodu w wodorotlenku sodu i 200 g fenolatu sodu, kontynuuj podgrzewanie, aż ciał stały zostanie całkowicie rozpuszczony, rozleciany do 500 ml z destylowaną 2G z 2g i 2 fenol. 0,5 g bezwodnego siarczku sodu, mieszaj w sposób ciągły podczas procesu dodawania, aż zostanie całkowicie rozpuszczony, zatrzymaj ogrzewanie po równomiernym zmieszaniu, ostygnąć do temperatury pokojowej, przenieś wszystko do 1000 ml kolby objętościowej, rozcieńczona do znaku destylowaną wodą, umieść w temperaturze pokojowej przez jeden tydzień, filtruj, uzyskać supernatant i przechowuj w brązowej butelce odczynnika.Hydroliza ②enzymatyczna
Dokładnie Pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml roztworu próbki enzymu na 2 ml roztworu buforu octanu kwas-kwas-sodowo o wartości pH 4,5. Po 5 minutach kąpieli wodnej o stałej temperaturze przy 40 stopniach dodaj 6 kawałków bibuły filtracyjnej chromatografii o powierzchni odpowiednio 1 × 1 cm2 i natychmiast rozpocznij czas reakcji do 60 minut. Natychmiast przenieś do wrzącej kąpieli wodnej w celu reakcji przez 10 minut, a celulaza traci swoją aktywność.

 

 

③ Reakcja kolorów
Weź roztwór próbki enzymu, dodaj 3 ml 3, 5- środek kolorymetryczny kwasu dintrosalicylowy przygotowany w ①, ciepło w wrzącej kąpieli wodnej przez 15 minut, wyjmij, ochłód się do temperatury pokojowej, dodaj 10 ml wody destylowanej, równomiernie, użyj spektrofotometru.
④ Rysowanie krzywej standardowej glukozy
Przygotuj dokładnie standardowe rozwiązanie glukozy ze stężeniem 1 mg/ml i użyj wody destylowanej, aby utworzyć standardowe rozwiązanie glukozy z objętością 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1, 1, z 3, 5- środek kolorymetryczny kwasu dintrosalicylowy przygotowany w ① do reakcji rozwoju kolorów. Wykonaj krzywą standardową ze stężeniem glukozy jako osi poziomej i absorbancji jako osi pionowy.
⑤ Calculation
Użyj wartości absorbancji A po rozwoju kolorów z roztworem enzymu, a następnie oblicz ilość uwalniania glukozy M zgodnie z krzywą standardową glukozy i oblicz zgodnie z wzorem 5.6:
Aktywność celulazy (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) gdzie: m to ilość uwalniania glukozy, UG; T jest enzymatyczną hydrolizą, min; M jest zawartością enzymu w reakcji, UG/ML.