Cistanche w leczeniu zapalenia i choroby nerek: Jaka jest przyczyna patogennej roli zapalenia w zajęciu nerek w cystynopatii?

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Interakcja między galektyną-3 i cystynozyną ujawnia patogenną rolę zapalenia w zajęciu nerek w cystynozie

Tatiana Lobry^1,2 i inni

Zapaleniebierze udział w patogenezie wielu zaburzeń. Jednak podstawowe mechanizmy są często nieznane. Tutaj sprawdzamy, czycystynoza, białko zaangażowane wcystynoza, jest krytycznym regulatorem galektyny^-3, członek rodziny białek wiążących b-galaktozydazę, podczaszapalenie. Cystynozajest zaburzeniem spichrzania lizosomalnego i pomimo wszechobecnej ekspresji cystynozy,nerkajest głównym organem dotkniętym chorobą.Cystynozastwierdzono, że poprawia lokalizację lizosomalną i degradację galektyny-3. w ctns^–/–myszy, mysi modelcystynoza, galektyna-3 jest nadmiernie wyrażana wnerka. Brak galektyny-3 u myszy cystynotycznych poprawia patologiczną czynność i strukturę nerek oraz zmniejsza naciek makrofagów/monocytów w nerkach Ctns^–/–Gal3^–/–myszy w porównaniu do Ctns^–/– myszy. Dane te zdecydowanie sugerują, że galektyna-3 pośredniczyzapaleniezaangażowany wnerkapostęp choroby w cystynozie. Ponadto stwierdzono, że galektyna-3 wchodzi w interakcję z prozapalną cytokiną Białko chemotaktyczne Monocyte-1, które stymuluje rekrutację monocytów/makrofagów, i okazała się istotnie zwiększona w surowicy myszy Ctns–/– a także pacjenci zcystynoza. Dlatego nasze odkrycia podkreślają nową rolę interakcji cystynozy i galektyny-3 w zapaleniu i dostarczają dodatkowego mechanistycznego wyjaśnienianerkachoroba cystynozy. Może to prowadzić do opóźnienia identyfikacji nowych celów lekówcystynozapostęp.

SŁOWA KLUCZOWE:przewlekłą chorobę nerek; cystynoza; galektyna-3;zapalenie; białko chemoatraktant monocytów–1

cistanche może leczyć przewlekłą chorobę nerek i cystynozę

Przyczyną zapalenia jest to, że tlenek azotu może prowadzić do wytwarzania komórek zapalnych.Cistancheto cenny chiński lek ziołowy. Jego aktywne składniki mogą hamować wydzielanie tlenku azotu oraz odgrywać rolę w zapobieganiu i leczeniu stanów zapalnych i chorób nerek.

Oświadczenie tłumaczące

Pomimo leczenia pacjenci nadal postępują do schyłkowej niewydolności nerek. W tym badaniu wykazaliśmy, że brakcystynozapowoduje upośledzoną degradację lizosomalną-3 (Gal-3) galektyny, prowadząc dozapaleniei postępprzewlekłą chorobę nerekwcystynoza. Odkrycia te otwierają nowe perspektywy na potencjalne cele terapeutyczne, które mogą ograniczyć lub opóźnić zwyrodnienie nerek u pacjentów z:cystynoza. W związku z tym leki przeciwzapalne i inhibitory Gal-3, takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne lub indometacyna, mogą poprawić patogenezę nerek w cystynozie.

Zapaleniejest normalną ostrą reakcją organizmu na uraz lub infekcję,¹ale przewlekłezapaleniewiąże się z uszkodzeniem tkanek. W przypadku chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca, uszkodzone tkanki aktywują układ odpornościowy, prowadząc do ciągłej odpowiedzi zapalnej i ostatecznie do zwyrodnienia tkanek.² Cytokiny są kluczowymi modulatoramizapaleniei są w stanie aktywować lub rozwiązaćzapalenieprocesu.3 U pacjentów zprzewlekłą chorobę nerek(CKD), podwyższone stężenie cytokin w osoczu (interleukina [IL]-6 i czynnik martwicy nowotworu-a) orazzapaleniemarkery (białko C-reaktywne, IL-6, hialuronian i neopteryna) są związane z progresją do schyłkowej niewydolności nerek.4 Zrozumienie specyficznych mediatorów, które wyzwalają reakcje zapalne, ułatwia odkrycie odpowiednich celów dla leków, aby zapobiec uszkodzeniom zwyrodnieniowym .

Cystynozajest autosomalną recesywną chorobą metaboliczną, która należy do rodziny lizosomalnych zaburzeń spichrzania i charakteryzuje się nagromadzeniem cystyny ​​we wszystkich narządach.⁵ Gen uszkodzony wcystynozaCTNS, koduje lizosomalny kotransporter cystyna/proton, cystynozę.^6,7 Chociaż CTNS jest wszechobecnie wyrażany,nerkajest pierwszym narządem dotkniętym chorobą u osób zcystynoza. Pacjenci zazwyczaj w pierwszym roku życia zgłaszają się z zespołem Fanconiego, charakteryzującym się ciężkimi zaburzeniami płynów i elektrolitów, słabym wzrostem i krzywicą.⁸Następnie rozwija się CKD, która prowadzi do schyłkowej niewydolności nerek i wymaga:nerkaprzeszczep. Akumulacja cystyny ​​we wszystkich tkankach ostatecznie prowadzi do dysfunkcji wielonarządowej; pacjenci doświadczają światłowstrętu i ślepoty, niedoczynności tarczycy, hipogonadyzmu, cukrzycy, miopatii i pogorszenia ośrodkowego układu nerwowego.⁹ W tle C57BL/6 model myszy z nokautem (Ctns^–/–) 10 replikuje fenotyp nerek pacjentów z cystynozą,¹¹ a także osadzanie się kryształków cystyny ​​w rogówce¹²i dysfunkcja tarczycy.¹³

W niniejszym opracowaniu ujawniamy nową rolę dlacystynozawzapaleniepoprzez interakcję z Gal-3. Gal-3 należy do rodziny białek wiążących lektyny i b-galaktozydy ²¹ i bierze udział w wielu funkcjach biologicznych, w tym:zapalenie.²²W kontekścienerkawykazano, że hamowanie Gal-3 zmniejsza ekspresję markera prozapalnego i zwłóknienie nerek oraz zapobiega spadkowi szybkości filtracji kłębuszkowej w modelach hiperaldosteronizmu, nadciśnienia tętniczego lub otyłości.^23–26Tutaj przedstawiamy dowody, że wcystynoza, nieobecnośćcystynozaprowadzi do nadekspresji Gal-3 wnerki, wzmacniając infiltrację makrofagów i progresję PChN. Ponadto identyfikujemy białko chemoatraktanty monocytów-1 (MCP-1) jako potencjalny mediator, ujawniając nowe cele genowe dla terapii lekowej. WYNIKI Gal-3 oddziałuje z cystynozą poprzez domenę rozpoznawania węglowodanów. partnerzy stosujący ilościową spektrometrię mas, psi Madin-Darbynerka(MDCK) transdukowano konstruktem lentiwirusowym w celu stabilnej ekspresji białka fuzyjnego cystynoza-zielone białko fluorescencyjne FL (GFP). Oprócz 9 podjednostek trifosfatazy adenozynowej typu wakuolarnego Hþ opublikowanych wcześniej,¹⁹Gal-3 został zidentyfikowany jako jedno z białek oddziałujących zcystynoza(Rysunek 1a). To oddziaływanie zostało dodatkowo potwierdzone przez koimmunoprecypitację, a następnie analizę Western blot (Figura 1b i c). Ponadto pokazaliśmy, że interakcja między Gal-3 icystynozapośredniczyła domena rozpoznawania węglowodanów Gal-3 (CRD) zlokalizowana w C-końcowym ogonie białka. Interakcja była hamowana przez tiodigalaktozyd, silny inhibitor oddziaływań galektyna-węglowodan (Figura 1d). Podobnie jak wszystkie galektyny, Gal-3 wykazuje powinowactwo do białek glikozylowanych,21 więc jest prawdopodobne, że oddziaływanie z Gal-3 zachodzi poprzez ugrupowanie glikozylowane cystynozy zlokalizowane w wewnątrzlizosomalnym ogonie N-końcowym białka.²⁷

Cystynozyna poprawia lokalizację i degradację lizosomów Gal-3

Aby zweryfikować potencjalną lokalizację lizosomalną Gal-3 podczas interakcji zcystynozawykazaliśmy, że Gal-3, podobnie jak katepsyna D (proteaza wewnątrzlizosomalna), była chroniona przed trawieniem przez proteinazę K, podczas gdy oba białka były trawione, gdy lizosomy były permeabilizowane za pomocą Triton X- 100 (Rysunek 2a i uzupełnienie Rysunek S1). Podobne dane uzyskano w lizosomach wyizolowanych z wątroby myszy, potwierdzając lizosomalną lokalizację Gal-3 in vivo (Figura 2b i c). Z powodu braku wiarygodnego przeciwciała do wykryciacystynoza, immunobarwienie przeprowadzono w dniucystynozaLinie komórkowe MDCK eksprymujące -GFP z przeciwciałem anty-Gal-3. Potwierdzono obecność Gal-3 w świetle lizosomów, podczas gdy cystynoza-GFP i Lamp-2 (lizosomalne białko transbłonowe) zostały znalezione tylko w błonie pęcherzyków (Figura 2d).

Aby zbadać, czycystynozynabył zaangażowany w handel Gal-3, przeanalizowaliśmy dynamikę obucystynozaoraz pęcherzyki Gal-3-dodatnie przy użyciu dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej FL z całkowitym wewnętrznym odbiciem żywych komórek w mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) z typu dzikiego (WT) i Ctns^–/–myszy eksprymujące zarówno CTNS-DsRed, jak i Gal-3-GFP. Nasza analiza potwierdziła tocystynozai Gal-3 ulegają prawdziwej kolokalizacji w Ctns–/– MEF, co potwierdza podobny czasowo-przestrzenny rozkład tych cząsteczek w strefie mikroskopii fluorescencyjnej FL z całkowitym wewnętrznym odbiciem (Rysunek 2e). Dane w WT MEF były podobne (dane nie pokazane). Ponadto, gdy analizowano MEFs transfekowane tylko Gal- 3-GFP, Gal-3-GFP znaleziono w cytoplazmie i nie zaobserwowano wyraźnej struktury pęcherzykowej, w przeciwieństwie do kotransfekcji z CTNS-DsRed ( dane nie są pokazane).

Dane te zostały potwierdzone w komórkach 293T, w których silny sygnał GFP w cytoplazmie zaobserwowano w komórkach wyrażających tylko Gal-3–GFP, podczas gdy w komórkach wyrażających zarówno Gal-3–GFP, jak icystynozyna-DsRed, Gal-3-GFP były zlokalizowane głównie w lizosomach z ekspresją cystynozy-DsRed (ryc. 3a). Ponadto, ilościowe oznaczenie ekspresji białka Gal-3 w komórkach transfekowanych samym Gal-3-GFP lub Gal- 3-GFP i CTNS-DsRed oraz Gal-3-GFP i DsRed jako kontrola, wykazał znacznie mniej białek Gal-3-GFP w komórkach kotransfekowanych CTNS-DsRed w porównaniu z komórkami transfekowanymi samym Gal-3-GFP lub kotransfekowanymi DsRed (Figura 3b). W sumie wyniki te sugerują, że:cystynozynapoprawia lizosomalną lokalizację i degradację Gal-3. Wykazano, że cystynozyna jest zaangażowana w CMA.28 Białko szoku cieplnego 70 kDa (Hsc70) uczestniczy w CMA poprzez wspomaganie rozkładania i translokacji białek substratowych przez błonę do światła lizosomów w sposób zależny od LAMP2A.29,30 Ponieważ Gal{ Zaproponowano degradację {8}} przez CMA,31 zbadaliśmy lokalizację Gal-3 względem Hsc70 w cystynotycznych MEF. Analiza mikroskopii konfokalnej potwierdziła kolokalizację Gal-3-GFP w strukturach Hsc70- dodatnich zarówno w WT (dane nie pokazane) jak i Ctns^–/–(Figura 3c), wspierając kotransport Gal-3 z Hsc70 i sugerując, że internalizacja lizosomalna, ale nie rozpoznawanie Gal-3 przez chaperon jest wadliwe wcystynoza.

Gal-3 bierze udział w zapaleniu nerek w Ctns^–/–myszy

Aby poznać rolę Gal-3 wcystynozain vivo wygenerowaliśmy model myszy z podwójnym nokautem, w którym brakowało obucystynozynai Gal-3 (Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy). WT, Ctns^–/–i Gal-3^–/–myszy zastosowano jako osobniki kontrolne. W C57BL/6 Ctns^–/–myszy, anomalie nerek pojawiają się około 10 miesiąca życia.11 Dlatego badania przeprowadzono w wieku od 8 do 9 miesięcy, kiedynerkaanomalie zaczynają być wykrywane i po 12 do 15 miesiącach, kiedy anomalie nerek postępują. Ponieważ stwierdzono, że zawartość cystyny ​​jest różna w Ctns męskich i żeńskich^–/– nerkianalizowano je oddzielnie. Jeśli zawartość cystyny ​​wzrasta wraz z wiekiem w obu genotypach, nie zaobserwowano znaczącej różnicy w nerkach męskich i żeńskich między myszami Ctns–/– Gal-3–/– i Ctns^–/– myszy w wieku 8 do 9 miesięcy i 12 do 15 miesięcy (Figura 4a).

Czynność nerek oceniano w surowicy i moczu i nie zaobserwowano istotnej różnicy między WT a Ctns^–/–myszy w wieku 8 do 9 miesięcy (dane nie pokazane), ale w wieku 12 do 15 miesięcy, Ctns^–/–myszy wykazywały znacznie wyższe poziomy kreatyniny i mocznika w surowicy w porównaniu z myszami WT. Co ciekawe, Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy wykazywały lepszą czynność nerek w porównaniu z Ctns^–/–myszy w wieku od 12 do 15 miesięcy, z niższym poziomem kreatyniny w surowicy (P <0.05) i mocznikiem (P <0,05; Tabela 1).

Badania histologiczne myszy 8- na 9-miesięcznej i 12- na 15-miesięcznejnerkaprzekroje ujawniły obecność poważnych anomalii w Ctns^–/– nerki, w tym atrofia kanalików, cofnięte kłębuszki i nacieki jednojądrzaste. Ślepa analiza skrawków nerki określała zakres uszkodzenia korowego od 1 (zachowana struktura tkanki) do 6. Średni wynik dla Ctns^–/–myszy wynosiły 2,64 - 0,36 w wieku 9 miesięcy (n=7) i 4,12 0,37 w wieku 12 do 15 miesięcy (n=16). W nerkach Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy w tym samym wieku, te anomalie były znacznie mniej rozległe: 1.62 - 0.11 w wieku 9 miesięcy (n=21; P < 0.05,="" t-manna-whitneya="" test)="" i="" 3.04="" -="" 0.22="" w="" wieku="" od="" 12="" do="" 15="" miesięcy="" (n="33;" p="">< 0,05,="" test="" t="" manna-whitneya)="" (rysunek="" 4b="" i="" rysunek="" uzupełniający="" s2).="" ponadto="" do="" każdej="" tkanki="" przypisano="" procent="" zaniku="" kanalików,="" a="" średnią="" dla="">^–/–myszy i Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy stanowiły odpowiednio 66 procent i 42 procent w wieku od 12 do 15 miesięcy (P=0.01). Ponadto uderzająca różnica między Ctns^–/–i Ctns^–/– Gal-3^–/– nerkaprzekrojów była obecność kilku jednojądrzastych nacieków w Ctns^–/–Gal-3^–/–sekcje, podczas gdy ciężkie nacieki były konsekwentnie obserwowane w Ctns^–/– nerka(Rysunek 4b).

Scharakteryzowaliśmy jednojądrzaste nacieki obserwowane w badaniu histologicznym od 8- do 9-miesięcznych Ctn^–/– nerkijako makrofagi/monocyty przez koimmunobarwienie z CD68 i CD45 oraz z CD68 i główną klasą zgodności tkankowej II (rysunek uzupełniający S3), ale nie z CD68 i CD163, co sugeruje, że te makrofagi mają profil prozapalny typu M1-.32 ,33 Ocena ilościowa komórek CD68- dodatnich wykazała znacznie mniej makrofagów/monocytów w WT, Gal-3^–/–, i Ctns^–/–Gal-3^–/– nerkiw porównaniu z Ctns^–/– nerki(ryc. 4c), potwierdzając dane histologiczne (ryc. 4b).

Podsumowując, odkrycia te sugerują, że Gal-3 bierze udział w rekrutacji makrofagów/monocytów w cystynotycznychnerkii że jego brak łagodzi chorobę nerek w Ctns^–/–myszy. Stąd sugeruje, żezapalenieodpowiada, przynajmniej częściowo, za pogorszenie stanu nerek w Ctns^–/– myszy.

Nerki z niedoborem CTN wykazują nadekspresję Gal-3

Korzystając z analizy Western blot stwierdziliśmy, że ekspresja Gal-3 była znacznie zwiększona wnerkiz 12-miesięcznych Ctn^s–/–myszy w porównaniu z myszami WT (Figura 5a i b). Aby zbadać, czy ta zwiększona ekspresja Gal-3 jest specyficzna dla Ctns^–/– nerki, określiliśmy ilościowo ekspresję Gal-3 na poziomie transkryptu i białka wnerkiod myszy z PChN wywołaną przez standardową operację nefrektomii krokowej 2-krokowej i od zwierząt, które przeszły operację pozorowaną. WT i Ctns^–/–myszy zastosowano jako osobniki kontrolne. Transkrypty Gal-3 były znacząco zwiększone w Ctns-/- i nerkach pozorowanych, ale znacznie zwiększone w CKDnerkiw porównaniu z myszami WT (Figura 5c). Natomiast na poziomie białka Gal-3 wykryto tylko w Ctns^–/–nerki, zdecydowanie sugerując, że tylko Ctns^–/–nerki nie były w stanie degradować białka Gal-3 (Figura 5d). Barwienie immunofluorescencyjne Gal-3 u myszynerkaw wieku 8 do 9 miesięcy wykazała również nadekspresję Gal-3 w Ctns^–/– nerkiw porównaniu z WTnerki(Rysunek 5e). Ponadto Gal-3 była wyrażana przez makrofagi CD68þ, a także komórki nerkowe w Ctns^–/– nerkiw wieku 8 do 9 miesięcy (rysunek uzupełniający S4). W sumie dane te są zgodne ze zmniejszoną degradacją Gal-3 przy brakucystynozajak wykazano in vitro (Rysunek 3a i b), co prowadzi do akumulacji białka Gal-3 w Ctns^–/– nerki.

Brak cystynozyny prowadzi do zwiększenia MCP w surowicy-1 poprzez zwiększenie Gal-3

Gal-3 regulujezapaleniepoprzez różne mechanizmy.34 W ten sposób, aby uzyskać dalszy wgląd w mechanizm wcystynoza, zbadaliśmy ekspresję różnych prozapalnych lub przeciwzapalnych cytokin w surowicy od 12- do 15-miesięcznego WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, i Ctns^–/–Gal- 3^–/–myszy. Sześć poziomów cytokin zmierzono za pomocą mysiego zestawu kulek cytometrycznych, MCP-1, interferonu-g, czynnika martwicy nowotworu oraz IL-10, IL-6 i IL-12p70. Tylko ekspresja MCP-1 była znacząco zwiększona w surowicy myszy Ctns–/– w porównaniu z myszami WT i Gal-3–/–, a także z Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy, których poziomy MCP-1 w surowicy były porównywalne z myszami WT (Figura 6a). MCP-1 jest wytwarzany przez różne typy komórek, przy czym głównym źródłem MCP-1 są makrofagi i monocyty,35 i działa jako chemoatraktant monocytów i makrofagów regulując ich migrację i infiltrację. Natomiast w tym samym wieku ekspresja Gal-3 była podobna w surowicy myszy Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n=5) i myszy WT (40.{{12} } 0,41 ng/ml; n=7).

Związek między Gal-3 i MCP-1 był dalej badany przez koimmunoprecypitację z użyciem Gal-3–GFP i MCP-1–DsRed– lub Gal-3– GFP i CTNS-DsRed – (jako kontrola pozytywna) wyrażające komórki 293T. Zaobserwowano interakcję między Gal-3 i MCP-1 (Rysunek 6b), co sugeruje bezpośrednią indukcję MCP-1 przez Gal-3. Inkubacja z N-acetylo-D-laktozaminą (LacNAc), inhibitorem Gal-3 CRD, wykazała, że ​​w przeciwieństwie docystynozynainterakcji, CRD nie bierze udziału w interakcji między Gal-3 i MCP-1 (Rysunek 6c).

Aby ocenić, czy to odkrycie dotyczy ludzi, zmierzyliśmy poziomy Gal-3 i MCP-1 u pacjentów zcystynozaktórzy nie przechodzili terapii immunosupresyjnej lub nie przyjmowali leków przeciwzapalnych. Chociaż stwierdzono, że poziom Gal-3 był nieznacznie podwyższony w surowicy pacjentów z cystynozą w porównaniu ze zdrowymi dawcami, różnica nie była znacząca (ryc. 6e), potwierdzając nasze wyniki uzyskane w Ctns^–/–myszy. Tylko 2 pacjentów miało wysoki poziom Gal-3 (25,34 i 39,54 ng/ml); zostały one uznane za wartości odstające, a zatem nie zostały uwzględnione na rysunku 6e. W przeciwieństwie do tego, stosując test immunoenzymatyczny skierowany przeciwko ludzkiemu MCP-1 (Rysunek 6d), stwierdzono, że poziomy MCP-1 w surowicy były znacząco podwyższone u pacjentów zcystynoza(252,1 - 18,4 pg/ml; n=19; przedział wiekowy 1–23 lat) pomimo leczenia cysteaminą w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej (166.9 -13,5 pg/ml; n=1 0; przedział wiekowy 8–63 lat) (P < 0,001).="" nie="" stwierdzono="" korelacji="" między="" wiekiem="" a="" poziomem="" mcp-="" 1="" u="" obu="" pacjentów="">cystynozai zdrowi dawcy (dane niepokazane).

Cistanchemaprzeciwzapalnynieruchomości

DYSKUSJA

Pomimo faktu, że cystyna gromadzi się we wszystkich tkankach u pacjentów dotkniętychcystynozanerki to narządy najbardziej narażone na uszkodzenia. Dlatego uważamy, że akumulacja cystyny ​​nie jest wyłącznie odpowiedzialna za zwyrodnienie nerek. Tutaj opisujemy nową rolę dlacystynozynaw regulacjizapaleniezaangażowane w progresję przewlekłej choroby nerek wcystynoza. Badanie to może wyjaśniać, dlaczego pacjenci ewoluują do schyłkowej niewydolności nerek pomimo poddawania się terapii cysteaminą.

Badanie partnerów molekularnych cystynozy ujawniło bezpośrednią interakcję z Gal-3, którą mogą hamować inhibitory Gal-3 CRD. Ostatnie badania wykazały, że Gal-3 może wchodzić w interakcje z glikanami znajdującymi się w świetle lizosomów po uszkodzeniu lizosomów, takim jak nagromadzenie kryształów.36 W naszym badaniu interakcja między Gal-3 icystynozynabył badany w zdrowych komórkach wyrażającychcystynozynaa zatem nie gromadzi kryształów cysteiny lub cystyny. Ponadto nadekspresja zarówno Gal-3, jak i cystynozyny w zdrowych komórkach zmodyfikowała subkomórkową lokalizację Gal-3, która następnie została zlokalizowana w lizosomach, w porównaniu z nadekspresją tylko Gal-3, która znajdował się w cytoplazmie. Wyniki te silnie sugerują, że interakcja między Gal-3 i cystynozyną zachodzi niezależnie od uszkodzenia lizosomów i że cystynozyna jest aktywnie odpowiedzialna za lokalizację lizosomalną Gal-3. Wcześniej wykazano, że Gal-3 ulega degradacji przez zależną od lizosomów proteolizę w nieobecności kinaz tyrozynowych Abl i Arg.³¹

Dodatkowo pokazaliśmy, żecystynozai Gal-3 znajdują się wspólnie w dynamicznych strukturach pęcherzykowych i są razem mobilizowane w sposób czasoprzestrzenny.Cystynozynawcześniej był związany z mechanizmami transportu lizosomalnego LAMP2A, jedynego znanego receptora CMA, który jest niewłaściwie zlokalizowany wcystynoza.²⁸Wcześniej wykazano, że w degradacji Gal-3 pośredniczy CMA.³¹Analiza mikroskopii konfokalnej potwierdziła kolokalizację Gal-3 w strukturach Hsc70-dodatnich w obu Ctns^–/– oraz komórki WT, wspierające kotransport Gal-3 z Hsc70 do prezentacji w lizosomie i degradacji przez CMA, ponieważ Hsc70 wspomaga translokację białek substratowych przez błonę do światła lizosomów.^29,30Możliwą interpretacją naszych wyników jest to, żecystynozynareguluje handel i dostarczanie Gal-3 do lizosomów aktywnych CMA w celu degradacji.

Ta nowatorska ścieżkacystynozyna-zależna od Gal-3 lizosomalna lokalizacja i degradacja jest wspierana in vivo, ponieważ myszy z niedoborem Ctns wykazują nadekspresję Gal-3 w obrębienerka. Ponadto, podczas gdy zwiększony Gal-3 mRNA był ograniczony w Ctns^–/–nerki w porównaniu z innym modelem PChN, dużą ilość białka Gal-3 wykryto tylko w Ctns^–/– nerki. Dane te zdecydowanie potwierdzają wniosek, żecystynozynabierze udział w degradacji białka Gal-3, które może kontrolować nadekspresję mRNA Gal-3 w warunkach stresowych, takich jak PChN.

Gal-3 pełni kilka ról biologicznych, w tym role w ostrych i przewlekłychzapaleniepoprzez przyciąganie monocytów i makrofagów.^37,38w ctns^–/– myszy, zaobserwowaliśmy ciężkie jednojądrzaste nacieki głównie wnerkajak opisano wcześniej,^11,39które scharakteryzowano jako monocyty/makrofagi. Natomiast nerki z podwójnego nokautu Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy wykazywały bardzo niewiele nacieków monocytów/makrofagów, co silnie sugeruje, że Gal-3 jest zaangażowany wzapaleniew nerkach Ctns^–/–myszy. W kontekście powtarzającego się uszkodzenia tkanki Gal-3 może wywołać przejście do przewlekłegozapaleniei zwłóknienie.³⁴Zgodnie z tymi ustaleniami nasze dane wykazują udział Gal-3 w progresji PChN wcystynoza. Rzeczywiście, podwójny nokaut Ctns^–/– Gal-3^–/–myszy wykazywały się lepiejnerkafunkcja i struktura w porównaniu z Ctns^–/–myszy. Podobnie myszy z niedoborem Gal-3 wykazują mniej zwłóknienia nerek wnerkaw porównaniu z myszami WT po jednostronnej niedrożności moczowodu,⁴⁰ i myszy z nokautem Gal-3 poddane uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnemu miały lepszą funkcję nerek w porównaniu z myszami WT poddanymi uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnemu.⁴¹

Chociaż stwierdzono korelację między poziomem Gal-3 w osoczu a rozwojem PChN,42 nie zaobserwowano różnicy w ekspresji Gal-3 w surowicy myszy i ludzi dotkniętych chorobącystynozai zdrowych osobników kontrolnych. Mierząc różne poziomy cytokin w surowicy, stwierdziliśmy znaczny wzrost MCP-1 w Ctns^–/–myszy, podczas gdy Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy miały poziomy porównywalne z tymi z myszy WT. MCP-1 to cytokina, która może być uwalniana w surowicy i tworzy gradient przyciągający monocyty i makrofagi do miejsca uszkodzenia.35 Wzrost MCP-1 w surowicy Ctns^–/–myszy w porównaniu z Ctns^–/–Gal-3^–/–myszy były niezależne od akumulacji cystyny, ponieważnerkaZawartość cystyny ​​była podobna w obu genotypach. Ponadto, pomimo leczenia cysteaminą, które umożliwiło uchodzenie cystyny ​​z lizosomów, stwierdzono, że MCP-1 jest znacząco zwiększony w surowicach pacjentów zcystynozaw porównaniu ze zdrowymi dawcami. Dane te zdecydowanie sugerują, że brakcystynozyna, a nie akumulacja cystyny, jest odpowiedzialna za wzrost MCP-1 w surowicy. Ponadto wykazaliśmy bezpośrednią interakcję między Gal-3 i MCP-1, co zostało niedawno zasugerowane przez Gordona-Alonso i wsp.43, ale nie było dalej badane. Mechanizm aktywacji MCP-1 za pośrednictwem Gal-3 nie był tutaj badany. Hipotezą jest obecność peptydu sygnałowego w ludzkim MCP-1, który może być cięty w celu zwiększenia jego wydzielania.44 Ponadto plazmina może ciąć C-koniec MCP-1, co zwiększa jego chemoatraktant 45 Ponadto, zgodnie z naszymi danymi, hamowanie MCP-1 w mysim modelu nefropatii cukrzycowej zapobiegało infiltracji makrofagów nerkowych i poprawiało czynność nerek.46,47cystynoza, nasze dane zdecydowanie sugerują, że brakcystynozynaprowadzi do wzrostu Gal-3, który aktywuje mobilizację krwi MCP-1, wzmacniając nerkizapaleniei postępprzewlekłą chorobę nerek.

Odkrycia te otwierają nowe perspektywy na potencjalne cele terapeutyczne, które mogą ograniczyć lub opóźnić zwyrodnienie nerek u pacjentów z:cystynoza. Rzeczywiście, stwierdzono, że niesteroidowe leki przeciwzapalne, takie jak aspiryna i indometacyna, hamują ekspresję Gal-3 poprzez hamowanie jej transkrypcji.48 Indometacyna jest w rzeczywistości stosowana do regulowania wielomoczu i polidypsji wcystynoza[,49] a niedawne badanie 307 europejskich pacjentów z cystynozą wykazało poprawę wyników leczenia nerkowego u pacjentów leczonych indometacyną.50 W świetle naszego badania, zastosowanie indometacyny lub niesteroidowych leków przeciwzapalnych w leczeniucystynozapacjenci mogą być ponownie rozważeni.

METODY

Eksperymenty na zwierzętach

C57BL/6 Ctns^–/–myszy dostarczył dr Antignac (Inserm U1163, Paryż, Francja). C57BL/6 galektyna-3 zero (Gal-3^–/–) myszy dostarczyli dr Fu-Tong Liu (Uniwersytet Kalifornijski, Davis) i dr Jerrold M. Olefsky (Uniwersytet Kalifornijski, San Diego). Strategia hodowlana do generowania WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, Ctns–/– i Gal- 3^–/–myszy opisano w metodach uzupełniających.

Linie komórkowe

bałagan został wygenerowany z biopsji skóry noworodka WT i Ctns^–/–myszy. Linie komórkowe MEF, 293T i MDCK typu II (ATCC, Manassas, VA) hodowano w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco zawierającej 10 procent płodowej surowicy cielęcej lub płodowej surowicy bydlęcej, 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.

Analiza koimmunoprecypitacji i spektrometrii masowej

Aby zbadać interakcje białko-białko, komórki MDCK transdukowano przy użyciu szkieletu wektora lentiwirusowego pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE w celu stabilnej ekspresjicystynozyna-GFP.⁵¹Koimmunoprecypitację przeprowadzono zgodnie z opisem w metodach uzupełniających. Białka poddane koimmunoprecypitacji rozdzielono metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i analizowano metodą spektrometrii masowej, LTQ Orbitrap, jak już opisano.¹⁹

Komórki 293T wyrażające Gal-3–GFP i MCP-1–DsRed lub Gal-3–GFP i CTNS-DsRed zastosowano do koimmunoprecypitacji, jak opisano w Metody uzupełniające. Białka poddane koimmunoprecypitacji rozdzielono metodą SDS-PAGE, a MCP wiążące Gal-3 wykryto przy użyciu przeciwciała anty-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

Frakcjonowanie subkomórkowe

Osiem wątrób uzyskano od myszy C57BL/6 i przygotowano jak opisano wcześniej.52 Warunki gradientu były zasadniczo takie same, jak opisano w oryginalnej publikacji,52 z wyjątkiem tego, że zamiast metrizamidu zastosowano Nycodenz.

Leczenie inhibitorem Gal-3 i proteinazą K

Lizaty zcystynozyna-GFP komórki MDCK i 293T wyrażające Gal-3–GFP i CTNS-DsRed lub Gal-3–GFP i MCP-1–DsRed inkubowano z lub bez 5 mM tiodigalaktozydu lub 5 mM N -Acetylo-D-laktozamina, odpowiednio, 2 inhibitory Gal-3 CRD. Po 30 minutach inkubacji w 4 - C z ciągłym wytrząsaniem, lizaty inkubowano z 50 ml mikrokulek anty-GFP i przeprowadzono immunoprecypitację, jak wspomniano wcześniej. Wytrącone białka rozdzielono metodą SDS-PAGE na 10% żelu.

Lizaty zcystynozyna-GFP MDCK i frakcje wzbogacone w lizosom z wątroby myszy inkubowano z lub bez 2% Triton X-100 przez 10 minut w 4 - C, a następnie inkubowano 30 minut z lub bez 2,5 mg/ml i 25 mg /ml proteinazy K, odpowiednio. Po inaktywacji enzymu za pomocą 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu przez 5 minut w 4 - C, białka rozdzielono metodą SDS-PAGE na 10% żelu.

Analiza immunofluorescencyjna

Utrwalone komórki MDCK inkubowano z przeciwciałami anty-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) i anty-Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie z Alexa Fluor 555 drugorzędowe przeciwciało (Invitrogen, Carlsbad, CA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu mikroskopu Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Niemcy).

komórki 293T przejściowo wyrażające tylko Gal-3-GFP, Gal-3-GFP i DsRed lub Gal-3-GFP icystynozyna-DsRed hodowano na szkiełku nakrywkowym przed umieszczeniem na szkiełku. Komórki obrazowano przy użyciu instrumentu Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japonia).

Naprawiłnerkaskrawki inkubowano przez noc w 4 - C z przeciwciałem anty-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) lub anty-Gal-3 (BioLegend), a następnie z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 godzina w temperaturze pokojowej. Obrazy uzyskano przy użyciu instrumentu Keyence BZ-X700. Ilościową ocenę ekspresji CD68 opisano w metodach uzupełniających.

MEF wyrażające Gal-3-GFP wybarwiono przy użyciu przeciwciała anty-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) i zobrazowano jak opisano wcześniej.⁵³

Mikroskopia fluorescencyjna FL z całkowitym odbiciem wewnętrznym

WT i Ctns^–/–Gal-3-GFP wyrażający MEF i CTNS-DsRed wysiano na dolnym naczyniu borokrzemianowym 4-komory 35- mm (Cellvis, Mountain View, CA). Po 2 dniach w hodowli, MEFs analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej FL z całkowitym wewnętrznym odbiciem, jak opisano wcześniej⁵⁴oraz w metodach uzupełniających. Obrazy analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ.

Analiza wyrażenia Gal-3

Komórki 293T wyrażające Gal-3–GFP, Gal-3–GFP i DsRed lub Gal-3–GFP i CTNS-DsRed i eksplantowanenerkipoddano lizie w buforze testowym radioimmunoprecypitacji zawierającym koktajl inhibitorów proteinazy. Białka rozdzielono na 4% do 15% żelu i ujawniono przy użyciu przeciwciała anty-Gal-3 (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) lub anty-gliceraldehydu-3-dehydrogenazy fosforanowej (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) .

Nerkihomogenizowano w buforze RLT zawierającym b-merkaptoetanol przy użyciu Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francja). Wyizolowano RNA i przeprowadzono swoistą dla Gal-3– reakcję łańcuchową cyfrowej polimerazy kropelkowej, jak opisano w dodatkowych metodach. Ekspresję transkryptu Gal-3 wyrażono jako stosunek w porównaniu z endogenną kontrolą 18S. Test immunoenzymatyczny (Abcam) zastosowano do wykrycia poziomu Gal-3 u myszy i ludzkich surowic, zgodnie z instrukcjami producenta.

Czynność nerek

Stężenia fosforanów, kreatyniny i mocznika w surowicy i moczu oszacowano za pomocą zestawu QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit i QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Poziomy białka w moczu mierzono za pomocą zestawu Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).

Histologia

W tym czasie myszy zostały zabite,nerkizebrano, utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie. Skrawki barwione hematoksyliną i eozyną zostały przeanalizowane w sposób zaślepiony przez dr Marie Claire Gubler, jak opisano w dodatkowych metodach.

Pomiar zawartości cystyny

Pomiar cystyny ​​w tkance przeprowadzono metodą spektrometrii masowej (LC-ESI-MS/MS), jak opisano wcześniej.³⁹

Nefrektomia standardowa i operacja pozorowana

Myszy CKD wywołano przez standardową operację nefrektomii w fazie częściowej 2-jak opisano wcześniej.^55,56Grupa fikcyjna myszy przeszła tę samą procedurę, ale bez żadnego cięcianerkapapierowa chusteczka.

Poziom cytokin w surowicy

Aby zmierzyć poziom cytokin w surowicy myszy, myszzapaleniezestaw cytometrycznych kulek (BD Biosciences, San Jose, CA) wykonano zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie MCP-1 w surowicy ludzkiej określono przy użyciu testu immunoenzymatycznego skierowanego przeciwko MCP-1 (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) zgodnie z instrukcjami producenta.

Analiza statystyczna

Wartości wyrażone są jako średnia - SEM. Istotność wyniku została oceniona za pomocą niesparowanego 2-ogólnego testu t-Studenta lub niesparowanego 2-ogólnego testu t-Studenta z poprawką Welcha. Porównania grupowe 3 lub więcej warunków przeprowadzono za pomocą parametrycznej analizy wariancji, a następnie przeprowadzono test wielokrotnych porównań Tukeya dla porównań parami. Wyniki histologiczne porównano za pomocą testu Manna-Whitneya. Analizy przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). Wartość P mniejsza niż 00,05 została uznana za istotną.

Zatwierdzenie badania

Eksperymenty na myszach prowadzono zgodnie z protokołami Institutional Animal Use Committee. Wykorzystanie tkanki ludzkiej w tym badaniu zostało zatwierdzone przez program HumanResearch Protections Program Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego.

UJAWNIENIE

SC jest członkiem Rady Naukowej i członkiem Rady PowierniczejcystynozaFundacja Badawcza. SC jest współzałożycielem, udziałowcem i członkiem zarówno rady naukowej, jak i rady dyrektorów GenStem Therapeutics Inc. Warunki tego porozumienia zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów. Wszyscy pozostali autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

zapewnienie Gal-3^–/–myszy. Dziękujemy Lou Devanneaux i NicholeFlerchinger za pomoc techniczną, a Elizabeth Souter za przejrzenie rękopisu. Dziękujemy Christopherowi Alfonso z BDBioscience za dostarczenie myszkizapaleniecytometryczna tablica kulek i za jego pomoc w interpretacji wyników. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health RO1-DK090058 i R01-DK110162,CystynozaResearch Foundation oraz Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (CIRM, CLIN-09230). TL jest wspierany przez stypendium dla absolwentów z Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB i JZ są wspierani przez stypendium zcystynozaFundacja Badawcza. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility zostało sfinansowane przez grant P30-NS047101 Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Udaru (NINDS).

BIBLIOGRAFIA

1. Miedżitow R. Pochodzenie i fizjologiczne rolezapalenie. Natura. 2008;454:428-435.

2. Donath MY. Kierowaniezapaleniew leczeniu cukrzycy typu 2. Cukrzyca Otyłość Metab. 2013;15(suppl 3):193-196.

3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Cytokines w zespole ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej: przegląd. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth. 2010;2:161–175.

4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Związek między krążącymi markerami stanu zapalnego a resztkową czynnością nerek u pacjentów z CRF. Jestem JNerkaDis. 2003;41:1212–1218.

5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cystynoza. N Engl J Med. 2002; 347: 111–121.

6. Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Celowanie wcystynozynado błony lizosomalnej wymaga sygnału opartego na tyrozynie i nowego motywu sortowania. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.

7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystynozyna, białko uszkodzone wcystynoza, jest lizosomalnym transporterem cystyny ​​sterowanym przez H(). EMBO J. 2001;20:5940-5949.

8. Cherqui S, Courtoy PJ. Zespół nerkowy Fanconiego wcystynoza: wglądy patogenne i perspektywy terapeutyczne. Nat Rev Nefrol. 2017;13:115–131.

9. Nesterova G, Gahl W. Nefropatycznycystynoza: późne powikłania choroby wieloukładowej. Pediatr Nefrol. 2008;23:863–878.

10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Wewnątrzlizosomalna akumulacja cystyny ​​u myszy z brakiemcystynozyna, białko uszkodzone wcystynoza. Mol Komórkowy Biol. 2002;22:7622–7632.

11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Fenotyp nerkowycystynozamysi model jest zależny od tła genetycznego. Przeszczep tarczy nefrolowej. 2010;25:1059-1066.

12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. Anomalie oczne wcystynozamodel zwierzęcy naśladuje patogenezę choroby. Pediatr Res. 2007;62:156-162.

13. Przewodnik Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Model mysi sugeruje dwa mechanizmy zmian tarczycy u niemowlątcystynoza: zmniejszona synteza tyreoglobuliny z powodu stresu retikulum endoplazmatycznego/odpowiedzi na niesfałdowane białko i zaburzenia przetwarzania lizosomalnego. Endokrynologia. 2015;156:2349–2362.

14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Terapia cysteaminą opóźnia postęp nefropatiicystynozau późnych nastolatków i dorosłych.Nerkawewn. 2012;81:179–189.

15. Cherqui S. Terapia cysteaminą: leczenie dlacystynoza, a nie lekarstwo.Nerkawewn. 2012;81:127–129.

16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nefropatycznycystynozau dorosłych: historia naturalna i efekty doustnej terapii cysteaminą. Ann Stażysta Med. 2007;147:242-250.

17. Cherqui S, Courtoy PJ. Zespół nerkowy Fanconiego wcystynoza: wglądy patogenne i perspektywy terapeutyczne. Nat Rev Nefrol. 2017;13:115–131.

18. Napolitano G, Johnson JL, He J i in. Upośledzenie autofagii, w której pośredniczy chaperon, prowadzi do selektywnych defektów degradacji lizosomalnej w chorobie spichrzania lizosomalnegocystynoza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.

19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystynozynajest składnikiem wakuolarnego kompleksu H-ATPaza-regulator-szmatka kontrolującego ssaczy cel sygnalizacji kompleksu 1 rapamycyny. J Am Soc Nefrol. 2016;27: 1678-1688.

20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Aktywacja czynnika transkrypcyjnego EB ratuje nieprawidłowości lizosomalne u cystynotycznychnerkakomórki.Nerkawewn. 2016;89:862–873.

21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: otwarta historia. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.

22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galektyna-3: jedna cząsteczka dla alfabetu chorób, od A do Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).

23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M i in. Wpływ hamowania galektyny-3 na urazy serca i nerek wywołane przez aldosteron. Awaria serca JACC. 2015; 3:59–67.

24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR i in. Farmakologiczne hamowanie galektyny-3 chroni przed nefropatią nadciśnieniową. Am J Physiol Fizjol nerek. 2015;308:F500–F509.

25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Zmodyfikowana pektyna cytrusowa zmniejsza ekspresję galektyny-3 i nasilenie choroby w ostrych eksperymentachnerkauraz. PLOS Jeden. 2011;6:e18683.

26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Blokada galektyny-3 zmniejsza zwłóknienie nerek w dwóch normotensyjnych modelach eksperymentalnych uszkodzenia nerek. PLOS Jeden. 2016;11:e0166272.

27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C i in. Wpływcystynozaglikozylacja na stabilność białka poprzez zróżnicowane dynamiczne znakowanie stabilnych izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC). Proteomika komórek Mol. 2017;16:457–468.

28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Upośledzenie autofagii, w której pośredniczy chaperon, prowadzi do selektywnych defektów degradacji lizosomalnej w chorobie spichrzania lizosomalnegocystynoza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.

29. Majeski AE, Kości JF. Mechanizmy autofagii za pośrednictwem opiekuńczej. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435-2444.

30. Xie W, Zhang L, Jiao H i in. autofagia za pośrednictwem chaperonu zapobiega apoptozie poprzez degradację BBC3/PUMA. Autofagia. 2015;11:1623-1635.

31. Li X, Ma Q, Wang J i in. Kinazy tyrozynowe c-Abl i Arg regulują lizosomalną degradację onkoproteiny Galektyny-3. Śmierć komórki różni się. 2010;17:1277-1287.

32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A i in. Przewaga makrofagów M2-spolaryzowanych w raku pęcherza moczowego wpływa na angiogenezę, stopień złośliwości guza i inwazyjność. Oncol Lett. 2016;11:3403-3408.

33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Znacznie więcej niż makrofagi M1 i M2, istnieją również makrofagi CD169( ) i TCR( ). Przód Immunol. 2015;6:263.

34. Henderson NC, Sethi T. Regulacjazapalenieprzez galektynę-3. Immunologic Rev. 2009;230:160-171.

35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Białko chemoatraktanty monocytów-1 (MCP-1): przegląd. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313–326.

36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Wyzwolona rekrutacja maszynerii ESCRT sprzyja naprawie endolizosomalnej. Nauki ścisłe. 2018;360(6384).

37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulacja alternatywnej aktywacji makrofagów przez galektynę-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.

38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Ludzka galektyna-3 to nowy chemoatraktant dla monocytów i makrofagów. J Immunol. 2000;165:2156–2164.