Polisacharyd Cistanche Deserticola osłabia osteoklastogenezę i resorpcję kości poprzez hamowanie sygnalizacji RANKL i wytwarzania reaktywnych gatunków tlenu

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song i inni

Osteoporoza to choroba metaboliczna charakteryzująca się osteopenią i pogorszeniem mikrostruktury kości. Osteoklasty są głównymi komórkami efektorowymi, które degradują macierz kostną, a ich nieprawidłowa funkcja prowadzi do rozwoju osteoporozy. Akumulacja reaktywnych form tlenu (ROS) podczas metabolizmu komórkowego sprzyja proliferacji i różnicowaniu osteoklastów, przez co odgrywają one ważną rolę w osteoporozie.Cistanchedeserticolapolisacharyd(CDP) ma działanie przeciwnowotworowe, przeciwzapalne i przeciwutleniające. Jednak wpływ CDP na osteoklasty jest niejasny. W tym badaniu wykorzystano barwienie kwaśnej fosfatazy opornej na winian, immunofluorescencję, reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją oraz analizę Western blot w celu wykazania, że ​​CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamowała osteoklastogenezę i resorpcję hydroksyapatytu. Ponadto CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamował również ekspresję genów markerowych osteoklastów, w tym Ctsk, Mmp9 i Acp5, i nie miał wpływu na aktywator receptora ekspresji jądrowego czynnika κB (RANK). Analizy mechanistyczne wykazały, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)zwiększa ekspresję enzymów antyoksydacyjnych w celu osłabienia produkcji ROS za pośrednictwem RANKL w osteoklastach i hamuje czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T i aktywację kinazy białkowej aktywowanej mitogenami. Wyniki te sugerują, że CDP może stanowić kandydata na lek do leczenia osteoporozy spowodowanej nadmierną aktywnością osteoklastów.

SŁOWA KLUCZOWEresorpcja kości,Cistanchedeserticolapolisacharyd, MAPK, osteoklasty, reaktywne formy tlenu

kulturystyka cistanche

1|WPROWADZANIE

Równowaga między tworzeniem kości za pośrednictwem osteoblastów i resorpcją kości za pośrednictwem osteoklastów odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy metabolicznej kości (Manolagas, 2000; Zhu i wsp., 2018). Gdy resorpcja kości przewyższa tworzenie kości, dochodzi do osteoporozy, która charakteryzuje się zmniejszoną masą kostną i uszkodzeniem mikrostruktury kości (Ikeda, 2008). Osteoporoza jest częstą chorobą u osób starszych i kobiet po menopauzie, a jej patogeneza nie została w pełni wyjaśniona (Cooper i Melton, 1992). Niedobór estrogenów jest główną przyczyną osteoporozy (Manolagas, O'Brien i Almeida, 2013). Ponadto reaktywne formy tlenu (ROS) mogą być indukowane przez aktywator receptora ligandu jądrowego czynnika κB (RANKL) i są związane z tworzeniem osteoklastów (Yip et al., 2005), a tym samym mogą przyczyniać się do rozwoju osteoporozy (Manolagas, 2010). Niektóre badania wykazały, że niedobór antyoksydantów Nrf2 zwiększa poziom ROS i sprzyja indukowanemu przez RANKL różnicowaniu osteoklastów (Hyeon, Lee, Yang i Jeong, 2013). Dlatego zmniejszenie produkcji ROS podczas różnicowania osteoklastów powinno być oceniane jako strategia terapeutyczna w leczeniu osteoporozy.

Osteoklasty pochodzą z linii krwiotwórczej monocytów lub makrofagów i są jedynymi komórkami wielojądrowymi, które wykonują resorpcję kości (Teitelbaum, 2000). Dlatego badania dotyczące tworzenia osteoklastów mają duże znaczenie w opracowywaniu skutecznych metod leczenia chorób metabolizmu kości (Lorenzo, 2017). Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i RANKL, wytwarzane przez osteoblasty i aktywowane limfocyty T, są ważnymi cytokinami regulującymi osteoklastogenezę (Kim i Kim, 2016; Teitelbaum i Ross, 2003). RANKL indukuje ekspresję czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFATc1), który jest krytycznym czynnikiem transkrypcyjnym aktywnym podczas tworzenia osteoklastów (Ishida i wsp., 2002). Aktywowany NFATc1 promuje ekspresję genów markerowych osteoklastów, takich jak kwaśna fosfataza odporna na winian (TRAcP) i katepsyna K (CTSK), które regulują osteoklastogenezę i funkcję osteoklastów (Balkan i wsp., 2009; Crotti i wsp., 2008).

Cistanchedeserticolapolisacharyd(CDP) jest izolowany z mięsistych łodygCistanchei posiada regulację immunologiczną, przeciwnowotworową, przeciwstarzeniową i inne efekty farmakologiczne (Guo i in., 2016; Jia, Guan, Guo i Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)miał hamujący wpływ na indukowaną lipopolisacharydami produkcję tlenku azotu (NO) w mysich komórkach mikrogleju (komórki BV-2; Nan i wsp., 2013). Ponadto ekstrakt bogaty w fenyletanoidy (ECD)Cistanchepoprawiły zdolność pływania myszy poprzez zmniejszenie uszkodzeń mięśni, opóźnienie gromadzenia kwasu mlekowego i poprawę magazynowania energii (Cai et al., 2010). Jednak wpływ CDP na funkcję i aktywność osteoklastów pozostaje nieznany.

W tym badaniu wykazaliśmy, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamuje indukowane RANKL różnicowanie osteoklastów i resorpcję kości. Podstawowym mechanizmem było to, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)wzmacnia ekspresję enzymów antyoksydacyjnych w celu osłabienia produkcji ROS, a następnie tłumi kaskady sygnalizacyjne aktywowane przez RANKL i kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). Wyniki te sugerują, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)może być stosowany w leczeniu osteoporozy spowodowanej nadmierną osteoklastyczną resorpcją kości.

maca ginseng cistanche

2|MATERIAŁY I METODY

2.1|Materiały

CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)(czystość > 98 procent) zakupiono w Solarbio (Pekin, Chiny) i przygotowano w stężeniu zapasowym 1 mM w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Przeciwciała są specyficzne dla c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, ufosforylowane (p)-ERK, p-p38, p-JNK i ‐aktyna zostały uzyskane od Santa Cruz Biotechnology (San Jose, Kalifornia). Przeciwciała przeciwko V-ATPazie d2 wytworzono jak opisano wcześniej (H. Feng i wsp., 2009). System testowy 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium (MTS) i lucyferazy otrzymano z firmy Promega (Sydney, Australia) . Rekombinowany M-CSF zakupiono od R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinowane białko GST-rRANKL poddano ekspresji i oczyszczeniu, jak opisano wcześniej (Xu i wsp., 2000).

2.2|Hodowlę komórkową

Komórki RAW264.7 (mysie komórki makrofagów) otrzymano z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) i hodowano w zmodyfikowanej minimalnej pożywce podstawowej (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australia) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 100 j./ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny (podłoże kompletne). Monocyty pochodzące ze szpiku kostnego (BMM) wyizolowano z 6-tygodniowych myszy C57BL/6J, które uśmiercono zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu Australii Zachodniej (RA/3/100/1244). Kości długie wypreparowano z tkanek miękkich, a szpik kostny wypłukano z kości udowej i piszczelowej, a następnie hodowano w pełnej pożywce w obecności M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Test osteoklastogenezy

BMM wysiano na 96-dołkowych płytkach hodowlanych z gęstością 6 × 103 komórek na dołek i potraktowano pełną pożywką zawierającą M-CSF (50 ng/ml) i GST-rRANKL (100 ng/ml), w obecności lub brak różnych stężeń CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>trzy jądra) zidentyfikowano jako osteoklasty.

2.4|Testy cytotoksyczności

BMM wysiano na 96-dołkowych płytkach w ilości 6 × 103 komórek na dołek i pozostawiono na noc, aby przylgnęły. Następnego dnia komórki inkubowano z różnymi stężeniami CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd). Po kolejnych 48 godzinach dodano roztwór MTS (20 µl/studzienkę) i inkubowano z komórkami przez 2 godziny. Absorbancję przy 490 nm określano czytnikiem mikropłytek (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Barwienie immunofluorescencyjne

BMM wysiano w gęstości 6 × 103 komórek na studzienkę w obecności M-CSF (50 ng/ml) przez noc. Komórki następnie stymulowano M-CSF i GST-rRANKL (100 ng/ml) aż do powstania dojrzałych osteoklastów. Osteoklasty następnie leczono różnymi stężeniami CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)przez 48 godzin przed utrwaleniem 4% paraformaldehydem, permeabilizacją 0,1% Tritonem X-100–PBS i blokowaniem 3% albuminą surowicy bydlęcej w PBS. Przygotowane komórki inkubowano z falloidyną skoniugowaną z rodaminą przez 45 minut w ciemności w celu wybarwienia F-aktyny. Następnie komórki przemyto PBS, jądra wybarwiono kontrastowo 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i założono szkiełkami nakrywkowymi do mikroskopii konfokalnej.

doświadczenie cistanche

2.6|Test resorpcji hydroksyapatytu

Aby zmierzyć aktywność osteoklastów, BMM (1 × 105 komórek na dołek) hodowane na sześciodołkowych płytkach pokrytych kolagenem (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) stymulowano GST-rRANKL (100 ng/ml) i M-CSF (50 ng/ ml) aż do wytworzenia dojrzałych osteoklastów (Zhou i wsp., 2016). Następnie komórki delikatnie oddzielono od płytki przy użyciu roztworu do dysocjacji komórek (Sigma-Aldrich) i taką samą liczbę dojrzałych osteoklastów wysiano na poszczególne dołki w 96-dołkowych płytkach pokrytych hydroksyapatytem (Corning Osteoassay, Corning, NY). Dojrzałe osteoklasty inkubowano w pożywce zawierającej GST-rRANKL i M-CSF z lub bez CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)we wskazanych stężeniach. Po 48 godzinach połowę studzienek barwiono immunohistochemicznie pod kątem aktywności TRAcP, jak opisano powyżej, w celu oceny liczby komórek wielojądrowych na studzienkę. Pozostałe studzienki wybielano przez 10 minut w celu usunięcia komórek i umożliwienia pomiaru resorbowanych obszarów. Resorbowane obszary sfotografowano pod standardową mikroskopią świetlną i zastosowano oprogramowanie Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) do ilościowego określenia procentowego obszaru powierzchni hydroksyapatytu wchłoniętej przez osteoklasty.

2.7|Testy reporterowe lucyferazy

Aby zbadać aktywację transkrypcji NFATc1, komórki RAW264.7 stabilnie transfekowano konstruktem reporterowym lucyferazy reagującym na NFATc1 (Cheng i wsp., 2018; van der Kraan i wsp., 2013). Transfekowane komórki hodowano na 48-dołkowych płytkach w gęstości 1,5 × 105 komórek na dołek i wstępnie traktowano różnymi stężeniami CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)przez 1 godz. Po wstępnym traktowaniu komórki stymulowano GST-rRANKL (100 ng/ml) przez 24 godziny, a aktywność lucyferazy mierzono przy użyciu systemu testowego lucyferazy reporterowego zgodnie z protokołem producenta (Promega).

2,8|Analiza ilościowa odwrotnej transkrypcji-reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-PCR)

Całkowity RNA wyizolowano z komórek przy użyciu odczynnika Trizol zgodnie z protokołem producenta (Thermo Fisher Scientific). Komplementarny DNA zsyntetyzowano przy użyciu odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya z 1 ug matrycy RNA i starterami oligo-dT. Amplifikację określonych sekwencji w reakcji łańcuchowej polimerazy przeprowadzono przy użyciu następującego programu: 94 stopnie przez 5 min, a następnie 30 cykli 94 stopnie przez 40 s, 60 stopni przez 40 s i 72 stopnie przez 40 s oraz końcowy etap wydłużania 5 min w 72 stopniach. Szczegółowe informacje na temat specyficznych starterów przedstawiono w Tabeli 1. Względne poziomy informacyjnego RNA obliczono przez normalizację do ekspresji genu metabolizmu podstawowego Hmbs.

2.9|Analiza Western blot

BMM hodowano w pełnej pożywce z M-CSF na 6-studzienkowych płytkach i stymulowano GST-rRANKL (100 ng/ml) przez podany czas. Komórki poddano lizie w buforze do lizy radioimmunoprecypitacyjnej, a białka rozdzielono metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu i przeniesiono na membrany z poli(fluorku winylidenu) (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Błony zablokowano w 5% odtłuszczonym mleku przez 1 godzinę, a następnie sondowano różnymi specyficznymi przeciwciałami podstawowymi z delikatnym wytrząsaniem przez noc w 4 stopniach. Błony przemyto, a następnie inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Następnie wykryto reaktywność przeciwciał za pomocą wzmocnionego odczynnika chemiluminescencji (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i zwizualizowano za pomocą Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Wykrywanie wewnątrzkomórkowego ROS

Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS wykrywano przy użyciu zestawu 2′,7′-dichlorofluoresceiny do wykrywania komórkowego ROS (Abcam, Melbourne, Australia). BMM (5 x 103 komórek na dołek) hodowano na 96-dołkowych płytkach i traktowano RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) i CDP przez 72 godziny. Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS mierzono przy użyciu dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny, który utlenia się do fluorescencyjnego DCF w obecności ROS. Komórki przepłukano w buforze Hanka i inkubowano w ciemności przez 30 min z 10 µM DCFH-DA. Obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

2.11|Analizy statystyczne

Wszystkie dane są reprezentatywne dla co najmniej trzech eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach, o ile nie wskazano inaczej. Dane wyrażono jako średnią ± SD. W celu określenia istotności różnic między wynikami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji, a następnie testy post hoc Studenta–Newmana–Keulsa, przy czym p < 00,05="" uznano="" za="">

3|WYNIKI

3.1|CDP hamuje indukowaną RANKL osteoklastogenezę i fuzję osteoklastów

Aby ustalić, czy CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)mogą hamować tworzenie osteoklastów wywołane przez RANKL, najpierw przeprowadziliśmy test osteoklastogenezy przy użyciu mysich BMM (Liu i wsp., 2013; Song i wsp., 2016). BMM leczono RANKL i M-CSF przez 5 dni ze wzrastającymi stężeniami CDP. CDP zmniejszył liczbę komórek wielojądrzastych dodatnich pod względem TRAcP, gdy stężenie CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)osiągnął 5 µM lub więcej (Rysunek 1a,b). Aby ocenić CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)toksyczność i potwierdzić, że te wyniki nie były odzwierciedleniem śmierci lub liczby komórek, przeprowadziliśmy test MTS. BMM były leczone RANKL i M-CSF przez 48 godzin z różnymi dawkami CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd). CDP nie miał wpływu na proliferację BMM przy stężeniu 15 µM lub mniejszym (Figura 1c).

Aby przetestować działanie CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)w przypadku fuzji osteoklastów indukowano osteoklasty za pomocą leczenia RANKL i M-CSF, z lub bez różnych dawek CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd). Osteoklasty wybarwiono rodaminą-falloidyną i DAPI w celu oceny liczby jąder na osteoklasty (ryc. 2a). Zarówno liczba osteoklastów, jak i średnia liczba jąder na osteoklast zmniejszyły się po CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)traktowanie (5–10 µM; Ryc. 2b,c). Dlatego CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)miał hamujący wpływ na osteoklastogenezę indukowaną przez RANKL i fuzję osteoklastów w sposób zależny od dawki.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)osłabia indukowaną przez RANKL aktywność resorpcji hydroksyapatytu osteoklastów

Przeprowadzono test resorpcji hydroksyapatytu w celu wykrycia wpływu CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)na funkcję osteoklastów (ryc. 3a). Po 24-godzinnej inkubacji liczba osteoklastów na studzienkę nie zmieniła się, podczas gdy obszar resorpcji hydroksyapatytu był znacznie zmniejszony przez traktowanie 5 i 10 µM CDP w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rysunek 3b,c). Wyniki te pokazują, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)ma silne działanie hamujące zarówno na tworzenie osteoklastów, jak i na aktywność resorpcji osteoklastów, bez jakichkolwiek efektów cytotoksycznych.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamuje ekspresję genu markera osteoklastów

Dalsze badanie hamującego działania CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)w osteoklastogenezie i osteoklastycznej resorpcji kości, BMM były leczone RANKL i M-CSF przez 5 dni przy różnych stężeniach CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd). Następnie przeprowadzono RT-PCR w celu wykrycia ekspresji genów markerowych osteoklastów. Ekspresja Nfatc1, kluczowego czynnika transkrypcyjnego podczas osteoklastogenezy, została zahamowana przez CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)w sposób zależny od dawki (rysunek 4a). Ponadto CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)(5 i 10 µM) obniżyło ekspresję genów związanych z resorpcją kości, w tym Mmp9, Ctsk i Acp5 (ryc. 4b-d).

3.4|CDP hamuje aktywność NFATc1 i ekspresję białka w dół

Aby zbadać wpływ CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)na aktywność NFATc1 indukowaną przez RANKL, przeprowadzono test reporterowy lucyferazy. Leczenie CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd), w stężeniach 5 µM i wyższych, znacząco hamował aktywność NFATc1 indukowaną przez RANKL (Rysunek 5a). Ponadto analiza Western blot wykazała, że ​​CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)istotnie tłumił ekspresję białka NFATc1 i c-Fos w BMM traktowanych RANKL i M-CSF przez 3 i 5 dni (Rysunek 5b). Ponadto ekspresja białek związanych z funkcją osteoklastów, takich jak V-ATPaza-d2 i CTSK, była obniżona w obecności CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)w porównaniu do grup kontrolnych. Jednak CDP nie miał wpływu na ekspresję RANK (Figura 5b).

3.5|CDP promuje ekspresję enzymów antyoksydacyjnych w celu zmiatania produkcji ROS podczas osteoklastogenezy wywołanej przez RANKL

Aby zbadać mechanizm leżący u podstaw hamowania osteoklastogenezy zależnej od CDP, BMM leczono RANKL (100 ng/ml) i M-CSF (50 ng/ml) razem z PBS lub CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)przez 72 godz. Zbadaliśmy wpływ CDP na wewnątrzkomórkową produkcję ROS stymulowaną przez RANKL. Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS zostały zwiększone przez traktowanie RANKL, które było atenuowane przez CDP (5 i 10 µM; Figura 6a). Zarówno liczba komórek ROS-dodatnich, jak i intensywność barwienia ROS zostały zmniejszone przez leczenie CDP w sposób zależny od dawki (ryc. 6b,c). Analiza Western blot wykazała, że ​​CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)promował ekspresję tioredoksyny (TRX1) i reduktazy glutationowej (GSR), jednocześnie hamując ekspresję indukowalnej syntazy tlenku azotu (NOS2) w BMM, które były traktowane RANKL i M-CSF przez 3 dni (Rysunek 6d).

Aby dokładniej zbadać, czy CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)zahamowaliśmy różnicowanie osteoklastów poprzez zmniejszenie produkcji ROS, następnie potraktowaliśmy BMM nadtlenkiem (10 µM), aby naśladować wysoki status ROS w komórkach. BMM były indukowane przez RANKL i M-CSF przez 3 dni, a wyniki analizy Western blot i RT-PCR wykazały, że nadtlenek promował ekspresję NFATc1 i c-Fos w porównaniu z grupami kontrolnymi. Zgodnie z wynikami na Ryc. 5, ekspresja NFATc1 i c-Fos została stłumiona przez CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)podczas gdy nadtlenek uratował hamujący wpływ CDP (Figura 6e, f). Dane te wskazywały, że CDP tłumiło ekspresję NFATc1 i c-Fos poprzez zmiatanie produkcji ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamuje szlaki MAPK podczas osteoklastogenezy wywołanej przez RANKL

Następnie zbadaliśmy wpływ CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)leczenie na ekspresję TRAF6 za pośrednictwem RANKL i aktywację szlaku MAPK. Po inkubacji w pożywce bez surowicy przez 2 godziny, BMM stymulowano RANKL, z CDP lub bez, przez 60 minut. Stymulacja CDP (10 µM) nie miała wpływu na ekspresję TRAF6 i osłabioną fosforylację JNK2 i ERK1/2 po 10 i 20 min (Figura 7). Dodatkowo fosforylacja p38 została znacząco zahamowana przez CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)leczenie trwające 60 minut w porównaniu z grupami kontrolnymi (Figura 7). Dane te pokazują, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamuje indukowane przez RANKL szlaki sygnałowe MAPK, co jest zgodne z jego hamującym wpływem na tworzenie i aktywność osteoklastów.

4|DYSKUSJA

Cistanche, znany jako „pustynny żeń-szeń”, przyciągnął ostatnio wiele uwagi ze względu na jego zdolność do modulowania odporności i działania ochronnego podczas starzenia i stresu oksydacyjnego (Jia i wsp., 2012; Snytnikova i wsp., 2012). Wykazano, że glikozydy podstawione fenylopropanoidami, główne aktywne składniki Cistanche, hamują aktywność NO w makrofagach (Ahn, Chae, Chin i Kim, 2017). PonadtoCistancheekstrakt zmniejszył stres oksydacyjny w reperfuzowanym mięśniu sercowym po niedokrwieniu i odegrał znaczącą rolę w hamowaniu szlaków apoptotycznych prowadzących do kardioprotekcji (Yu, Li i Cao, 2016). Jako ważny składnik Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)ma wiele funkcji farmakologicznych. Nasze obecne badanie wykazało, że CDP hamuje różnicowanie i aktywację osteoklastów aktywowanych przez RANKL poprzez osłabienie produkcji ROS, a także aktywacji NFAT i MAPK.

Jako kwaśna fosfataza, TRAcP występuje w różnych komórkach i występuje obficie w osteoklastach i makrofagach pęcherzykowych (Snipes, Lam, Dodd, Gray i Cohen, 1986). TRAcP jest charakterystycznym enzymem osteoklastów, a jego ekspresja jest ściśle związana z funkcją osteoklastów, uważaną za wskaźnik aktywności osteoklastów i resorpcji kości (Minkin, 1982). W naszym badaniu CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamował liczbę komórek TRAcP-dodatnich, co wskazuje, że osteoklastogeneza indukowana przez RANKL została zablokowana przez CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd). Degradacja macierzy kostnej przez osteoklasty zależy od katepsyny K (CTSK) i MMP (Gruber, 2015). Tutaj CDP znacząco obniżył ekspresję funkcjonalnych genów osteoklastów, takich jak Mmp9, Ctsk i Acp5.

Różnicowanie i funkcja osteoklastów są regulowane przez wiele ścieżek sygnałowych (Boyle, Simonet i Lacey, 2003). Po związaniu się z RANK, RANKL rekrutuje białko adaptorowe TRAF6, aby aktywować ekspresję NFATc1, który jest ważnym czynnikiem transkrypcyjnym dla tworzenia osteoklastów, wpływającym na ekspresję genów specyficznych dla osteoklastów, w tym TRAcP i CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi i wsp., 2002). W tym badaniu stwierdziliśmy, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)nie miał wpływu na ekspresję RANK i TRAF6 w osteoklastach. Jednak CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamował indukowaną przez RANKL aktywację NFATc1 podczas osteoklastogenezy BMM. Ponadto wykazano, że ROS, wytwarzane przez mitochondria w procesie dostarczania elektronów, sprzyjają proliferacji i różnicowaniu osteoklastów oraz regulowanej degradacji macierzy kostnej (Ha i wsp., 2004). Niedawne badanie wykazało, że RANKL indukuje import jądra Bach1 i osłabia produkcję enzymu antyoksydacyjnego za pośrednictwem Nrf2, zwiększając w ten sposób wewnątrzkomórkową ekspresję ROS i osteoklastogenezę u myszy (Kanzaki i wsp., 2017). Ponadto, zwiększone wewnątrzkomórkowe wytwarzanie ROS przez homocysteinę wzmagało tworzenie i aktywność osteoklastów (Koh et al., 2006). Nasze badanie wykazało, że CDP zmniejsza akumulację ROS w osteoklastach poprzez hamowanie ekspresji NOS2 i promowanie ekspresji enzymów antyoksydacyjnych, takich jak TRX1 i reduktaza glutationowa. Kiedy potraktowaliśmy BMM nadtlenkiem w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowej akumulacji ROS, wyniki, które zwiększyły ROS mogą poprawić ekspresję NFATc1, ujawniły, że ROS znajdował się powyżej NFATc1. Odkryliśmy również, że nadtlenek uratował hamujący wpływ CDP na ekspresję NFATc1. Tak więc nasze dane sugerują, że CDP hamuje akumulację ROS, hamując ekspresję NFATc1, a następnie hamując tworzenie i funkcjonowanie osteoklastów.

ERK, JNK i p38 należą do rodziny MAPK, która jest również zaangażowana w regulację różnicowania osteoklastów (Seger i Krebs, 1995). RANKL aktywuje szlak MAPK poprzez zwiększenie fosforylacji ERK, JNK i p38 (Mizukami i wsp., 2002). Wykazaliśmy, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)tłumił za pośrednictwem RANKL fosforylację kluczowych białek w szlaku MAPK, przyczyniając się w ten sposób do hamującego działania CDP na ekspresję genów markerowych osteoklastów. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie pokazujące hamujące działanie CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)na produkcji ROS, NFAT i aktywacji MAPK, reprezentujących nowe mechanizmy działania CDP in vitro.

Podsumowując, wykazaliśmy, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)osłabia osteoklastogenezę i resorpcję hydroksyapatytu oraz ekspresję genów markerowych osteoklastów, w tym Ctsk, Mmp9 i Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)był w stanie zahamować produkcję ROS za pośrednictwem RANKL, a także aktywację NFAT i MAPK (ryc. 8). Łącznie nasze wyniki sugerują, że CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)może reprezentować kandydata na lek do leczenia schorzeń związanych z osteoklastami, którym towarzyszy nadprodukcja ROS.

RYSUNEK 8 Schemat ideowy CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)funkcja w różnicowaniu osteoklastów. CDP(Cistanchedeserticolapolisacharyd)hamuje indukowaną przez RANKL produkcję ROS, a także aktywację NFATc1 i MAPK, hamując w ten sposób osteoklastogenezę. CDP,Cistanchedeserticolapolisacharyd; MAPK, kinaza białkowa aktywowana mitogenami; NFATc1, czynnik jądrowy aktywowanej komórki T; RANKL, aktywator receptora ligandu jądrowego czynnika κB; ROS, reaktywne formy tlenu [kolor można zobaczyć na wileyonlinelibrary.com]

PODZIĘKOWANIE

Badanie było wspierane przez Chińską Fundację Nauki Przyrody (81572164), Krajowy Program Badań i Rozwoju Technologii Kluczowych Chin (2017YFC1103300), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangxi (2016GXNSFAA380295) oraz Projekt Badawczy Nauki i Technologii Uniwersytetu w Guangxi Prowincja (KY2015YB054). Jest również częściowo wspierany przez Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards oraz Australijska Rada ds. Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC, nr 1107828 i 1027932).

KONFLIKT INTERESÓW

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Z: 'Cistanchedeserticolapolisacharydosłabia osteoklastogenezę i resorpcję kości poprzez hamowanie sygnalizacji RANKL i produkcji reaktywnych form tlenu przez Dezhi Song i in.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684