Ekstrakt z Cistanche Deserticola zwiększa tworzenie kości w osteoblastach
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend,Yi-Chin Fonga,ei Chih-Hsin Tangf,c
Abstrakt
Cele:Zbadaliśmy wpływCistanche deserticola Ma. (CD) w sprawie tworzenia kości przez hodowane osteoblasty.MetodyZmineralizowany test tworzenia guzków wykorzystano do zbadania wpływu CD in vitro na tworzenie kości. Ekspresję mRNA fosfatazy alkalicznej (ALP), białek morfogenetycznych kości (BMP)-2 i osteopontyny (OPN) analizowano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Mechanizm działania ekstraktu CD badano za pomocą western blottingu. Działanie przeciw osteoporotyczne in vivo ekstraktu CD oceniano u myszy z owariektomią.Najważniejsze ustaleniaEkstrakt CD nie miał wpływu na proliferację, migrację lub gojenie się ran hodowanych osteoblastów, ale zwiększał mRNA ALP, BMP-2 i OPN oraz mineralizację kości. Inhibitory kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) lub czynnika jądrowego (NF)-kB zmniejszyły tworzenie się kości indukowane ekstraktem CD oraz ekspresję ALP, BMP-2 i OPN. Jednak ekstrakt CD nie wpływał na osteoklastogenezę. Ponadto ekstrakt CD zapobiegał utracie masy kostnej indukowanej przez owariektomię in vivo.WnioskiCD może być nowym środkiem tworzenia kości w leczeniu osteoporozy.
Wprowadzenie
Kość jest złożoną tkanką złożoną z kilku typów komórek, które przechodzą ciągły proces odnowy i naprawy zwany "przebudową kości". Dwa główne typy komórek odpowiedzialne za przebudowę kości to osteoklasty, które resorbują kość, oraz osteoblasty, które tworzą nową kość. Przebudowa kości jest regulowana przez kilka hormonów ogólnoustrojowych (np. parathormon, 1, 25-hydroksywitamina D3, hormony płciowe i kalcytonina) i czynniki lokalne (np. tlenek azotu, prostaglandyny, czynniki wzrostu i cytokiny). [1]
Osteoporoza występuje, gdy resorpcja i tworzenie kości są nieskoordynowane, a nadmierny rozpad kości przekracza budowę kości. [2] Obecne metody leczenia osteoporozy obejmują bisfosfoniany, kalcytoninę i estrogen, które są inhibitorami resorpcji kości, które utrzymują masę kostną poprzez hamowanie aktywności osteoklastów. [3] Jednak wpływ tych leków na zwiększenie lub odzyskanie masy kostnej jest stosunkowo niewielki, z pewnością nie więcej niż 2% rocznie. [3] Istnieje zatem zapotrzebowanie na środki budujące kości, takie jak teryparatyd, które stymulują tworzenie nowych kości i korygują zmianę mikroarchitektury beleczkowatej, która jest charakterystyczna dla ustalonej osteoporozy. [4,5] Ponieważ tworzenie nowych kości jest przede wszystkim funkcją osteoblastów, czynniki, które działają poprzez zwiększenie proliferacji komórek linii osteoblastycznej lub indukowanie różnicowania osteoblastów, mogą nasilać tworzenie kości. [5,6]
Chociaż mechanizmy osteoporozy pozostają niejasne, są one prawdopodobnie związane ze zmniejszoną dostępnością lub działaniem czynników wzrostu kości, takich jak białka morfogenetyczne kości (BMP). [7] BMP, które są strukturalnie związane z transformującą się nadrodziną czynnika wzrostu b, zostały pierwotnie zidentyfikowane przez ich zdolność do indukowania ektopowego tworzenia kości u gryzoni. [8] BMP odgrywają ważną rolę w tworzeniu kości i różnicowaniu komórek kostnych poprzez stymulowanie aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP), a także syntezy proteoglikanu, kolagenu i osteopontyny (OPN). [9] Ostatnie badania wykazały związek między osteoporozą a specyficznymi polimorfizmami w genach BMP-2, ALP i OPN, co sugeruje, że są one związane z rozwojem osteoporozy. [10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; w skrócie CD) jest rodzimym ziołem w Chinach i jest szeroko stosowany w medycynie tradycyjnej jako środek terapeutyczny ze względu na jego właściwości uspokajające, przeciwbólowe i immunostymulujące. [11] Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że ekstrakty CD mogą stymulować odporność,[12] wymiatać wolne rodniki[13] i zwiększać aktywność dysmutazy ponadtlenkowej. [14] Środki przeciwzapalne i przeciwutleniające mogą potencjalnie leczyć osteoporozę poprzez zwiększenie tworzenia kości i / lub hamowanie resorpcji kości. [15,16] Jednak wpływ CD na czynność komórek kostnych nie został jeszcze określony. Tutaj informujemy, że ekstrakt CD nie wpłynął na proliferację, migrację lub aktywność gojenia się ran hodowanych osteoblastów, ale zwiększył ekspresję ALP, BMP-2 i OPN oraz mineralizację kości. Ponadto wykazaliśmy, że szlaki sygnałowe kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) i czynnika jądrowego (NF)-kB mogą być zaangażowane w wzrost ekspresji genów i mineralizacji kości za pośrednictwem CD. Natomiast ekstrakt CD nie hamował osteoklastogenezy in vitro. Warto zauważyć, że leczenie myszy ekstraktem CD zapobiegało utracie masy kostnej wywołanej przez jajniki in vivo. Nasze dane sugerują zatem, że CD może być stosowany do stymulowania tworzenia kości w leczeniu osteoporozy.
Cistanche deserticola
Materiały i metody
Ekstrakt i materiały z Cistanche deserticola
Ekstrakt CD został zakupiony od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajwan). Ekstrakcję i izolację CD przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (na podstawie danych spektralnych zidentyfikowali skład chemiczny, w tym beta-sitosterol, daukosterol, kwas bursztynowy, triakontanol, aktyozyd, betainę i polisacharyd). [17] Przeciwciała poliklonalne królika specyficzne dla kinaz regulowanych sygnałem p(ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-końcowych kinaz (JNK), JNK, p-p65 i p65 zostały zakupione od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA). Zestaw osteokalcyny ELISA został zakupiony od Biosource Technology (Nivelles, Belgia). Telopeptydy C-końcowe z zestawu ELISA kolagenu typu I uzyskano z Cross Laps (Herlev, Dania). Dominująco-ujemny mutant p38 został dostarczony przez dr J. Hana (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Dominujący-ujemny mutant JNK został dostarczony przez dr M. Karin (University of California, San Diego, USA). Mutant dominująco-ujemny ERK2 został dostarczony przez dr M. Cobba (South-Western Medical Center). Wszystkie inne odczynniki uzyskano z Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Hodowla komórkowa
Mysia linia komórkowa osteoblastów MC3T3-E1 została zakupiona od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Stany Zjednoczone). Komórki hodowano w 95% powietrzu, 5% CO2 z a-MEM, który został uzupełniony 20 mm HEPES i 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą, 2 mm-glutaminą, penicyliną (100 uj. / ml) i streptomycyną (100 mg / ml).
Pomiar tworzenia się zmineralizowanych guzków
Zmineralizowane tworzenie się guzków oceniano zgodnie z opisem. [18] Krótko mówiąc, osteoblasty hodowano w pożywce zawierającej witaminę C (50 mg/ml) i b-glicerofosforan (10 mm) przez dwa tygodnie, a pożywkę zmieniano co trzy dni. Po inkubacji ekstraktem CD przez 12 dni komórki przemyto dwukrotnie 20 mm roztworem soli fizjologicznej buforowanej Tris, zawierającej
0,15 m NaCl (pH 7,4), utrwalony w lodowatym 75% (v/v) etanolu przez 30 minut i suszony powietrzem. Depozycję wapnia oznaczono za pomocą barwienia alizaryny na czerwono-S. Krótko mówiąc, komórki i matrycę utrwaloną etanolem barwiono przez 1 godzinę 40 mm czerwienią alizarynową-S (pH 4,2) i szeroko spłukiwano wodą. Związaną plamę wymyto 10% (w/v) chlorkiem cetylopirydyniowym, a czerwień alizarynową S w próbkach określono ilościowo, mierząc absorbancję przy 550 nm i porównując z krzywą wzorcową. Jeden mol czerwieni alizarynowej-S selektywnie wiąże około dwóch moli wapnia.
Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
Całkowite RNA ekstrahowano z osteoblastów za pomocą zestawu TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Tajwan). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu 2 mg całkowitego RNA i startera oligo(dT). [19,20] Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) przeprowadzono przy użyciu taqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Dodano całkowite cDNA (100 ng na reakcję 25 ml) z starterami specyficznymi dla sekwencji i sondami Taqmana®. Wszystkie docelowe startery genów i sondy zostały zakupione komercyjnie, w tym b-aktyna jako kontrola wewnętrzna (Applied Biosystems). Testy qPCR przeprowadzono w trzech egzemplarzach na systemie wykrywania sekwencji Ste- pOnePlus (Applied Biosystems). Warunki cyklu obejmowały 10-minutową aktywację polimerazy w temperaturze 95°C, a następnie 40 cykli 95°C przez 15 s i 60°C przez 60 s. Próg został ustawiony powyżej nieszablonowego tła kontrolnego i w liniowej fazie amplifikacji docelowego genu, aby obliczyć numer cyklu, w którym wykryto transkrypt (oznaczony CT).
Analiza Western blot
Lizaty komórkowe przygotowano w sposób opisany wcześniej. [21,22] Białka zostały rozwiązane przez SDS-PAGE i przeniesione do membran immobilonu z polifluorku winylu (Millipore, Billerica, USA). Plamy blokowano 4% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie badano za pomocą antyludzkich przeciwciał królika przeciwko p-65 lub p-p65 (1: 1000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach plamy inkubowano sprzężonym z peroksydazą przeciwciałem wtórnym anty-królika (1: 1000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Plamy zostały zwizualizowane przez zwiększoną chemiluminescencję przy użyciu filmu X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Osteoporoza wywołana owiarkomią
Do tego badania wykorzystano samice myszy ICR, w wieku 22 ~ 28 g. Myszy poddano obustronnie owariektomii w znieczuleniu trichloro-octowym (100 mg/kg), a myszy kontrolne były pozornie operowane (Sham) dla porównania. Gęstość mineralną kości i zawartość minerałów w kościach mierzono po doustnym podaniu różnych stężeń ekstraktów CD co dwa dni przez cztery tygodnie. Całkowitą gęstość mineralną kości ciała i zawartość minerałów w kościach określono za pomocą dwuenergetycznego absorbometru rentgenowskiego (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) przy użyciu trybu dla małych obiektów, jak opisano wcześniej. [18,23] Wszystkie protokoły były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Komitet opieki nad Zwierzętami Chińskiego Uniwersytetu Medycznego.
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu pryzmatu 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Podane wartości są średnie ± SEM. Analiza statystyczna między dwiema próbkami została przeprowadzona przy użyciu testu t Studenta. Porównania statystyczne więcej niż dwóch grup przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji z testem posthoc Bonfera-Roniego. We wszystkich przypadkach P< 0.05="" was="" considered="">
Ekstrakt z Cistanche deserticola
Wyniki
Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa mineralizację kości przez osteoblasty
Dodanie ekstraktu CD przez 24 lub 48 h nie wpłynęło na proliferację mysich komórek osteoblastów MC3T3-E1 w teście MTT (dane nie pokazano). Ponieważ różnicowanie osteoblastów jest złożonym procesem obejmującym proliferację i migrację komórek, przetestowaliśmy również zdolność migracyjną komórek MC3T3-E1 po leczeniu ekstraktem CD. Stosując Testy Transwell i gojenia się ran, stwierdziliśmy, że ekstrakt CD nie wpływa na migrację osteoblastów (dane nie pokazano). Tworzenie zmineralizowanych guzków jest jednym z markerów dojrzewania osteoblastów. Zabarwienie alizaryną red S wykazało, że zmineralizowane guzki tworzyły się, gdy osteoblasty były hodowane przez dwa tygodnie w pożywce zawierającej witaminę C (50 mg / ml) i b-glicerofosforan (10 mm), a to zostało zwiększone w sposób zależny od stężenia przez dodanie CD (ryc. 1a). Dlatego ekstrakt CD indukował tworzenie się guzków kostnych przez hodowane osteoblasty, ale nie ich proliferację lub migrację. Zbadaliśmy również rolę ekstraktu CD w osteoklastogenezie indukowanej ranklem, ale nie stwierdziliśmy żadnego efektu (dane nie zostały pokazane).
Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa ekspresję fosfatazy alkalicznej, białka morfogenetycznego kości-2 i ekspresji osteopontyny w hodowanych osteoblastach
Zróżnicowane osteoblasty wykazują podwyższoną aktywność ALP, co koreluje z wysokim poziomem ekspresji enzymów. [18] Stwierdziliśmy, że leczenie ekstraktem CD przez 72 h znacznie zwiększyło aktywność osteoblastów ALP (ryc. 1b). Biorąc pod uwagę kluczową rolę BMP-2, ALP i OPN w różnicowaniu osteoblastów, sprawdziliśmy, czy ekstrakt CD wywiera wpływ na różnicowanie osteoblastów poprzez regulację ekspresji BMP-2, ALP i OPN. Leczenie komórek ekstraktem CD zwiększyło ekspresję mRNA ALP, BMP-2 i OPN w sposób zależny od stężenia (ryc. 1c), wykazując, że ekstrakt CD indukował różnicowanie osteoblastów poprzez regulację ekspresji ALP, BMP-2 i OPN.
Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa tworzenie się guzków kostnych poprzez szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem
Doniesiono, że MAPK odgrywa ważną rolę w tworzeniu kości[24,25], więc następnie zbadaliśmy, czy ten szlak sygnałowy bierze udział w mineralizacji kości indukowanej ekstraktem CD. Wstępne leczenie komórek inhibitorem ERK U0126, inhibitorem p38 SB203580 lub inhibitorem JNK SP600125 zmniejszyło mineralizację kości wzmocnioną ekstraktem CD (ryc. 2a, 3a i 4a). Co więcej, inhibitory blokowały również indukowaną ekstraktem CD ekspresję ALP, BMP-2 i OPN (ryc. 2b–4c). Transfekcja komórek z mutacją ERK2, p38 lub JNK zmniejszyła wzrost ekstraktu CD w ekspresji mRNA ALP, BMP-2 i OPN (ryc. 2c, 3c i 4c). Następnie bezpośrednio zbadaliśmy aktywację ERK, p38 i JNK po obróbce ekstraktem CD. Inkubacja komórek z ekstraktem CD indukowała ERK, p38 i fosforylację JNK (ryc. 2d, 3d i 4d). Dlatego ERK, p38 i JNK pośredniczą w zwiększonym tworzeniu kości indukowanym przez leczenie CD osteoblastów.
Ekstrakt z Cistanche deserticola zwiększa tworzenie się guzków kostnych poprzez szlak czynnika jądrowego-kB
Jak wcześniej wspomniano, aktywacja NF-kB jest niezbędna do tworzenia kości. [26,27] Następnie poddaliśmy osteoblasty inhibitorom NF-kB ditiokarbaminian pirolidyny (PDTC) i N-tozylo-L-fenyloalanina chlorometyloketon (TPCK) zakupiono od Calbiochem (Darmstadt, Niemcy) w celu ustalenia, czy aktywacja NF-kB bierze udział w mineralizacji kości indukowanej ekstraktem CD. Rycina 5a pokazuje, że wstępne leczenie osteoblastów PDTC lub TPCK hamowało tworzenie się guzków kostnych wywołanych ekstraktem CD, a także zmniejszało wzrost ekspresji ALP, BMP-2 i OPN (ryc. 5b i 5c). Fosforylacja podjednostki NF-kB p65 jest wskaźnikiem aktywacji NF-kB; [28] zgodnie z tym, odkryliśmy, że ekstrakt CD zwiększa fosforylację p65 w osteoblastach (ryc. 5d). Wyniki te wskazują, że aktywacja NF-kB jest ważna dla indukowanej ekstraktem CD ekspresji ALP, BMP-2 i OPN oraz tworzenia guzków kostnych.
Hamowanie utraty masy kostnej przez ekstrakt z Cistanche deserticola u myszy poddanych owariektomii
Aby zbadać wpływ ekstraktu CD na utratę masy kostnej, osteoporozę wywołano u samic myszy za pomocą owariektomii. Zgodnie z oczekiwaniami, myszy z owariektomią wykazywały zmniejszoną całkowitą gęstość mineralną kości ciała i zawartość minerałów w kościach (ryc. 6a i 6b). Leczenie ekstraktem CD przez cztery tygodnie hamowało utratę gęstości mineralnej kości i zawartości mineralnej kości w sposób zależny od dawki (ryc. 6a i 6b). Stężenie ALP we krwi może odzwierciedlać aktywność osteoblastyczną. [29] Jak pokazano na rycinie 6c, ekstrakt CD hamował spadek aktywności ALP w surowicy indukowany przez jajniki. Ponadto ekstrakt CD zwiększył również poziom osteokalcyny, markera tworzenia kości i zmniejszył poziom C-końcowych telopeptydów kolagenu typu I, markera resorpcji kości (ryc. 6d i 6e). Odkrycia te potwierdzają zatem siłę i skuteczność ekstraktu CD w zapobieganiu utracie masy kostnej in vivo.
Dyskusja
Cistanche deserticolaMa, rodzime zioło w Chinach, jest szeroko stosowane w medycynie tradycyjnej do różnych zabiegów terapeutycznych ze względu na jego działanie uspokajające, przeciwbólowe i immunostymulujące. [11–15] Tutaj wykazaliśmy, że ekstrakt CD indukował mineralizację kości w hodowanych osteoblastach, ale nie wpływał na ich migrację komórkową ani proliferację. Ponadto odkryliśmy, że ALP, BMP-2 i OPN są docelowymi białkami sygnalizacji indukowanej ekstraktem CD, która wymaga aktywacji ERK, p38, JNK i NF-kB.
Kość jest złożoną tkanką złożoną z kilku typów komórek, które są stale poddawane procesowi odnowy i naprawy. [30] Gdy resorpcja i tworzenie kości są niezrównoważone, rozpad kości zastępuje tworzenie kości i wyniki osteoporozy. [30] Użyliśmy myszy z owariektomią do zbadania przeciw osteoporotycznego działania ekstraktu CD. Myszy z owariektomią miały zmniejszoną całkowitą gęstość mineralną kości ciała i zawartość minerałów w kościach, co zostało złagodzone przez leczenie ekstraktem CD. Ekstrakt CD zwiększył również poziom w surowicy markera osteogennego ALP i osteokalcyny. Dlatego CD jest środkiem tworzącym kości, który zapobiega utracie masy kostnej spowodowanej owariektomią in vivo.
Chociaż mechanizmy osteoporozy nie są całkowicie jasne, są one prawdopodobnie związane ze zmniejszoną dostępnością lub zmniejszonym działaniem czynników wzrostu kości, takich jak ALP, BMP-2 i OPN. Te trzy czynniki odgrywają ważną rolę w procesie tworzenia i przebudowy kości[31] i zostało dobrze udokumentowane, że stymulacja różnicowania komórek osteoblastów charakteryzuje się głównie zwiększoną ekspresją ALP, BMP-2 i OPN. [32] W tym badaniu stwierdziliśmy, że ekstrakt CD zwiększa ekspresję ALP, BMP-2 i OPN oraz zwiększa mineralizację kości. Dlatego ekstrakt CD pośredniczy w tworzeniu kości częściowo poprzez regulację ekspresji ALP, BMP-2 i OPN.
Doniesiono, że p38 bierze udział w regulacji ekspresji ALP podczas różnicowania komórek osteoblastycznych; [33] Podobnie ERK1/2 jest ważny dla proliferacji i różnicowania osteoblastów. [34,35] JNK bierze udział w tworzeniu osteoklastów. [36] Wykazaliśmy tutaj, że ekstrakt CD indukował fosforylację ERK, p38 i JNK, a inhibitory tych enzymów antagonizowały nasilenie mineralizacji kości za pośrednictwem ekstraktu CD, co sugeruje, że aktywacja ERK, p38 i JNK odgrywają obowiązkową rolę w tworzeniu kości indukowanych ekstraktem CD przez osteoblasty. Ponadto inhibitory enzymów i dominująco-ujemne mutanty ERK, p38 i JNK zmniejszały ekspresję ALP, BMP-2 i OPN wzmocnioną ekstraktem CD. Dane te sugerują, że aktywacja szlaków ERK, p38 i JNK jest wymagana do zwiększenia ekspresji i dojrzewania ALP, BMP-2 i OPN spowodowanego ekstraktem CD w osteoblastach. Zgłaszano, że ERK zwiększa proliferację i różnicowanie osteoblastów. [34,35] Nie wykryliśmy jednak wpływu ekstraktu CD na proliferację osteoblastów. Dlatego inne szlaki mogły przeciwdziałać efektowi ERK po stymulacji ekstraktem CD lub być niezbędne do proliferacji. W związku z tym odkryliśmy, że inhibitory PI3K i Akt zmniejszają również mineralizację kości indukowaną ekstraktem CD oraz ekspresję mRNA ALP, BMP-2 lub OPN (dane nie pokazano). Dlatego te szlaki mogą być wymagane do tworzenia kości indukowanych ekstraktem CD.
Wykazano, że NF-kB kontroluje funkcję osteoblastów w kości. [37] Wyniki tego badania pokazują, że aktywacja NF-kB przyczynia się do indukowanej ekstraktem CD mineralizacji kości oraz ekspresji ALP, BMP-2 i OPN w hodowanych osteoblastach oraz że inhibitory szlaku sygnałowego zależnego od NF-kB (PDTC i TPCK) hamowały mineralizację kości indukowaną ekstraktem CD oraz ekspresję ALP, BMP-2 i OPN. p65 jest fosforylowany w Ser536 przez różne kinazy w kilku szlakach sygnałowych, co zwiększa potencjał transaktywacji p65. [38] Wyniki tego badania wykazały, że ekstrakt CD zwiększa fosforylację p65. Podsumowując, wyniki te sugerują, że aktywacja NF-kB jest wymagana do tworzenia kości indukowanych ekstraktem CD w hodowanych osteoblastach. Odkryliśmy również, że inhibitory ERK, p38 i JNK odwracały indukowaną ekstraktem CD aktywność lucyferazy NF-kB (dane nie pokazane), zgodnie z tym, że enzymy te są wcześniejszymi mediatorami aktywacji NF-kB indukowanej ekstraktem CD. Dlatego ekstrakt CD indukuje tworzenie kości poprzez szlaki ERK / p38 / JNK / i NF-kB.
Wnioski
Badanie to wykazało, że ekstrakt CD indukuje różnicowanie i dojrzewanie osteoblastów, ale nie proliferację ani migrację. Ekstrakt CD zwiększył również ekspresję ALP, BMP-2 i OPN oraz mineralizację kości. Wykazaliśmy, że szlaki ERK, p38, JNK i NF-kB biorą udział w tworzeniu kości za pośrednictwem ekstraktu CD oraz ekspresji ALP, BMP-2 i OPN. Ponadto ekstrakt CD zapobiegał utracie masy kostnej in vivo indukowanej przez jajniki. Dlatego CD może być korzystne w stymulowaniu tworzenia kości w leczeniu chorób osteoporotycznych.
