Rozdział 2: Czynnik podobny do Krϋppela 15 hamuje proliferację komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych poprzez wzmocnienie koniugacji P53 SUMO1

Po więcej informacji. kontakttina.xiang@wecistanche.com

3. WYNIKI

3.1|Badanie genów wiążących KLF15- przez ChIP-Seq w pierwotnych kłębuszkowych MC

Aby zidentyfikować geny partnera bezpośredniego wiązania KLF15, przeprowadziliśmy analizę ChlP-Seq i ostatecznie przeszukaliśmy 2478 genów. Analiza GO tych genów za pomocą narzędzia na stronie internetowej www.uniprot.org (Rysunek 1A, B) ujawniła terminy dotyczące funkcji molekularnych związane z 1941 genami, terminy dotyczące składników komórkowych związane z 1662 genami oraz terminy dotyczące procesów biologicznych związane z 1766 genami. Ponieważ naszym celem było odkrycie, w jaki sposób KLF15 wpływa na MC, skupiliśmy się na genach związanych z procesami komórkowymi. Spośród 1315 genów związanych z procesem komórkowym, 74 geny uczestniczyły w procesach cyklu komórkowego; w szczególności geny te uczestniczyły w mitotycznym cyklu komórkowym, przejściu fazowym cyklu komórkowego i innych procesach (ryc. 1C, D). Ponadto przeanalizowaliśmy geny zaangażowane we wzrost i odkryliśmy, że są one powiązane ze wzrostem rozwojowym, wzrostem komórek i innymi rodzajami wzrostu (Rysunek 1E).

3.2| Badanie przesiewowe genów o zróżnicowanej regulacji w KLF15-nadeksprymujących MC kłębuszków nerkowych za pomocą SILAC i LC/MS

Analiza SILAC i LC/MS HRMC z nadekspresją KLF15 w porównaniu z komórkami rodzicielskimi doprowadziła do identyfikacji 1357 białek. Wykorzystaliśmy DAVID i IPA do pozyskania domen GO i wzbogaconych szlaków ilościowych białek zidentyfikowanych przez SILAC. Co ciekawe, wiele terminów związanych z funkcjami biologicznymi białek znalazło się wśród 30 najpopularniejszych terminów GO, w tym regulacja komórkowego procesu metabolicznego aminokwasów, kompleksu proteasomu, wiązania białek oraz terminów transkrypcji i translacji, z których wszystkie są ściśle związane z ubikwitynacja (ryc. 2A). Figura 2B przedstawia 30 pierwszych istotnie wzbogaconych terminów szlaku. Kilka terminów dotyczących procesów biologicznych, w tym terminy dotyczące proteasomów i chorób neurodegeneracyjnych, było również powiązanych z ubikwitynacją.

Kliknij, aby dowiedzieć się więcejcistanchena sprzedaż ze szczegółami

3.3|Analiza bioinformatyczna genów wiążących KLF15-, które są potencjalnie związane z proliferacją kłębuszków nerkowych MC

Aby zbadać geny wiążące KLF15-, które są potencjalnie powiązane zkłębuszków nerkowychProliferacja MC, przeprowadziliśmy analizę bioinformatyczną danych ChIP-Seq i SILAC-LC/MS. Przebadano pięćdziesiąt dwa geny (Tabela 2 i Rysunek 2C), a pięć z nich, w tym SUMO1, czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF), eukariotyczny czynnik inicjacji (EIF), insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF) i retikulokalbina (RCN) ), były blisko spokrewnione zproliferacja komórek. Ponieważ analizy GO i szlaków białek o zróżnicowanej ekspresji sugerowały, że przeszukiwane geny były związane głównie z procesem ubikwitynacji, doszliśmy do wniosku, że SUMO1, członek rodziny białek podobnych do ubikwityny (UBL), uczestniczy w modyfikacji potranslacyjnej podobnej do ubikwitynacja jako docelowy gen KLF15.

Coraz więcej dowodów wskazuje, że HG jest jednym z głównych czynników indukujących rozwój nefropatii cukrzycowej i promuje proliferację MC oraz zwiększoną syntezę macierzy in vitro. kłębuszków nerkowych w eksperymentalnym kłębuszkowym zapaleniu nerek.26 Po potwierdzeniu, że MCs były stymulowane przez HG lub PDGF-BB in vitro, wykryliśmy zmiany w ekspresji KLF15 i SUMO1 zarówno w RNA, jak i w białku.

poziomów i odkryli, że te cząsteczki mają podobne trendy (ryc. 2D-1). Ostatecznie ustaliliśmy, że SUMO1 jest genem docelowym KLF15.

3.4|KLF15 zwiększa ekspresję genu SUMO-1 przez wiązanie z regionem promotora CACCCA-SUMO-1 o 16 pz i motywem bogatym w C plus A

Użyliśmy pakietu MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) do scharakteryzowania motywów wiązania KLF15- 52 przebadanych genów z danych KLF15 ChlP-Seq i zidentyfikowaliśmy motyw wiązania KLF (Rysunek 3A). Ponadto przeanalizowaliśmy dalej ponad tysiąc zasad powyżej promotora SUMO1 i odkryliśmy, że KLF15 może rozpoznawać i wiązać się z sekwencją 16 pz (nukleotydy -205~-199), w tym - CACCCA-(Figura 3B).ChIP-PCR potwierdziła, że ​​KLF15 jest związany z promotorem SUMO1, a wyniki wykazały znacząco wyższą ekspresję SUMO1 w grupie z przeciwciałem anty-KLF15 niż w grupie kontrolnej tła (Figura 3C).

Ponadto przeprowadziliśmy test z podwójną lucyferazą reporterową, aby potwierdzić związek ukierunkowania między SUMO1 i KLF15. Grupa promotora SUMO1 typu dzikiego wykazywała wyższą aktywność lucyferazy niż wektor pGL3 i grupy zmutowane w HRMC, a aktywność była znacznie zwiększona przez nadekspresję KLF15. Wzmocnienie aktywności lucyferazy odwrócono przez transfekcję plazmidem wyrażającym zmutowany region promotora (Figura 3D). Podsumowując, dane te sugerują, że SUMO1 jest bezpośrednim celem transkrypcyjnym KLF15.

3.5 |Przesiewanie P53 jako substratu SUMOylacji SUMO1

Modyfikacje SUMO są szeroko wyrażanymi modyfikacjami potranslacyjnymi u eukariontów. Odwracalne sprzęganie tych modyfikacji z białkami substratowymi jest również znane jako SUMOilacja, która odgrywa ważną rolę w regulacji funkcji białek docelowych i dalej uczestniczy w różnych procesach biologicznych, takich jak transport nukleocytoplazmatyczny, regulacja transkrypcji, apoptoza, stabilizacja białek, reakcje na stres i progresja cyklu komórkowego.27 W celu zbadania dalszych cząsteczek sygnałowych bezpośrednio sprzężonych z SUMO1, przeprowadziliśmy analizę sieciową SUMO1 przy użyciu bazy danych IPA, a dane wykazały, że SUMO1 może bezpośrednio sprzęgać się między innymi z P53, APP, JUN i AKT białka (rysunek 4A-C). Początkowo wybraliśmy P53 jako następną cząsteczkę SUMO1, ponieważ jest to dobrze znane białko, które jest ściśle związane z proliferacją komórek.28.29 Ponadto użyliśmy oprogramowania SUMOsp do przewidzenia możliwych sekwencji SUMOilacji różnych gatunków P53 i odkryliśmy, że P53 ma sekwencję SUMOilacji（ Rysunek 4D）. Aby określić, czy P53 jest rzeczywiście modyfikowany przez SUMOilację, przejściowo transfekowaliśmy HRMC plazmidem nadekspresji SUMO1 lub siRNA SUMO1. Zarówno wyniki IP, jak i Western blot ujawniły trendy w zmianach ekspresji SUMO1-P53 i P53, które były zgodne ze zmianami w SUMO1 (Rysunek 4E-J). Dane te wskazują, że P53 jest substratem SUMOilacji SUMO1.

3.6 |KLF15 hamuje proliferację MC poprzez promowanie ekspresji SUMO1 i SUMOilacji P53

Aby ustalić regulację SUMOilacji P53 i proliferacji MC przez KLF15 i SUMO1, interweniowaliśmy z ekspresją KLF15 lub SUMO1 w HRMC i leczyliśmy HRMC PDGF-BB. Wśród HRMC traktowanych PDGF-BB, komórki transfekowane plazmidem z nadekspresją KLF15 wykazywały wyższą ekspresję SUMO1-P53, P53, KLF15 i SUMO1 niż komórki transfekowane plazmidem kontrolnym KLF15. Te same zmiany w SUMO1-P53, P53 i SUMO1 stwierdzono w komórkach transfekowanych plazmidem z nadekspresją SUMO1, podczas gdy ekspresja KLF15 pozostała niezmieniona w tych komórkach (Figura 5A-F). PDGF-BB jest jednym z najskuteczniejszych opisanych dotychczas czynników wzrostu MC i zaobserwowano odpowiedź proliferacyjną HRMC na PDGF-BB. Jak pokazano na Figurze 5G, H, odsetek komórek EdU-dodatnich był znacząco zwiększony po podaniu rekombinowanego PDGF-BB. Wyniki barwienia EdU wykazały, że zarówno nadekspresja KLF15, jak i SUMO1 hamowała proliferację komórek indukowaną przez PDGF-BB (Figura 5G, H).

Aby uzyskać głębszy wgląd w rolę KLF15 i SUMO1 w proliferacji HRMC, transfekowaliśmy komórki tylko siRNA SUMO1 lub kotransfekowaliśmy je siRNA SUMO1 i plazmidem nadekspresji KLF15. Regulacja w dół SUMO1 nie wpłynęła na ekspresję KLF15, ale poziomy ekspresji SUMO1-P53 i P53 były oczywiście zmniejszone po transfekcji SUMO1 siRNA (Figura 6A-C). Ponadto, gdy ekspresja SUMO1 została zahamowana, poziomy ekspresji SUMO1-P53 i P53 były również tłumione nawet w komórkach z nadekspresją KLF15 (Figura 6D-F). Następnie proliferację MC oceniano przy użyciu testu barwienia EdU. SUMO1 RNAi wzmocnił efekt proliferacyjny PDGF-BBon HRMC, a grupa kotransfekowana plazmidem nadekspresji KLF15 i siRNA SUMO1 miała więcej komórek EdU-dodatnich niż grupa kotransfekowana plazmidem nadekspresji i siRNA kontrolnym sekwencji hybrydowej (Rysunek 6G, H) . W związku z tym wnioskujemy, że KLF15 hamuje proliferację MC poprzez zwiększenie SUMOilacji P53.

3.7|Globalna ekspresja SUMO1 i P53 w kłębuszkowych MC jest ujemnie skorelowana z proliferacją MC w zapaleniu nerek szczura Thy-1

Zapalenie nerek Anti-Thy1 jest klasycznym modelem samoograniczającego się mezangialnego proliferacyjnego kłębuszkowego zapalenia nerek z fazą proliferacyjną i fazą zdrowienia. Aby stworzyć ten model, wstrzyknęliśmy przeciwciało Thy1 szczurom Wistar. Zarówno azot mocznika w surowicy jak i kreatynina nie wykazują znaczących zmian pomiędzy szczurami kontrolnymi a szczurami modelowymi (Figura S1). W fazie proliferacyjnej (dni 5 i 7) u szczurów modelowych zaobserwowano wyraźną proliferację mezangialną i akumulację ECM, a liczba MC zmniejszyła się podczas fazy zdrowienia w dniu 10 (Figura 7A). Wykryliśmy również zmiany ekspresji w markerze proliferacji komórek PCNA przez IHC (Figura 7A, B). Poziomy PCNA wzrosły w 5 dniu, osiągnęły szczyt w 7 dniu i spadły w 10 dniu (Figura 7F). Analiza Western blot wykazała, że ​​ekspresja białek P53, SUMO1 i KLF15 w izolowanych kłębuszkach była niższa w grupach modelowych niż w grupie kontrolnej (Figura 7C, D), zgodnie z wynikami immunohistochemicznymi (Figura 7E, F). Wyniki te wskazują, że nieprawidłowa proliferacja MC u szczurów modelowych anty-Thy1 jest związana z niskim poziomem ekspresji KLF15 i SUMO1. Oczekuje się, że zakłócanie ekspresji tych cząsteczek złagodzi patologiczny fenotyp u szczurów.

4. DYSKUSJA

Thekłębuszkisą jednostki filtrującenerka. Zaburzenie czynności kłębuszków może być spowodowane pierwotną patologią kłębuszków lub może być wtórne do chorób ogólnoustrojowych. Zmiany mezangialne zaobserwowano po uszkodzeniu kłębuszków nerkowych, w tym hiperproliferacji MC, po której nastąpiło nadmierne wytwarzanie ECM (ekspansja mezangialna) i wytwarzanie chemoatraktantów dla komórek zapalnych. Dlatego modulacja odpowiedzi MC, zwłaszcza nieprawidłowej proliferacji, jest nowym podejściem terapeutycznym. KLF15 to białko, które odgrywa rolę regulatorową jako czynnik transkrypcyjny, wiążąc się z określonymi sekwencjami DNA. Wiele badań donosiło, że KLF15 bierze udział w regulacji proliferacji komórek. Na przykład stwierdzono, że KLF15 uczestniczy w hamowaniu szlaków sygnałowych związanych z proliferacją MC,15,30, ale jego bezpośredni gen docelowy nie został opisany w literaturze. W związku z tym badanie to obejmowało głównie wspólne badania przesiewowe poziomów transkrypcji i translacji w celu zidentyfikowania bezpośredniego genu docelowego KLF15.

KLF15 reguluje różne geny u różnych gatunków oraz w różnych tkankach i narządach. W procesie regulacji proliferacji MC, KLF15 wpływa na ekspresję wielu genów i uczestniczy w wielu szlakach.131,32 Do zbadania bezpośrednich genów docelowych KLF15 użyliśmy ChIP-Seg.Klein RH i jego współpracownicy wykorzystali ChlP-seq technologii do badania regulacji KLF7 na różnicowanie komórek nabłonka rogówki.33 Ying M i wsp. wykorzystali tę technikę do zbadania hamującego wpływu KLF9 na pluripotencję glejaka.34 W porównaniu z chipem ChlP, ChIP-Seq umożliwia prawdziwą analizę całego genomu z wyższą rozdzielczością, wyższą czułością wykrywania i niższym zapotrzebowaniem na wielkość próbki.35 Użyliśmy ChP do uzyskania fragmentów DNA bezpośrednio związanych przez KLF15, a po porównaniu i analizie z GenBank przeszukaliśmy 2478 możliwych genów docelowych. Poprzez GO i analizy szlaków zidentyfikowaliśmy wiele genów docelowych zaangażowanych w cykl komórkowy i procesy proliferacji.

Eksperymenty ChlP-Seq wymagają PCR do amplifikacji sygnału detekcji, a pewien stopień odchylenia podczas procesu amplifikacji jest nieunikniony. Ponadto ChIP-Seq uzyskuje tylko geny, które może wiązać KLF15 i nie wskazuje zmian, jakie zachodzą w ekspresji tych genów, gdy zmienia się ekspresja KLF15. Wykorzystaliśmy analizę proteomiczną SILAC-LC/MS, aby zrekompensować te niedociągnięcia. Technika ta dostarcza informacji na temat wszystkich białek, których ekspresja zmienia się po regulacji przez KLF15, w tym białek regulowanych bezpośrednio przez KLF15 oraz białek regulowanych pośrednio lub modyfikowanych potranslacyjnie. HRMC hodowano przy użyciu SILAC, a KLF15 ulegał nadekspresji w komórkach poprzez transfekcję plazmidem. Białka zebrano do detekcji LC/MS i otrzymano 1357 białek o zróżnicowanej ekspresji. Analizy GO i szlaków wykazały, że niektóre z białek o zróżnicowanej ekspresji były zaangażowane w ubikwitynację. Dane dotyczące genu i białka zostały przecięte. Usunięto geny niezwiązane z celem badawczym oraz geny nieregulowane bezpośrednio przez KLF15; ostatecznie przebadano 52 geny. Spośród nich wybrano pięć genów o najbardziej oczywistych różnicach w ekspresji, które były najściślej związane z proliferacją. Biorąc pod uwagę połączone wyniki analizy szlaku, analizy ekspresji SUMO1 i KLF15 w testach proliferujących HRMC, ChlP-PCR i podwójnej lucyferazy, wybrano białko SUMO1 jako gen docelowy KLF15.

Oprócz ubikwityny identyfikuje się coraz większą liczbę białek UBL,3637, w tym SUMO,38, wykazujących ekspresję neuronalnych komórek prekursorowych, zahamowany rozwój 8(NEDD8)3940 i stymulowany interferonem gen 15(ISG15),41. Te modyfikujące białka silnie regulują różnorodne procesy biologiczne. Kowalencyjne dodanie SUMO do substratów, określane jako SUMOilacja, jest modyfikacją potranslacyjną zaangażowaną w szereg procesów komórkowych, w tym transport jądrowo-cytozolowy, regulację transkrypcji, apoptozę, kontrolę stabilności białek, reakcje na stres i progresję cyklu komórkowego. przyłączone do akceptorowych reszt lizynowych substratów białkowych zawierających sekwencję konsensusową i przyczynia się do regulacji interakcji białko-białko, a także do przedziałalizacji subkomórkowej i stabilności białka.2 sUMO1, jako członek rodziny SUMOS, może wpływać na proliferację komórek poprzez modyfikację substratu oraz stabilizujące białka regulujące cykl komórkowy.43 Dlatego w połączeniu z raportem literaturowym oraz wynikami kompleksowych badań przesiewowych i analiz skupiliśmy się na tym, jak KLF15 reguluje wpływ SUMO1 na proliferację komórek mezangialnych.

Aby zidentyfikować substraty SUMO1, przeprowadziliśmy analizę sieciową SUMO1 przy użyciu bazy danych IPA i oprogramowania SUMOsp. W połączeniu z opublikowanymi badaniami nad P53, nasze wstępne dane z badań przesiewowych sugerowały, że P53 jest cząsteczką typu downstream SUMO1 z sekwencją SUMOilacji YKxD/E. Wcześniejsze badania wykazały, że P53 był substratem SUMOilacji,45 a wzmocniona koniugacja P53 SUMO1 promowała stabilność i aktywność P53 oraz indukowała starzenie. SUMO1-P53 i P53, co wskazuje, że P53 był substratem SUMOilacji SUMO1.

Pojawiające się dowody wskazują, że SUMOilacja i de-SUMOilacja odgrywają rolę w wielu chorobach nefropatycznych, takich jak dysgenezja nerek, rak nerek, choroba kłębuszków nerkowych, apoptoza podocytów i hipertoniczność rdzenia nerki, ostre uszkodzenie nerek i kamica nerkowa.7-51 związek między KLF15, SUMO1, SUMOilacją P53 i proliferacją MC, przeprowadziliśmy serię zabiegów transfekcyjnych na komórkach, które przeszły proliferację indukowaną przez PDGF-BB. Nadekspresja KLF15 zwiększała ekspresję SUMO1, podczas gdy nadekspresja SUMO1 nie wpływała na ekspresję KLF15. Nadekspresja KLF15 lub SUMO1 zwiększała SUMOilację P53 i antagonizowała proliferację komórek indukowaną przez PDGF-BB. Kiedy ekspresja SUMO1 została zahamowana, SUMOilacja P53 została również zahamowana, a KLF15 stracił swój antagonistyczny wpływ na proliferację komórek. In vivo. proliferacja MCs stopniowo wzrastała wraz z nasileniem mezangialnego proliferacyjnego zapalenia nerek, podczas gdy ekspresja KLF15, SUMO1 i P53 znacznie spadła. Biorąc pod uwagę zintegrowane obserwacje w komórkach i tkankach, wstępnie wnioskujemy, że KLF15 reguluje SUMOilację P53 przez SUMO1, tym samym hamując proliferację MC.

5. WNIOSKI

Niektóre badania wykazały, że KLF15 odgrywa ważną rolę w regulacji proliferacji MC. W tej pracy zbadaliśmy mechanizmy hamowania proliferacji MC za pośrednictwem tego czynnika transkrypcyjnego. Zidentyfikowaliśmy SUMO1 jako główny cel KLF15 w MC poprzez analizy bioinformatyczne obejmujące ChIP-Seq i SILAC-LC/MS. Ponadto za pomocą bazy danych IPA i oprogramowania SUMOsp ustaliliśmy, że P53 jest bezpośrednim substratem SUMO1. Doświadczenia in vitro i in vivo potwierdziły, że KLF15 może promować ekspresję SUMO1 i SUMOilację P53, a następnie hamować proliferację MC (Figura S2). Wyniki te przyczyniają się do zrozumienia regulacyjnej roli KLF15 w proliferacji MC i dostarczają teoretycznej podstawy do znalezienia nowych metod leczenia chorób nerek związanych z proliferacją MC.