Profile chemiczne i badanie metabolitów surowego i przetworzonego Cistanche Deserticola u szczurów według UPLC-Q-TOF-MSE

Kontaktowy adres e-mailtina.xiang@wecistanche.compo więcej informacji

Abstrakcyjny

Tło: Przetwarzanie chińskiej materia medica to wyróżniająca się i unikalna technika farmaceutyczna w Tradycyjnej Medycynie Chińskiej (TCM) stosowana do zmniejszania skutków ubocznych i zwiększania lub nawet zmiany skuteczności terapeutycznej surowych ziół. Zmiany w podstawowych składnikach wywołane przez zoptymalizowaną procedurę przetwarzania są przede wszystkim odpowiedzialne za zwiększoną skuteczność roślin leczniczych. Orzeźwiający efekt nerkowo-yang parzony z winem ryżowymCistanche deserticola(C.deserticola) była silniejsza niż surowa C.deserticola (CD).

Metody: Analiza porównawcza została przeprowadzona przy użyciu UPLC-Q-TOF-MS' z platformą informatyczną UNIFl w celu określenia wpływu przetwarzania. Przeprowadzono badania in vitro w celu scharakteryzowania składników, a takżemetabolityin vivo. Składniki chemiczne oznaczono w CD i jego przetworzonych produktach. Przeprowadzono wielowymiarowe analizy statystyczne, aby ocenić różnice między nimi, podczas gdy OPLS-DA zastosowano do parowania porównania CO.

Wyniki: Wyniki tego badania ujawniły znaczne różnice w glikozydach fenyloetanoidowych (PhG) iirydoidypo przetworzeniu. W ekstraktach CD i jego przetworzonym produkcie wykryto w sumie 97 związków. PhG zawierające grupę 4-O-kafeoilową w części 8-O- -D-glukopiranozylowej, takie jak akteozyd, cistanozyd C, kamneozyd II, osmantuzyd zmniejszyły się po przetworzeniu, podczas gdy PhG z 6' Wzrosła grupa -O-kafeoilowa w części 8-O- -D-glukopiranozylowej, taka jak izoacetozyd, izocystanozyd C, izokampneozyd 1, izomartynozyd, zwłaszcza w grupie CD-NP. Wzrosła również intensywność echinakozydu i cistanozydu B, których struktura zawiera ugrupowanie 6'-O- -D-glukopiranozylowe. W badaniu in vivo w osoczu, kale i moczu szczurów wykryto 10 prototypowych składników i 44 metabolity. Uzyskane wyniki wykazały, że przetwarzanie prowadzi do znacznej zmienności składu chemicznego CD i wpływa na rozmieszczenie związków in vivo, a procesy metaboliczne fazy są kluczowymi kaskadami każdego związku, a większość metabolitów jest związana z echinakozydem lub akteozyd.

Wnioski: To pierwsze globalne badanie porównawcze surowych i przetworzonych płyt CD. Odkrycia te poszerzają naszą wiedzę na temat wpływu przetwarzania CD i dostarczają ważnych danych do przyszłych badań skuteczności.

Słowa kluczowe: Cistanche deserticola, przetwarzanie, UPLC-Q-TOF-MS5, profile chemiczne, metabolity in vivo

Wstęp

Przetwarzanie chińskiej materii medica (CMM) wykazało znaczące zastosowanie w praktyce klinicznej tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) i od kilku stuleci jest uważane za realne leczenie. Jest to unikalna technologia farmaceutyczna wywodząca się z teorii TCM. Po przetworzeniu zidentyfikowano znaczące różnice w wyglądzie, składnikach chemicznych, właściwościach i znaczeniu medycznym wszystkich rodzajów TCM, co prowadzi do założenia, że ​​przetwarzanie może poprawić skuteczność lub zmniejszyć toksyczne działanie TCM.

Przez setki lat,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong po chińsku, CD) jest powszechnie stosowany w praktyce klinicznej TCM w celu uzupełnienia funkcji nerek. Pomaga również w nawilżaniu jelit, co prowadzi do rozluźnienia jelit [1].Cistanchezostał po raz pierwszy nagrany w ShenNongBencaoJing. Powszechnie występuje w suchych i półsuchych siedliskach w całej Eurazji i Afryce Północnej, w tym w Iranie, Chinach, Indiach i Mongolii [2]. Przetwarzanie CD przeprowadzono przez gotowanie na parze z winem ryżowym pod normalnym ciśnieniem, co jest metodą otrzymywania udokumentowaną w chińskiej farmakopei (Jiucongrong w języku chińskim, dalej zwanym „CD-NP”). A parowanie płyt CD z winem ryżowym pod wysokim ciśnieniem jest bardziej efektywną metodą przygotowania (zwaną dalej „CD-HP”) [3, 4]. W kilku badaniach ujawniono, że działanie farmakologiczne CD różni się od jego przetworzonych produktów [5]. CD może tonizować yang nerek i rozluźniać jelita, natomiast po parowaniu z winem ryżowym efekt uzupełnienia yang nerek byłby wzmocniony. We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że CD-NP może wzmacniać tonifikację nerek i wspierać yang oraz łagodzić efekt nawilżania jelit i wypróżniania [6–8]. W praktyce klinicznej najczęściej stosowaną formą są produkty przetworzone.

Do chwili obecnej w kilku badaniach przeanalizowano chemiczne składniki CD, a następnie wyizolowano i zidentyfikowano ponad 100 związków [9–11], takich jak glikozydy fenyloetanolowe (PhG),irydoidy, lignany i oligosacharydy jako jego główne składniki chemiczne. Doniesiono również, że istnieje wiele działań farmakologicznych PhG, w tym immunomodulujące, neuroprotekcyjne, hepatoprotekcyjne, przeciwzapalne, antyoksydacyjne itp.[12–14]. Irydoidy wykazują działanie przeciwzapalne [15, 16]. Wcześniejsze badania wykazały również, że niektóre składniki chemiczne wykazywały zmienność podczas przetwarzania [17–20]. Na podstawie tych raportów można założyć, że przetwarzanie końcowe, zmiany składu chemicznego prowadzą do różnych efektów farmakologicznych, które wymagają dalszych badań.

W niniejszym badaniu do analizy porównawczej przeprowadzono czułą i skuteczną metodę, tj. ultrawysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), oraz przeprowadzono badania in vitro w celu analizy jakościowej ekstraktów CD, CD-NP i CD-HP w celu wyjaśnienia ich profili chemicznych. Generalnie za skuteczne składniki uważano egzogenne substancje chemiczne o wysokim narażeniu w narządach docelowych. Dlatego u szczurów CD i jej przetworzone produkty podawano odpowiednio doustnie, po czym następowała ich charakterystyka. Istniejące badanie ujawnia po raz pierwszy badanie porównawcze (zarówno in vitro, jak i in vivo) surowej i przetworzonej płyty CD. Uzyskane wyniki poszerzyłyby naszą wiedzę na temat wpływu obróbki CD, co może być pomocne w dalszych badaniach.

Materiały i metody

Materiały

Standardowe związki ajugolu (180120) i 2'-acetyloacetozydu (M0601AS) zostały dostarczone przez Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Chiny). Cistanoside F (MUST-17022620), echinakozyd (D1105AS), cistanoside A (M0906AS) i izoakteozyd (M0106AS) zostały dostarczone przez firmę Must (Syczuan Chiny);akteozyd (O0618AS), salidrozyd (J0526AS), katapol (S0728AS), genipozyd (A0407AS) i kwas genipozydowy (MB6001-S) zostały nabyte od Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd (Dalian, Chiny).8-kwas oksyloganowy (B31123) został uzyskane od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Chiny. Metanol i acetonitryl były klasy MS i otrzymano je z Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy. Kwas metanowy (CH,O) o czystości HPLC został dostarczony przez Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy). Woda wykorzystana w istniejącym badaniu była przetwarzana w systemie Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, MA, USA). Wino ryżowe dostarczyła firma Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Chiny).

Cistanch deserticola została zebrana z Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Próbki zostały zidentyfikowane przez prof. Yanjun Zhai (szkoła farmacji, Liaoning University of TCM). Próbki zostały przekazane na Uniwersytet Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Liaoning.

Zwierząt

Samce szczurów Sprague–Dawley (klasa SPF) o całkowitej masie ciała 180–220 g zostały dostarczone przez Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, numer licencji: SCXK-2015–0001). Szczury te były trzymane w pomieszczeniu hodowlanym o dobrze utrzymywanej temperaturze i wilgotności, tj. 20-26 stopni, 50-70 procent przez tydzień. Przed eksperymentami szczury karmiono zwykłym pokarmem laboratoryjnym i wodą. Zwierzęta pościły przez noc, jednakże wodę ad libitum dostarczano przed eksperymentem. Szczury zostały uśmiercone z 10 procentami znieczulenia wodzianem chloralu. Instytucjonalny Komitet ds. Etyki Zwierząt Wojewódzkiego Szpitala Medycyny Chińskiej w Liaoning zatwierdził wszystkie protokoły eksperymentalne (2019.3.25, 2019015).

Przygotowanie ekstraktu CD, CD‑NP i CD‑HP

CD-NP, CD-HP wytworzono z tej samej partii Cistanch deserticola. W celu przygotowania CD-NP, suche kawałki CD (grubość 5 mm, 100 g) zwilżono winem ryżowym (30 ml) i poddano obróbce parą w 100 stopniach przez 16 godzin, a następnie suszono w 55 stopniach w piecu suszarniczym. Natomiast CD-HP przygotowano przez infiltrację suchych kawałków CD (grubość 5 mm, 100 g) winem ryżowym (30 ml), a następnie parowanie pod ciśnieniem atmosferycznym 1,25 przez 4 godziny. a następnie suszono w suszarce w 55 stopniach .

W 100 ml kolbie pomiarowej jeden gram proszku przesiano przez sito nr 4, a następnie dodano 50% metanolu (50 ml), a następnie szczelnie przykryto i mieszano. Tę mieszaninę ważono, a następnie pół godziny. maceracja. Po maceracji mieszaninę poddano działaniu ultradźwięków (moc 250 W, częstotliwość 35 kHz) przez 40 min, a następnie ochłodzono i ponownie zważono. Ubytek masy uzupełniono 50% metanolem, odpowiednio wymieszano i pozostawiono do odstania, a następnie przesączono supernatant, a następnie wykorzystano otrzymany przesącz jako roztwór testowy.

Analiza MSE aktywnych składników

Przygotowanie substancji wzorcowych: tubulozyd-A (3,02 mg), echinakozyd (3,00 mg), 2'-acetyloakteozyd (2,34 mg), akteozyd (2,45 mg), izoakteozyd (0,61) mg), cistanozyd-F (2,14 mg), salidrozyd (3,39 mg), genipozyd (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katapol (2,39 mg), kwas genipozydowy (2,56 mg) i 8-epideoksylogan kwas (2,34 mg) dodano do 10 ml kolby miarowej, dodano stałą objętość metanolu do skali, skonfigurowano do odpowiedniego stężenia roztworu odniesienia. Każdą ze 100 μl skonfigurowano w mieszanym roztworze odniesienia.

Warunki analizy MS: Wartość masy Te została skorygowana przed eksperymentem i zastosowano tryb jonów ujemnych. Zakres mas wynosił 50–1200 Da, a próbka była wstrzykiwana za pomocą przepływowej pompy wtryskowej. Prędkość stożka wynosiła 100 l/h, szybkość przepływu rozpuszczalnika ustawiono na 800 l/h. Napięcia kapilary i stożka zostały ustalone odpowiednio na 2500 i 40 V. Temperatura źródła jonów i gazu rozpuszczalnikowego wynosiła odpowiednio 100 stopni i 400 stopni, a częstotliwość akwizycji sygnału 0,5 S−1.

Analiza UPLC-Q-TOF-MS ekstraktu CD (15-16 min), 65% do 55% A (16-18 min). Szybkość przepływu wynosiła 0.3 mL min-1, podczas gdy temperatura pomieszczenia autosamplera i kolumny osobno 30 stopni i 8 stopni. Objętość wtrysku wynosiła 1,0 µl.

Ocenę spektrometrii masowej przeprowadzono za pomocą Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), obejmującego źródło ESI. Szybkość przepływu azotu ustalono na 800 l·godz.-1 przy temperaturze 400 stopni, temperaturę źródła ustalono na 100 stopni, a gaz stożkowy ustawiono na 50 l godz.-1. Napięcie stożka i kapilary wyregulowano odpowiednio na 40 i 2000 V. Energia zderzenia rampy została wykorzystana w zakresie 20–30 V. Dane centroidowane wszystkich próbek uzyskano w zakresie od 50 do 1200 Da, przy 5-czasie skanowania wynoszącym 0,5 s w czasie analizy 10 min . Do walidacji precyzji masy wykorzystano LockSpray TM. Jako masę blokującą zastosowano jon Te [M–H]− enkefaliny leucynowej (200 pg·μL−1 szybkość wlewu 10 μL min−1) przy m/z 554,2615. Oprogramowanie MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) zostało wykorzystane do obliczenia dokładnej masy, składu jonów prekursorowych i obliczenia jonów fragmentarycznych.

Analiza danych na platformie Masslynx

Ponadto w oparciu o literaturę utworzono własną bibliotekę zawierającą nazwę związku, jego strukturę i wzór cząsteczkowy (w mol.). Wszystkie związki zostały zapisane w specjalnym szablonie wykonanym w Excelu. Ponadto pliki mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, USA) i pliki Excel wszystkich poszczególnych struktur złożonych zostały również zapisane na lokalnym komputerze. Ustalony arkusz Excel zawierający ważne dane został bezpośrednio zaimportowany do biblioteki naukowej w UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Wielka Brytania wykorzystano do oceny cech strukturalnych, w szczególności charakterystycznych fragmentów i fragmentacji MS. Minimalna powierzchnia piku 500 została ustawiona dla detekcji piku 2D. Podczas ujawniania pików 3D wybrano intensywność pików o niskiej energii, wynoszącą ponad 300 zliczeń, oraz intensywność pików o podwyższonej energii, wynoszącą ponad 80 zliczeń. Stwierdzono, że błąd masy wynosi do ±10 ppm dla znanych związków, a tolerancję czasu retencji ustalono w zakresie ±0,1 min. Wybraliśmy addukty ujemne zawierające -H plus HCOOH. Przetwarzanie surowych danych uzyskanych z MS przeprowadzono za pomocą usprawnionego oprogramowania UNIFI, aby szybko wskazać składniki chemiczne, które spełniały standardy, dzięki własnej bazie danych i własnej Bibliotece medycyny tradycyjnej.

Następnie, aby zweryfikować strukturę chemiczną każdego związku docelowego, izomery rozróżniono na podstawie ich charakterystycznych wzorów fragmentacji MS, które ujawniono w opisywanych badaniach, oraz porównując czasy retencji wzorców odniesienia.

Analiza metabolomiczna oparta na wielowymiarowej analizie statystycznej

Przed przetworzeniem danych surowych ustawiono takie parametry jak masa w zakresie od 150 do 1200 Da, zakres czasu retencji (0 do 20 min), intensywność progowa ( 2000 zliczeń), tolerancja masy, tj. 5 MDA, podczas gdy okno masy i czasu retencji wynosiło odpowiednio 0,20 min i 0,05 Da. W kolejnej liście bazy danych identyfikatorem jonów były RT-m/pary z uwzględnieniem czasów ich elucji. Te same wartości RT i m/z w różnych partiach próbek uznano za ten sam związek.

Przeprowadzono wielowymiarową analizę statystyczną w celu oceny skutecznych biomarkerów, które znacząco przyczyniły się do różnic między różnymi grupami. Podczas analizy zastosowano analizę głównych składowych (PCA) w celu wskazania maksymalnych różnic i rozpoznawania wzorców w celu uzyskania przeglądu i klasyfikacji. OPLS-DA to narzędzie do modelowania, które zapewnia wizualizację predykcyjnego obciążenia komponentu OPLS-DA w celu wspomagania oceny modelu. Do oceny oceny różnych komponentów zastosowano zmienne znaczenie dla projekcji (VIP), ametabolitywith VIP values>1.0 i wartość P<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Doświadczenia na zwierzętach Szczury zostały losowo podzielone na cztery grupy (n=6 dla każdej grupy), a następnie podano doustnie różne ekstrakty: (1) Ślepa grupa kontrolna: szczurom podano normalną sól fizjologiczną (2 ml/100 g) ; (2) grupa CD: szczurom podawano ekstrakt CD (2 ml/100 g); (3) grupa CD-NP: szczurom podawano ekstrakt CD-NP (2 ml/100 g); (4) Grupa CD-HP: szczurom podawano ekstrakt CD-HP (2 ml/100 g). Dalszą kategoryzację wszystkich grup przeprowadzono na trzy podgrupy odpowiednio dla osocza, moczu i kału. Dwie godziny później każdemu szczurowi podano doustnie taką samą i równą ilość ekstraktów.

Po podaniu próbki krwi pobierano po 1.0 godzinie, 2.0 godzinie i 4.0 godzinie w heparynizowanych probówkach polietylenowych o pojemności 1,5 ml (z żył oczodołowych) , a następnie wirowanie (przy 4500 obr./min) wszystkich próbek przez 15 min.

W przypadku próbek moczu i kału szczury trzymano w klatkach metabolicznych, a następnie pobierano próbki moczu i kału przez 24 godziny po podaniu. Odwirowanie próbek moczu prowadzono przy 4500 obr./min przez 15 min, podczas gdy próbki kału suszono w cieniu, mielono na proszek, następnie pobierano 0,2 g i dodawano do 0,5 ml soli fizjologicznej roztworu, ultradźwięki przez 5 min i wirowanie przy 12 000 obr./min przez 15 min. Wszystkie biopróbki trzymano w temperaturze -80 stopni do czasu analizy.

Przygotowanie próbek biologicznych. Próbki osocza, moczu i kału dodano z 3 objętościami metanolu, a następnie worteksowano przez 3 min. Następnie wirowano (przy 12,000 obr./min) mieszanin przez 10 min, po czym przeniesiono supernatant do probówki EP, a następnie osuszono azotem w temperaturze 37 stopni. Ponadto dodano 200 µl roztworu HCN–H2O (50 procent). Dziesięć, do mieszania użyto wiru (1 min), a następnie odwirowano (przy 12 000 obr./min) przez 5 min. Supernatant (5 µl) traktowanych próbek wstrzyknięto do systemu UPLC-Q-TOF-MSE.

Warunki chromatografii cieczowej i spektrometrii masowej Analiza dlametabolityprzeprowadzono również za pomocą przyrządu Waters UPLC za pośrednictwem interfejsu ESI. Rozdziały przeprowadzono przy użyciu kolumny Acquity UPLC HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm), fazą ruchomą był 0,1% kwas mrówkowy (A): Acetonitryl (B), Warunki elucji gradientowej to 0-3 min (99,8 procent →98 procent A).3-5 min (98 procent →95 procent A),5-8 min (95 procent →90 procent A), { {18}} min (90 procent →85 procent A), 12-17 min (85 procent →70 procent A), 17-22 min (70 procent →60 procent A), 22-23 min (60 proc. →58 proc. A), 23-25 min (58 proc. A), 25-32 min (58 proc. →45 proc. A) i 32-37 min (45 proc. →35 proc. A) ), 0,4 ml min-1 było szybkością przepływu. Temperaturę kolumny i pomieszczenia próbki ustawiono odpowiednio na 40 stopni i 8 stopni. Zastosowano warunki spektrometrii masowej wymienione powyżej.

Strategia systematycznej analizy metabolitów w próbkach biologicznych Do przetwarzania danych wykorzystano oprogramowanie UNIFI (1.8.2). Do identyfikacji skutecznych metabolitów zastosowano funkcję Binary Compare. Oceniane metabolity nie występowały w równoważnej próbce kontrolnej lub występowały przy niskim natężeniu jonów. Próg względnej intensywności ustalono na 3 lub 5, a metabolity spełniające podkreślone kryteria można było ocenić. Wspólne i przewidywalne metabolity zostały następnie określone przez EIC. Do poszukiwania metabolitów dwufazowych zastosowano funkcję NLF. Na przykład w oprogramowaniu UNIFI parametry można ustawić na 176.0321 w celu wyszukiwania możliwych koniugatów kwasu glukuronowego. Po przetworzeniu, w metodzie można ustawić lub zidentyfikować stratę neutralną. MassFragment został wykorzystany do określenia lub scharakteryzowania struktur wykrytych metabolitów, funkcja interpretacji spektralnej UNIFI jest główną funkcją wykorzystywaną do analizy wtórnej fragmentacji składników macierzystych. Ta funkcja może być wykorzystana do szybkiej weryfikacji ścieżki fragmentacji, jeśli jest to uzasadnione.

Wyniki

Zasada fragmentacji masy glikozydów fenyloetanoidowych i irydoidów

Glikozydy fenyloetanoidowe są głównymi składnikami chemicznymi CD. Standardowe roztwory izoakteozydu,

Pobrano cistanozyd F, tubulozyd A, echinakozyd, akteozyd i 2'-acetylo-akteozyd, po czym podano inny poziom energii zderzeń (tabela 1), a następnie otrzymano odpowiednie mapy MS2 (ryc. 1).

Analiza spektrometrii masowej wykazała, że ​​glikozydy fenyloetanoidowe mają podobne wzorce fragmentacji widma masowego, szlaki rozszczepiania w trybie jonów ujemnych obejmują głównie (1) rozszczepienie wiązania estrowego: utrata obojętnej grupy kawoilowej (C, H, O162.03) i obojętnego acetylu grupa (C, H, O,42.00);(2) Rozszczepienie glikozydowe: utrata obojętnych reszt ramnozy (C.HIO, 146,05) i obojętnych reszt glukozy (CgHO,162.05). Ze spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości można odróżnić resztę caffeoil (162.03) i glukozę (162.05).

Pobrano standardowe roztwory irydoidów ajugol, catalpol, kwas genipozydowy, genipozyd i 8-epide kwasu oksyloganowego, a następnie podano różne energie zderzeń i otrzymano odpowiednie mapy MS (ryc. 2).

Glikozydy irydoidalne mają podobne wzorce fragmentacji widma masowego, szlaki rozszczepiania w trybie jonów ujemnych obejmują głównie (1) rozszczepienie glikozydowe: Utrata obojętnej reszty glukozy (CHoO, 162.05); (2) Utrata obojętnego CO (43,99) i H , O(18.01).

Identyfikacja związków w ekstraktach CD, CD-NP i CD-HP

Analiza UPLC-QTOF-MSE

Przeprowadzono optymalizację warunków chromatograficznych. Następnie związki CistancheHerba zostały ocenione zarówno w trybie jonów ujemnych, jak i dodatnich, z wysokimi i niskimi CE. Uzyskane wyniki wykazały, że zgodność trybu ujemnego była wyższa w stosunku do trybu dodatniego dla tych związków. Figura 3 przedstawia chromatogram MS z podstawowym pikem jonowym (BPI) z ponumerowanymi pikami. Intensywność każdego wykrytego jonu w analizie UPLC-Q-TOF-MS została znormalizowana w odniesieniu do całkowitej liczby jonów w celu wygenerowania macierzy danych, która składała się z wartości m/z, znormalizowanej powierzchni piku i czasu retencji.

Ocena komponentów z płyty CD i jej przetworzonych produktów na platformie UNIFl

W sumie 97 związków zidentyfikowano w trybie -SEM (n=6) z CD i jego przetworzonego produktu (Tabela 2), w tym glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), irydoidy, lignany i oligosacharydy. Składniki 95, 91 i 94 wykryto odpowiednio w CD, CD-NP i CD-HP. Wśród nich 64 to fenyletanoidy, 13 to irydoidy, a 20 innych związków zostało oznaczonych. Istniało podobieństwo w składzie chemicznym CD i jego przetworzonego produktu, jednak stwierdzono, że ilość składników różniła się między CD a jego przetworzonym produktem.

Zmienność składników chemicznych przetwarzanych produktów Do analizy wielowymiarowej macierzy danych wykorzystano oprogramowanie Simca-P 13.0. Przed PCA wszystkie zmienne były skoncentrowane na średniej i przeskalowane w skali Pareto, po czym nastąpiła identyfikacja potencjalnych zmiennych dyskryminujących. Na wykresie punktacji PCA każdy punkt pokazywał indywidualną próbkę. Próbki, które wykazywały podobieństwo w swoich składnikach chemicznych były rozproszone obok siebie, natomiast te, które wykazywały różnice w swoich składnikach, zostały podzielone. Jak widać na PCA (ryc. 4), grupa CD-HP została oddzielona od grup CD i CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 i P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Na Fig.8 znaleźliśmy intensywność akteozydu (54), cistanozydu C (74), kamneozydu I (43), osmantuzydu (75) i 2'-aktylakteozydu (80) mających grupę 4'-O-kafeoilową w część 8-O- -D-glukopiranozylowa (patrz Rys. 9) zmniejszyła się po przetworzeniu przez wino ryżowe, podczas gdy intensywność izoacetozydu (60) to kastanozyd (71), izo-kampneozyd I (69), izomartynozyd (86) mający zwiększoną grupę 6'-O-kafeoilową (patrz Fig. 9), zwłaszcza dla grupy CD-NP. Chociaż tubulozyd B (72) ma grupę 6'-O-kafeoilową, taką samą jak izoakteozyd, intensywność zmniejszyła się z powodu jego grupy 2'-acetylowej. Intensywność echinakozydu (38) i cistanozydu B z ugrupowaniami 6'-O- -D-glukopiranozylowymi wzrosła, ale intensywność tubulozydu A (55) spadła również z powodu jego grupy 2'-acetylowej.

Nasz zespół badawczy zbadał również stabilność termiczną akteozydu i izoakteozydu i stwierdził, że akteozyd był niestabilny w wodzie, metanolu i roztworze żółtego wina ryżowego i mógł zostać częściowo przekształcony w izoakteozyd w warunkach ogrzewania. Ale termostabilność izoakteozydu była lepsza, zwłaszcza w roztworze żółtego wina ryżowego. Rysunek 10 przedstawia możliwe zmiany PhG w CD podczas przetwarzania:

Identyfikacja metabolitów u szczurów Na podstawie danych spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości przeanalizowano i porównano dokładną masę cząsteczkową i skład pierwiastkowy metabolitów i związków protocząsteczkowych. Ponieważ te same rodzaje związków w TCM wykazywały podobieństwo w modyfikacjach metabolicznych, korelacje składników fitochemicznych in vitro mogą rozciągać się na ich metabolity in vivo. Tymczasem na podstawie konwencjonalnych szlaków biotransformacji wywnioskowano rozsądną zmianę masy cząsteczkowej. Ostatecznie metabolity zidentyfikowano analizując widma masowe MSE szlaków fragmentacji metabolitów i protozwiązków w widmie masowym [21, 22]. W porównaniu z próbką ślepą, jej składniki zostały zidentyfikowane in vivo na podstawie informacji dostarczonych przez chromatogram-widmo masowe, możliwość reakcji metabolicznej, charakterystykę struktury związku oraz zasadę fragmentacji jego widma masowego. Patrz Tabela 3.

Identyfikacja metabolitów związanych z glikozydami fenyloetanolowymi

Do przetwarzania wykorzystano platformę UNIFI. Rysunek 11 przedstawia chromatograf TIC moczu, kału i osocza dla CD i jego przetworzonych produktów. W porównaniu z próbkami ślepymi, u szczurów zidentyfikowano łącznie 54 metabolity, w tym 10 składników prototypowych i 44 metabolity, z których odpowiednio 24, 49 i 6 znajdowało się w kale, moczu i osoczu.

Na podstawie dokładnej masy, kaskady fragmentacji i przewidywalnych strat obojętnych przez biotransformację wstępnie oceniono 35 metabolitów związanych z glikozydami fenyloetanoidowymi. Pokrewne metabolity glikozydów fenyloetanoidowych mają podobne wzorce fragmentacji widma masowego, jak typowy fragment dekafeoilowy m/z 461.1605, następnie hydrolizowany przez wiązania glikozydowe i estrowe in vivo i metabolizowany do hydroksytyrozolu (HT) (m/ z153.0504, C.HO.4.73 min) i kwas kawowy (CA) (m/z179.0389, CH, 0.77 min), patrz Fig. 12A.

M11 wskazano [MH]~ przy m/153,0504 wzorem tj. C.HO i oznaczono jako HT. M16 prezentował [MH]- przy m/z 329,0851, który był o 176 Da wyższy niż w przypadku HT, ujawniając, że może to być glukuronidowany metabolit HT. [MH]-M26 był przy m/z 343,1037,14 Da wyższy niż HT-glukuronidu. Dlatego M26 zidentyfikowano jako glukuronid metylowany HT. M17 został zidentyfikowany jako siarczan HT w oparciu o jego [MH]- przy m/z 233.0112,80 Da w stosunku do HT, który mógł być dalej metylowany, a następnie wytworzył M22, który wykazał m/z 247.0278, co wskazuje, że był to HT- metylowany siarczanowany metabolit. M7 (m/167,0335) i M5 (m/z 167.0762) zostały uznane odpowiednio za produkty utleniania i metylowane HT (rys.12B).

M1 wskazał [MH]- przy m/z 179,0389, wyjaśniony wzór cząsteczkowy to CH-O i zidentyfikowany jako kwas kawowy (CA). że może to być glukuronidowany metabolit CA. M27 miał m/z 258,994, czyli o 80 Da wyższy niż CA, więc wyjaśniliśmy go jako siarczan CA i mógł wytworzyć M35 (m/z 273.0064). Ponieważ M4 daje [MH]7 przy m/z 193,0524,14 Da wyższy niż CA, zidentyfikowano go jako metabolit metylowany CA. M39 był metabolitem dehydroksylacji CA, z m/z 163,04 i mógł być siarczanowany do M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) był produktem redukcji CA, czyli kwasem 3,4-dihydroksy-benzenopropionowym, który można metylować do M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 można odwodnić do M43, czyli 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), oraz M31 (m/z 341.0942, C15H17O9, 8,90 min) i M29 (m/z 245.0125, C9H10O6S, 8,52 min) były produktami glukuronidowanymi i siarczanowanymi (Fig. 12C).

W przypadku metabolitów związanych z glikozydami fenyloetanoidowymi kluczowymi kaskadami metabolicznymi były reakcje metaboliczne fazy II, tj. glukuronidacja, metylacja i siarczanowanie. Proponowane kaskady metaboliczne fenyletanoidów przedstawiono na ryc. 13.

Identyfikacja metabolitów związanych z irydoidami

Analizując skład pierwiastkowy metabolitów, fragmentację MSE i powiązaną literaturę, wstępnie oceniono łącznie 19 metabolitów związanych z irydoidem. Glikozydy irydoidalne hydrolizowano wiązaniami glikozydowymi, tworząc odpowiadające im aglikony. m/z 185,117 był dla M8, 162 Da mniejszy niż ajugol, co było wynikiem utraty reszty glukozy.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) był deglikozylowanym produktem katapolu. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) było mniejsze niż 30 Da dla deglikozylowanego metabolitu katapolu i zostało zidentyfikowane jako usunięcie cząsteczki metabolitu CH,O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), oznaczała dalszą utratę metabolitu H,O.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) był deglikozylowanym metabolitem genipozydu, a M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) był deglikozylacją kwasu {{10}epideoksyloganowego. Reakcje metaboliczne dla irydoidów można ujawnić jako metabolizm fazy I deglikozylacji (ryc. 12D).

Porównanie profilowania metabolicznego w osoczu, moczu i kale między CD a produktami przetworzonymi

Porównano 2 prototypy w osoczu, 7 w moczu i 3 w kale. Było 7 prototypów zaabsorbowanych w CD, 7 prototypów zaabsorbowanych w CD-NP i 8 prototypów w CD-HP. M21 wykryto tylko w grupie kału CD-NP, a M38 i M51 wykryto tylko w grupie moczu CD-HP. W porównaniu z metabolitami, identyczne metabolity w osoczu, moczu i kale wynosiły odpowiednio 4, 42 i 21. W grupie CD wchłonęły się 34 metabolity, 39 w grupie CD-NP i 40 w grupie CD-HP. M5, M7, M40 i M52 wykryto tylko w grupach CD-NP, podczas gdy M24, M4l i M48 wykryto tylko w grupach CD-HP.

Zaobserwowano różnice we wchłanianiu i metabolizmie związków aktywnych w różnych przetworzonych produktach CD. Na Ryc.14 stwierdziliśmy, że intensywność koniugacji HT-siarczan (M17) była najwyższa w moczu, a następnie 3-skoniugacja siarczanu HPP (M29), koniugacja metylowanego siarczanu HT (M22), dehydroksylowany siarczan CA koniugacja (M32) i koniugacja siarczanu kwasu 3,4-dihydroksybenzenopropionowego (M19). Zawartość produktów przemiany materii w grupie przetworzonej była wyższa niż w grupie CD, szczególnie dla M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Ich prekursorowa grupa 6'-O-kafeoilowa w części 8-O- -D-glukopiranozylowej, związki takie jak hydroksytyrozol mają właściwości przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwgrzybicze [ 23]. Kwas kawowy ma działanie przeciwzapalne, przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe [24]. Było to zgodne z klinicznym zastosowaniem CD i jego przetworzonych produktów.

Dyskusja

CD jest TCM, a jego główne bioaktywne składniki, w tym PhG, irydoidy, polisacharydy, zostały udokumentowane w różnych badaniach naukowych. W praktyce klinicznej TCM przetworzone produkty CD są szeroko stosowane w porównaniu z produktami surowymi. Skład chemiczny ulegnie zmianie podczas przetwarzania, co może prowadzić do zmian w działaniu leczniczym (ryc. 14).

PhG są rodzajem związków fenolowych charakteryzujących się strukturą -glukopiranozydową zawierającą ugrupowanie hydroksy-fenyloetylowe jako aglikon. Związki te często zawierają kwas kawowy i ramnozę przyłączone do reszty glukozy odpowiednio przez wiązania estrowe lub glikozydowe. W obecnym badaniu jakościowe analizy CD, CD-NP. i CD-HP, i zidentyfikowano łącznie 97 związków, w tym glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), irydoidy itp. Uzyskane wyniki wykazały zmienność składu chemicznego przed i po obróbce. Intensywność PhG zawierających grupę 4'-O-kafeoilową w części 8-O- -D-glukopiranozylowej, takich jak akteozyd, cistanozyd C, kamneozyd II, strona osmantusa zmniejszyła się po przetworzeniu, podczas gdy PhG z

takich jak izoacetozyd, izocystanozyd, izokampneozyd I, izomartynozyd, szczególnie w grupie CD-NP. Wzrosła również intensywność echinakozydu i cistanozydu B, których struktura zawiera ugrupowanie 6'-O- -D-glukopiranozylowe. PhG mające grupę 2'-acetylową często spadają z powodu reakcji hydrolizy podczas procesu, jak tubulozyd B, 2-acetyloakteozyd.

Badanie metabolitów wchłanianych in vivo przeprowadzono po doustnym podaniu CD i jego przetworzonych produktów. Kluczowymi kaskadami były procesy metaboliczne fazy II, a większość metabolitów to siarczan, glukuronid i metylowane koniugaty. Glikozydy fenyloetanolowe mają niską absorpcję i wykorzystanie po podaniu doustnym. Są trudne do wchłonięcia do krwi i działają jako prekursory, aby odgrywać swoje role po aktywacji metabolicznej in vivo. Fenyletanoidy wytwarzane w fenyloetanolaglikonie, takie jak hydroksytyrozol (HT) i kwas kawowy (CA) oraz jego pochodna kwas 3-hydroksyfenylopropionowy (3-HPP), metabolity te mogą być łatwiej wchłaniane do osocza i mieć lepszy efekt leczniczy.

CD i jego przetworzone produkty. Koniugacja HT-siarczan (M17) ma najwyższą intensywność w moczu, następnie 3-koniugacja z siarczanem HPP (M29), koniugacja z metylowanym siarczanem HT (M22), koniugacja z dehydroksylowanym siarczanem CA (M32) i 3,{{ 7}} Koniugacja siarczanu kwasu dihydroksybenzenopropionowego (M19). Zawartość produktów przemiany materii w grupie przetworzonej była wyższa niż w grupie CD, szczególnie dla M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Ogólnie rzecz biorąc, składniki o wysokim narażeniu w narządach docelowych mogą być skuteczne. Wystarczająca ilość fenyletanoidów i ich pochodnych została oceniona i oznaczona in vitro. Charakterystycznym związkiem jest akteozyd, którego zawartość po obróbce winem ryżowym zmniejszyła się, a zawartość izoakteozydu, izocystanozydu C, izokampneozydu I odpowiednio wzrosła. Produkty degradacji PhG, takich jak pochodne CA i HT, można ocenić w biopróbkach, a przetwarzanie wina ryżowego może zwiększyć wchłanianie metabolitów in vivo.

Wniosek

W tym badaniu w ekstraktach CD i jego przetworzonym produkcie wykryto 97 związków. Degradacja kilku glikozydów nastąpiła w podwyższonej temperaturze, w wyniku czego zsyntetyzowano kilka nowych izomerów i kompleksów. W badaniu in vivo, prototypowe składniki (10) i metabolity (44) zostały określone lub wstępnie ocenione w szczurzym osoczu, kale i moczu. Kluczowymi kaskadami były procesy metaboliczne fazy II, większość metabolitów była związana z echinakozydem lub akteozydem, jak HT, CA i ich pochodne 3-kwas hydroksyfenylopropionowy 3-HPP. Te metabolity mogą być łatwiej wchłaniane do osocza i mają lepsze działanie lecznicze. Uzyskane wyniki wykazały, że skład chemiczny CD był różny i wpływał na rozmieszczenie związku in vitro i in vivo.

Skróty

PhG: glikozydy fenyloetanoidowe; CD: Cistanche deserticola; CMM: Chińska Materia Medica; TCM: tradycyjna medycyna chińska; CD-NP: Gistanche deserticola Przetwarzany na parze z winem ryżowym pod normalnym ciśnieniem; CD-HP: Cistanche deserticola Przetwarzany na parze z winem ryżowym pod wysokim ciśnieniem; UPLC-Q-TOF-MS: Ultrawysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona z TOF-MS; PCA: Analiza głównych składników; VIP: zmienne znaczenie dla projekcji; CA: kwas kofeinowy; HA: hydroksytyrozol.

Podziękowanie

Nie dotyczy.

Wkład autorów

LZ, LBN, SJ brali udział w redagowaniu, pisaniu manuskryptu. RJ, LPP asystowali przy eksperymentach na zwierzętach oraz sporządzili i sfinalizowali wszystkie ryciny i tabele. ZC, HY. ITZ asystowała przy projektowaniu i przeprowadzaniu tego badania oraz dokonała przeglądu manuskryptu. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczny rękopis.

Finansowanie

Praca ta była wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (nr grantu: 81874345) i Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Liaoning (nr grantu: 2020-MS-223).

Dostępność danych i materiałów

Zbiory danych wykorzystane i/lub przeanalizowane podczas obecnego badania są dostępne u odpowiedniego autora na uzasadnione żądanie.

Deklaracje

Zatwierdzenie etyki i zgoda na udział

Zgoda etyczna na wykorzystanie zwierząt doświadczalnych w tym badaniu została uzyskana od Komisji Etyki Medycznej Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Liaoning (numer zatwierdzenia: 2018YS(DW)-044-01). Wszystkie procedury eksperymentalne w tym badaniu były zgodne ze standardami etycznymi Komisja Etyki Medycznej Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Liaoning.

Zgoda na publikację

Nie dotyczy.

Konkurujące interesy

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów do ujawnienia.

Dane autora

„Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Liaoning, Dalian, Liaoning, Chiny”. Instytut Badań Leków Grupy Monos, Ułan Bator 14250, Mongolia.

Otrzymano: 31 maja 2021 r. Przyjęto: 17 września 2021 r. Opublikowano online: 28 września 2021 r.

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1* , Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 i Tianzhu Jia1

Bibliografia

1. Komisja Farmakopei Chińskiej. Farmakopei Chińskiej Republiki Ludowej, obj. I. Pekin: China Medical Science Press; 2020. s. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): jeden z najlepszych farmaceutycznych darów tradycyjnej medycyny chińskiej. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Wpływ różnych metod suszenia świeżego Cistanche deserticola na zawartość jego składników. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optymalizacja procesu parowania wysokociśnieniowego dla Cistanches Herba. Chin Trade Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Wpływ Cistanches herba przed i po przetworzeniu na funkcję przeciwstarzeniową i funkcję immunologiczną starzejących się szczurów wywołanych D-galaktozą. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Badanie składników przeczyszczających w Cistanche deserticola YMCA. Nowoczesna Med. 2015;17(4):307-10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Badanie funkcji neuroendokrynno-immunologicznej Cistanche deserticola i jej produktów do gotowania na parze wina ryżowego w modelu szczura wywołanego glukokortykoidami. Dopełniacz oparty na Evid Alternatywny Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Wzmocnienie funkcji pobudzania nerek w modelu mysim przez Cistanches herba szybko suszone w średnio-wysokiej temperaturze. J Med Żywności. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, „Pustynny żeń-szeń”: recenzja. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Przegląd właściwości chemii, farmakologii i farmakokinetyki. J Etnofarmakol kol. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): przegląd jego fitochemii i farmakologii. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotekcyjne działanie echinakozydu w mysim modelu MPTP choroby Parkinsona. Eur J Pharmacol. 2007;564:66-74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Ochronny wpływ tubulozydu B na apoptozę indukowaną TNF alfa w komórkach neuronalnych. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Przeciwzapalne irydoidy z łodyg Cistanche deserticola hodowanych na pustyni Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Glikozydy fenyloetanoidowe o działaniu przeciwzapalnym z łodyg Cistanche deserticola hodowanych na pustyni Tarim. Fitoterapia. 2013;89:167-74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid i acykliczne glikozydy monoterpenowe, kankanozydy L, M, N, O i P z Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Nowatorska strategia szybkiego badania potencjalnych markerów chemicznych do rozróżniania surowego i przetworzonego Radix Rehmanniae metodą UHPLC-TOF-MS z wielowymiarową analizą statystyczną. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Zmiany poziomów glikozydów fenyloetanoidowych, aktywności przeciwutleniającej i innych cech jakościowych w plasterkach Cistanche deserticola przez obróbkę parą. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Zawartość zmienia się w sześciu glikozydach fenyloetanoidowych w czasie gotowania na parze z winem w Desertliving Cistanche. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Wpływ procesu gotowania na parze na jakość pożniwnej cistanche deserticola do użytku leczniczego podczas suszenia na słońcu. Biol Pharm Byk. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolity akteozydów dietetycznych: profile, izolacja, identyfikacja i właściwości hepatoprotekcyjne. J Rolnictwo Żywność Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Systematyczna charakterystyka metabolitów echinakozydu i akteozydu z Cistanche tubulosa w szczurzym osoczu, żółci, moczu i kale na podstawie UPLC-ESI-Q-TOF -SM. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroksytyrosol: naturalny związek o obiecujących działaniach farmakologicznych. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, wszechstronny farmakofor: przegląd. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695-713.

Notatka wydawcy

Springer Nature pozostaje neutralny w odniesieniu do roszczeń jurysdykcyjnych w opublikowanych mapach i powiązaniach instytucjonalnych.