Wyniki kontrolowanego zakażenia malarią u ludzi (CHMI) u dorosłych Kenijczyków są związane z wcześniejszą ekspozycją na malarię i odpowiedzią przeciwciał anty-schizontowych

Abstrakcyjny

Tło:

Osoby żyjące na obszarach endemicznych nabywają odporność na malarię po wielokrotnym narażeniu na pasożyty. Staraliśmy się ocenić model kontrolowanej infekcji malarią u ludzi (CHMI) jako sposobu badania naturalnie nabytej odporności u dorosłych Kenijczyków z różnym narażeniem na malarię.

Związek między ludzkim zakażeniem malarią a odpornością jest złożony. Malaria jest chorobą zakaźną wywoływaną przez pasożyta Plasmodium, który dostaje się do organizmu i zakaża czerwone krwinki. Po zakażeniu układ odpornościowy organizmu zainicjuje serię odpowiedzi immunologicznych w celu zwalczania pasożyta malarii. Jednak odpowiedź immunologiczna może spowodować uszkodzenie żywiciela podczas kontrolowania pasożyta. I odwrotnie, niedobór odporności może prowadzić do ciężkiego i długotrwałego zakażenia malarią, które może nawet doprowadzić do śmierci.

Z jednej strony odpowiedź immunologiczna organizmu ludzkiego jest ściśle związana z cyklem życiowym pasożyta malarii. W początkowej fazie zakażenia Plasmodium Plasmodium zakorzenia się i szybko rozmnaża, a duża liczba patogenów gromadzi się w krwinkach czerwonych i uwalnia. W tym czasie komórki odpornościowe organizmu reagują szybko, uwalniając cytokiny w celu zabicia pasożyta malarii i zwalczania początkowych stadiów infekcji. Podczas rozwoju zakażenia Plasmodium profil szlaku komórek odpornościowych staje się bardziej złożony, tworząc delikatną równowagę między Plasmodium a ludzkim żywicielem. Jeśli jednak układ odpornościowy reaguje nadmiernie, może to prowadzić do wysokiej gorączki, dreszczy, zmęczenia i innych objawów u pacjentów.

Z drugiej strony na funkcję odpornościową organizmu człowieka ma wpływ wiele czynników. Na przykład genetyka, odżywianie, wiek, płeć, historia infekcji i inne czynniki mogą wpływać na odpowiedź immunologiczną danej osoby. Niektóre objawy niedoboru odporności osłabiają funkcje odpornościowe organizmu, narażając w ten sposób osobę na większe ryzyko zachorowania na malarię lub inne choroby zakaźne. Te niedobory odporności mogą być wrodzone, takie jak mutacje w określonych genach, lub nabyte, takie jak infekcje wirusowe, takie jak AIDS.

Zatem związek między zakażeniem malarią a odpornością u ludzi jest złożony i wymaga rozważenia wielu czynników. W zapobieganiu i leczeniu malarii naukowcy muszą zidentyfikować i zrozumieć wzajemne zależności między odpowiedzią immunologiczną a infekcją Plasmodium. Widać, że musimy poprawić naszą odporność. Cistanche może wzmacniać odporność. Popiół mięsny zawiera różne biologicznie aktywne składniki, takie jak polisacharydy, dwa grzyby, Huang Li itp. Składniki te mogą stymulować różne układy odpornościowe w komórkach podobnych do komórek mięsa, zwiększając ich aktywność immunologiczną.

Kliknij korzyści zdrowotne cistanche

Metody:

Przeanalizowaliśmy dane od 142 dorosłych Kenijczyków z trzech lokalizacji reprezentujących różne obszary endemiczności malarii (Ahero, Kilif North i Kilif South) włączonych do badania CHMI ze szczepem Plasmodium falciparum sporozoity NF54 (Sanaria® PfSPZ Challenge). Aby zidentyfikować wyniki in vivo, które najlepiej odzwierciedlały naturalnie nabytą odporność, parametry oparte na pomiarach qPCR porównano z poziomami przeciwciał anty-schizontowych i obecnością jako zastępczymi markerami naturalnie nabytej odporności.

Wyniki:

Czas do punktu końcowego był ściślej skorelowany z przeciwciałami anty-schizontowymi i miejscem zamieszkania niż inne parametry pasożyta, takie jak tempo wzrostu lub średnia gęstość pasożyta. W porównaniu z obserwacyjnymi badaniami terenowymi u dzieci, w których zaobserwowano, że 0,8% zmienności wyników leczenia malarii można wytłumaczyć przeciwciałami przeciw schizontom, w modelu CHMI dychotomizowane przeciwciała przeciw schizontom wyjaśniały 17% zmienność.

Wnioski:

Model CHMI jest wysoce skuteczny w badaniu markerów naturalnie nabytej odporności na malarię. Rejestracja badania Clinicaltrials.gov numer NCT02739763. Zarejestrowano 15 kwietnia 2016 r.

Słowa kluczowe:

Ekspozycja na malarię, kontrolowana ludzka infekcja malarią, Plasmodium falciparum, odpowiedź przeciwciał anty-schizontowych.

Tło

Malaria wywołana przez Plasmodium falciparum pozostaje pilnym zagrożeniem zdrowotnym na całym świecie. Zachęcający postęp w jego kontroli został poczyniony w r

niektórych obszarach Afryki [1], ale eliminacja nie wydaje się realistyczna w wielu obszarach. Obecni wiodący kandydaci na szczepionki oparte są na białku circumsporozoitowym (CSP) i chronią przed klinicznymi objawami choroby P. falciparum u dzieci [2, 3]. Wyższą skuteczność szczepionki przeciwko objawom klinicznym można osiągnąć poprzez wywołanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom z bezpłciowych stadiów krwi [4]. Ścieżka rozwoju klinicznego każdej potencjalnej szczepionki jest kosztowna i długa. Żadna z szczepionek kandydujących na etapie krwi poddanych próbom terenowym nie przeszła do badań fazy III [5, 6]. Potrzeba zrozumienia i zbadania naturalnie nabytej odporności na malarię ma fundamentalne znaczenie dla selekcji antygenów i projektowania szczepionek. Powszechnym podejściem jest stosowanie badań immunoepidemiologicznych w regionach endemicznych malarii, gdzie reakcje immunologiczne z badań przekrojowych dzieci są powiązane z ryzykiem kolejnych epizodów malarii [7–11]. Ograniczeniem tego podejścia było poleganie na niekontrolowanej, naturalnej, ale heterogenicznej ekspozycji na malarię [8, 9, 12], jak również narażeniu na genetycznie zróżnicowane pasożyty [13] w terenie.

Badania kontrolowanego zakażenia malarią u ludzi (CHMI) mogą potencjalnie przyspieszyć wybór antygenów do opracowania szczepionki poprzez kontrolowanie narażenia na malarię, w tym szczepu pasożyta, a także poziomu dawki zakaźnej. Ze względów etycznych CHMI wymaga raczej dorosłych wolontariuszy niż dzieci. Na terenach endemicznych odporność nabywa się z wiekiem, a osoby dorosłe zwykle mają wysoki poziom odporności na skutki infekcji [14]. Niemniej jednak, nawet wśród dorosłych poziom odporności może być zmienny. Niedawno opisaliśmy wyniki kliniczne i bezpieczeństwo CHMI u dorosłych Kenijczyków po zakażeniu kriokonserwowanymi żywotnymi, aseptycznymi i oczyszczonymi sporozoitami Plasmodium falciparum (PfSPZ Challenge) w dawce 3200 wstrzykniętej strzykawką [15].

Wykazaliśmy, że stosując CHMI w tej populacji 142 dorosłych narażonych wcześniej, 26 (18,3 procent) miało objawy gorączki i było leczonych; 30 (21,1 procent) osiągnęło poziom wyższy lub równy 500 pasożytów/µl i zostało poddanych leczeniu; 53 (37,3 procent) miało parazytemię bez spełnienia progów leczenia; podczas gdy 33 (23,2 procent) pozostało z negatywnym wynikiem qPCR (w podgrupie ochotników, niektórzy z tych z ujemnym wynikiem qPCR między 8 a 10 dniem po zakażeniu mieli niską parazytemię w porównaniu z dwiema innymi metodami qPCR) [15]. Wyniki te są zgodne z innymi badaniami CHMI przeprowadzonymi na ochotnikach z terenów endemicznych [16, 17]. Jednak wyniki CHMI, które są najsilniej związane z naturalnie nabytą odpornością, nie zostały jeszcze określone. Ponadto kategoryzacja na wielopoziomowe opisowe wyniki nie maksymalizuje mocy analitycznej dla korelatów odporności, a klasyfikacja binarna lub zmienna ciągła byłaby analitycznie optymalna.

Dlatego w tym badaniu przeprowadziliśmy analizę z wykorzystaniem odpowiedzi przeciwciał anty-schizontowych i miejsca zamieszkania jako surogatów odporności. Zbadaliśmy różne parametry wzorców wzrostu pasożytów podczas CHMI. Miało to na celu określenie, które parametry były najściślej związane z tymi dwoma surogatami odporności i określenie, czy którykolwiek z nich był bardziej dyskryminujący odporność gospodarza niż standardowe badania immuno-epidemiologiczne przeprowadzone w terenie.

Metody

Projekt badania i populacja

Opublikowano pełny protokół [18] oraz opis bezpieczeństwa i wyniku [15]. W skrócie, dane z badania CHMI-SIKA, które było otwarte, bez zaślepionych i nierandomizowanych, w którym wszyscy ochotnicy otrzymali wstrzyknięcie dożylne [bezpośrednia inokulacja żylna (DVI)] dawki 3,2 × 103 PfSPZ Challenge Szczepu PfNF54 (tj. kriokonserwowanego, zakaźnego sporozoity). Ochotników monitorowano pod kątem parazytemii krwi za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w celu określenia wzrostu pasożyta. Wybrano dawkę 3,2 × 103 PfSPZ, ponieważ zainfekowała ona 100 procent ochotników nieleczonych wcześniej malarią, poddawanych CHMI w badaniach w USA i UE [19, 20]. PfNF54 jest pochodzenia afrykańskiego i dlatego oczekuje się, że<100% of African volunteers with well-developed naturally acquired immunity will become infected [21].

Stężenie leku przeciwmalarycznego

Retrospektywnie zmierzyliśmy stężenia leków przeciwmalarycznych (artemeter, dihydroartemizynina, sulfadoksyna, pirymetamina, chlorochina, lumefantryna i dibutylo-lumefantryna), retrospektywnie na dzień przed prowokacją (C-1) i po prowokacji (przy C plus 8) [15] . Wykluczyliśmy te, u których stężenie leku przekraczało minimalne stężenie hamujące (MIC) dla lumefantryny, ale zachowaliśmy te, u których stężenie leku było niższe od MIC dla sulfadoksyny (pod nieobecność pirymetaminy) i śladowe ilości chlorochiny, jak opisano wcześniej [15].

Poziom przeciwciał anty‑schizontowych

Próbki osocza badano metodą ELISA na obecność ludzkiej IgG przeciwko ekstraktowi schizontu, jak opisano wcześniej [22, 23]. Pasożyty szczepu P. falciparum 3D7 hodowano do stadium schizonta w celu przygotowania ekstraktu ze schizonta. Aby przeprowadzić testy ELISA, ekstrakt zastosowano do powlekania płytek o wysokiej absorbancji w ustalonym stężeniu, które wykazało nasycenie odpowiedzi przy użyciu osocza od osób z hiperimmunizacją. Test powtarzano, jeśli podwójne wartości gęstości optycznej (OD) dla pojedynczej próbki osocza różniły się o współczynnik większy niż 1,5. Pula próbek surowicy z obszaru w Afryce, gdzie malaria jest wysoce endemiczna, została zmiareczkowana na każdej płytce i działała zarówno jako kontrola pozytywna, jak i dostarczyła wartości dla krzywej standardowej do konwersji odczytów gęstości optycznej (OD) na stężenia (jednostki przeciwciał, AU) .

Lokalizacja zamieszkania

Ochotników rekrutowano z różnych regionów endemicznych malarii w Kenii: Ahero w zachodniej Kenii (region o umiarkowanej lub wysokiej transmisji); Kilif North na wybrzeżu Kenii (niska transmisja malarii lub jej brak); i Kilif South (region o umiarkowanej transmisji) [1, 24]. W tej analizie wolontariuszy z Ahero i Kilif South połączono jako mieszkańców o intensywności „wysokiej transmisji”, a Kilif North jako mieszkańców o intensywności „niskiej transmisji”.

Wykrywanie pasożytów metodą qPCR

W celu wykrycia pasożyta próbki krwi żylnej pobierano dwa razy dziennie od 8 do 15 dnia CHMI, a następnie raz dziennie od 16 do 22 dnia CHMI do analizy qPCR poprzez wykrywanie genu 18 S rybosomalnego RNA P. falciparum [15] w trzykrotnie w teście TaqMan przy użyciu wcześniej opisanych starterów i sond [25]. Kontrolę bez matrycy zastosowano jako kontrolę negatywną (w studzienkach w trzech powtórzeniach) z ilościową oceną pasożyta względem znanych wzorców hodowanych pasożytów, obejmujących 6 seryjnych rozcieńczeń wyekstrahowanego DNA, również wykonanych w trzech powtórzeniach. Hodowane wzorce pasożytów wytworzono w 3 różnych partiach. Wybrane próbki zostały ponownie przebadane z każdej kohorty CHMI w odniesieniu do ostatecznego zestawu standardów, w tym zewnętrznej ilościowej kontroli jakości WHO [26].

Analiza statystyczna

Wyniki PCR przedstawiono jako średnią geometryczną z trzech powtórzonych testów w każdym punkcie czasowym. Czas do leczenia to liczba dni między prowokacją a podjęciem decyzji o leczeniu, ponieważ: (a) ochotnik osiągnął ustalony wcześniej próg 500 pasożytów falciparum/ml metodą qPCR; (b) rozwinęły się u nich objawy gorączkowe, a klinicyści leczyli ich przy niższym zagęszczeniu pasożytów lub (c) dotarli do końca badania bez osiągnięcia progu zagęszczenia pasożytów lub wystąpienia objawów. Inne parametry opisujące wyniki uzyskano z wyników qPCR w następujący sposób: (i) czas do osiągnięcia określonych progów gęstości pasożytów, gdzie ochotnicy, którzy nie osiągnęli tych progów, zostali opisani jako brakujące dane; (ii) „odsetek dni wzrostu”, gdzie każdy kolejny wzrost zagęszczenia pasożytów jest uważany za „dzień wzrostu” (obliczono to z surowych danych, a następnie także z wygładzonych danych, przyjmując średnią ruchomą z 2 dni); (iii) średnie zagęszczenie pasożytów jako średnia geometryczna, z wyłączeniem punktów czasowych po leczeniu; (iv) maksymalna liczba dni ciągłego, następującego po sobie wzrostu; (v) gradient wzrostu od najlepszej liniowej stopy okresu określonego w (iv); (vi) mediana liczby dni od prowokacji dla dni wzrostu pasożyta, jak zdefiniowano w (ii); (vii) odwrotność (ii), (iv) i (v); (viii) w dniach spadku zagęszczenia pasożytów, a nie wzrostu; (ix) „inokulum” zdefiniowane jako szczytowe zagęszczenie pasożyta obserwowane między 8,5 a 10 dniem po prowokacji oraz; (x) „zmienność” obliczona jako zsumowana dobowa zmienność zagęszczenia pasożytów. Testy Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami zastosowano do porównania przeciwciał przeciw schizontom według lokalizacji i wyniku qPCR, a korelację rang Spearmana wykorzystano do zbadania korelacji między przeciwciałem przeciw schizontowi, lokalizacją i parametrami qPCR.

Modele przeżycia opracowano z wykorzystaniem regresji Coxa w trzech etapach; (a) jednozmienna analiza wszystkich potencjalnych niezależnych predyktorów; oraz (b) analiza wielu zmiennych, w tym istotne predyktory z (a); druga analiza wielu zmiennych zachowująca tylko istotne predyktory z (b). Zmienność wyników wyjaśniona przeciwciałami przeciw schizontowi została obliczona przy użyciu pseudo r 2. Aby porównać kohortę CHMI z wcześniejszym obserwacyjnym badaniem terenowym dzieci [9, 11, 23], poziomy przeciwciał podzielono na dwie grupy (powyżej i poniżej mediana), a analizę kohorty dziecięcej ograniczono do grupy zakażonych bezobjawowo, gdzie ochronne działanie przeciwciał antyschizontowych było najbardziej widoczne [8, 11, 23].

Wyniki

Odpowiedzi przeciwciał anty-schizontowych u ochotników włączonych do badania

Dane od 142 ochotników zostały włączone do analizy, jak opisano wcześniej [15]. Mediana wieku ochotników wynosiła 28 lat (zakres 18–45), a 30 procent stanowiły kobiety. Odpowiedzi przeciwciał na ekstrakt schizontu mierzono u wszystkich ochotników podczas badań przesiewowych (dodatkowy plik 1: ryc. S1). Ochotnicy z Kilif North mieli znacznie niższe przeciwciała przeciwko schizontowi (mediana 896 jednostek przeciwciał (AU), 95 procent CI 566 do 1473) w porównaniu z ochotnikami z Kilif South (mediana 9238 AU, 95 procent CI 6399 do 12 324, p<0.00001) and Ahero (median of 4666 AU, 95% CI 966 to 28,702, p<0.00054) but volunteers from Kilif South and Ahero had similar antibody levels (p=0.085). For further analysis, volunteers from Kilif North (N=34) were considered to be residents of an area of "low transmission" whilst volunteers from Kilif South (N=93) were combined with Ahero volunteers (N=15) and considered to be residents of an area of "high transmission".

qPCR skategoryzował wyniki dotyczące lokalizacji i odpowiedzi przeciwciał

Wcześniej zaobserwowaliśmy cztery różne wyniki oparte na wzroście pasożyta mierzonym metodą qPCR po CHMI [15], czyli wzrost pasożyta metodą qPCR spełniający kryteria progowe dla rozpoznania malarii (większy lub równy 500 pasożytów/ml) albo: (a) z gorączką (tj. „leczony gorączka”); b) bez gorączki, ale osiągające zagęszczenie pasożyta wymagające leczenia (tj. „leczone bez gorączki”); c) z pasożytami wykrytymi metodą qPCR, ale nieo zagęszczeniu pasożytów spełniającym kryteria progowe leczenia (tj. „PCR pozytywny nieleczony”); lub (d) pasożyty niezidentyfikowane przez qPCR podczas monitorowania (tj. „PCR negatywny”) (Dodatkowy plik 2: ryc. S2). Ochotnicy, którzy byli „leczeni z gorączką”, mieli najniższe przeciwciała anty-schizontowe i najmniej prawdopodobne było, że byli mieszkańcami obszarów o wysokiej transmisji (tabela 1, plik dodatkowy 3: ryc. S3). Grupa „leczona bez gorączki” miała średni poziom przeciwciał anty-schizontowych i średnie prawdopodobieństwo bycia mieszkańcami obszaru o wysokiej transmisji. Grupa „nieleczona PCR dodatnia”, a następnie grupa „ujemna PCR” miały wysoki poziom przeciwciał anty-schizontowych i obie były bardzo prawdopodobne, że były mieszkańcami obszarów o wysokiej transmisji. Osoby, które nie były leczone qPCR-dodatnie, można dalej badać w podgrupach, dzieląc ich na tych, którzy byli pozytywni we wczesnym, późnym lub podczas monitorowania qPCR. Nie zidentyfikowaliśmy żadnych znaczących różnic w przeciwciałach anty-schizontowych ani lokalizacji zamieszkania dla tych dodatkowych podgrup (Dodatkowy plik 5: Tabela S1).

Powiązania parametrów qPCR z lokalizacją i odpowiedzią przeciwciał

Zbadaliśmy różne parametry opisujące wyniki qPCR na indywidualnego ochotnika (tabela 2). Najsilniejsze nieparametryczne korelaty miejsca przebywania (tj. przebywania przy wysokim i niskim natężeniu transmisji) lub przeciwciała anty-schizontowe dotyczyły czasu do osiągnięcia progu 250 pasożytów/ml; czas na leczenie; oraz kategoryzacja leczenia i braku leczenia (Tabela 2). Inne parametry, które były silnymi korelatami lokalizacji zamieszkania lub przeciwciał anty-schizontowych, były ze sobą silnie skorelowane krzyżowo (dodatkowy plik 4: ryc. S4) i nie zidentyfikowaliśmy drugiego niezależnego predyktora za pomocą analiz parametrycznych po dostosowaniu do czasu leczenie (Dodatkowy plik 5: Tabela S2). Parametr czasu do leczenia wykorzystano do dalszej analizy w czasie do progu 250 pasożytów/ml, ponieważ niektórzy ochotnicy byli leczeni przy niższych gęstościach pasożytów, co prowadziło do braku danych dla czasu do 250 pasożytów/ml.

Analiza przeżycia

Opracowaliśmy wielowymiarowy model regresji Coxa dotyczący czasu do leczenia, finansując zarówno przeciwciała anty-schizontowe, jak i lokalizację zamieszkania, aby były silnymi niezależnymi predyktorami wyniku (Tabela 3). Obecność pasożytów podczas badań przesiewowych i stężenia lumefantryny w osoczu były słabymi predyktorami wyniku w analizie jednoczynnikowej (Tabela 3), ale nie w analizie wielu zmiennych (Wieloczynnikowa 1, Tabela 3). Pasożyty w badaniach przesiewowych i stężenia leku lumefantryny były zakłócone przez miejsce zamieszkania (r=0.20, p=0.016 i r=0.30, p=0.0003 odpowiednio dla skojarzeń z miejscem zamieszkania). Rok włączenia do badania (rok kohorty), stężenie leku przeciwmalarycznego, wiek i płeć nie były istotnymi predyktorami wyniku. W ostatecznym modelu (wieloczynnikowy 2) dwoma niezależnymi czynnikami predykcyjnymi były miejsce zamieszkania (tj. wysoka vs. niska transmisja) i stężenie przeciwciał przeciw schizontowi, wyjaśniające 35 procent zmienności wyniku regresji logistycznej (tabela 3 i ryc. 1).

Porównaliśmy siłę predykcyjną przeciwciał anty-schizontowych w modelu CHMI z wcześniejszymi badaniami kohortowymi opartymi na naturalnej ekspozycji w terenie [9, 11, 23], aby określić, czy model CHMI posunąłby naprzód w dziedzinie badania korelatów infekcji. Aby dokonać porównań między modelami, użyliśmy dychotomizowanych poziomów przeciwciał przeciw schizontowi powyżej i poniżej mediany dla każdego badania, aby uzyskać dwupoziomowe porównanie w każdym ustawieniu, które nie było zależne od różnych zakresów poziomów przeciwciał. Porównaliśmy pseudo R2 w regresji logistycznej, aby określić zmienność wyników wyjaśnioną przez poziomy przeciwciał w każdym ustawieniu. W badaniu CHMI iloraz szans (OR) konieczności leczenia w oparciu o poziomy przeciwciał przeciwko schizontom powyżej mediany wynosił OR=0,12 (95% CI 0.06 do {{ 26}}.27, p=2×10−7 ) i wyjaśnił 17 procent zmienności. W wcześniej zgłoszonej kohorcie 121 dzieci w wieku od 1 do 8 lat, u których stwierdzono obecność pasożyta na początku badania, przy czym kryterium włączenia do analizy było miejsce zamieszkania na badanym obszarze, posiadanie przeciwciał anty-schizont powyżej średniego poziomu było związane z OR { {23}}, 0,64 (95% CI 0,29 do 1,4, p{30}},26) dla malarii gorączkowej, co wyjaśnia 0,8% zmienności wyniku. Wykresy przeżycia z badania CHMI wykazały wyraźne rozróżnienie w czasie do leczenia przez odpowiedzi przeciwciał przeciwko schizontowi (ryc. 2, lewy panel), w przeciwieństwie do mniej wyraźnego rozróżnienia obserwowanego w badaniach terenowych opartych na naturalnej ekspozycji (ryc. 2, prawy panel) płyta).

Dyskusja

Użyliśmy seryjnego qPCR, aby określić wyniki najsilniej związane z przeciwciałami przeciw schizontom i lokalizacją zamieszkania (niska vs. wysoka transmisja), aby określić wyniki dla CHMI u narażonych dorosłych najsilniej związanych z surogatami odporności. Użyliśmy poziomów przeciwciał anty-schizontowych i lokalizacji zamieszkania przy różnych wcześniejszych ekspozycjach na malarię jako surogatów odporności na malarię. Zbadaliśmy kilka potencjalnych parametrów w oparciu o monitorowanie qPCR wykonane dla CHMI pod kątem ich związku z przeciwciałami antyschizontowymi i lokalizacją. Czas do leczenia i czas do 250 pasożytów/µl były silnie związane z przeciwciałami anty-schizontowymi i lokalizacją. Woleliśmy czas do leczenia niż czas do 250 pasożytów/µl, ponieważ ten pierwszy obejmował pełny zestaw danych ochotników i pozwala uniknąć potencjalnego błędu wynikającego z brakujących danych od ochotników, którzy byli leczeni przed osiągnięciem 250 pasożytów/µl.

Po uwzględnieniu czasu do leczenia nie było innych niezależnych predyktorów przeciwciał anty-schizontowych ani miejsca zamieszkania. Dlatego opracowaliśmy analizę przeżycia opartą na czasie do leczenia. Połączenie miejsca zamieszkania i przeciwciał anty-schizontowych jako zmiennej ciągłej wyjaśniało 35 procent zmienności w czasie do leczenia w CHMI. Ponieważ wcześniejsze przebywanie i przeciwciała przeciw schizontowi dostarczają jedynie ograniczonych informacji na temat prawdziwego stopnia odporności gospodarza, oznacza to, że bardzo znacząca część zmienności wyników w CHMI wynika z odporności gospodarza.

Zbadaliśmy, czy analiza CHMI pod kątem naturalnie nabytej odporności była znaczącym postępem w stosunku do wcześniejszych badań przeprowadzonych w terenie w oparciu o naturalną ekspozycję na malarię. Dorośli mają wyższy poziom odporności niż dzieci, a dla dorosłych uczestniczących w CHMI stosuje się inne punkty końcowe w porównaniu z dziećmi w terenowych badaniach obserwacyjnych, ale oba te projekty badań mają wspólny cel, jakim jest zdefiniowanie potencjalnych korelatów odporności. Aby dokonać porównań, wykorzystaliśmy regresję logistyczną z malarią gorączkową jako wynikiem w badaniach terenowych oraz kryteriami leczenia jako wynikiem w CHMI. Użyliśmy przeciwciał anty-schizontowych jako zmiennej predykcyjnej. Poziomy przeciwciał anty-schizontowych były wyższe u dorosłych niż u dzieci, więc podzieliliśmy przeciwciała na wysokie lub niskie kategorie na podstawie średniego poziomu przeciwciał w każdym badaniu. W terenowym badaniu obserwacyjnym analizowanym tutaj w kohorcie dzieci, odpowiedzi przeciwciał przeciw schizontom wyjaśniały mniej niż procent obserwowanej zmienności, ale przeciwciała przeciw schizontom wyjaśniały 17 procent zmienności wyników CHMI. Nie jest to zaskakujące, biorąc pod uwagę zmienność ekspozycji na malarię obserwowaną w terenie [8, 9], podczas gdy w CHMI ekspozycja jest kontrolowana i nie różni się między uczestnikami.

Ta analiza tutaj pokazuje, w jaki sposób dostosowanie i uwzględnienie heterogeniczności ekspozycji i infekcji oraz biorąc pod uwagę, że przeciwciała przeciwko schizontowi w badaniach terenowych odpowiadają za niewielki ułamek zmienności, CHMI w dorosłej populacji wcześniej narażonej ma większy moc dyskryminacyjna do badania odporności na przeszłe narażenie. Co więcej, w nieimmunologicznych badaniach CHMI u dużej części ochotników rozwija się choroba i wymaga się leczenia przy stosunkowo niskich progach parazytemii (od 5 do 50 pasożytów/ml), podczas gdy w naszym badaniu osoby były często bezobjawowe i wolne od pasożytów, co może w dużej mierze wynikać z różnic w odpowiedziach u osób nieodpornych i półodpornych [27, 28]. Z wyjątkiem czynników wrodzonych, takich jak cecha sierpowatokrwinkowa [17], ta oporność u osób wcześniej narażonych na malarię może być zatem wynikiem nabytej odporności adaptacyjnej, co jest potwierdzone odpowiedziami przeciwciał przeciw schizontom.

Tak więc przedstawione tutaj odkrycia stanowią wyjątkową okazję do poczynienia postępów w dziedzinie odkrywania antygenów szczepionek z wykorzystaniem platformy CHMI z charakterystyką i lepszym zrozumieniem rozwoju odporności na infekcje w kontekście wcześniejszej ekspozycji na malarię. Kompleksowa analiza sygnatur lub korelatów odporności, jak ostatnio szczegółowo opisano, z wykorzystaniem metod serologii systemowej (zarówno metod jakościowych, jak i ilościowych opartych na przeciwciałach) [29] znacznie przyspieszy tę dziedzinę.

Ta analiza, nie polegająca na jednym lub dwóch parametrach miary wyniku (PCR), zwłaszcza w kontekście podjęcia tych badań w populacjach o różnym narażeniu na malarię w przeszłości, jest uzasadniona. Tradycyjnie badania opierały się na kinetyce/szybkości wzrostu pasożyta jako ważnej miary wyniku w badaniach CHMI – w tym jako ocena skuteczności szczepionki lub leku [30]. Badania CHMI obejmujące ochotników z różnymi ekspozycjami na pasożyty, przeprowadzone dotychczas w Afryce, przyjęły podejście polegające na pomiarze punktu końcowego, w dużej mierze oparte na mikroskopii grubokrwistej przy określonym progu diagnozy [17, 22, 31], aby wyjaśnić tempo wzrostu pasożytów. Achan i in. [16] pomimo zastosowania PCR jako kryterium punktu końcowego, nie mieli takiego samego zakresu wcześniejszych ekspozycji, jak przedstawiono tutaj. Dlatego ważne jest, aby w badaniach wykorzystujących szczególnie PCR przeprowadzić szczegółową analizę najbardziej wiarygodnego parametru, który odpowiadałby za różnorodność wzrostu pasożyta.

Wnioski

W związku z tym dochodzimy do wniosku, że badania CHMI na obszarach endemicznych malarii, przy użyciu znormalizowanego inokulum, są skuteczną platformą i potężnym narzędziem do badania odporności gospodarza. Zmienność wyników jest bardziej związana z odpornością gospodarza niż z badaniami terenowymi opartymi na naturalnym narażeniu. Ogólnie uważa się, że przeciwciała przeciwko schizontowi nie są mechanistycznie związane z odpornością, ale raczej jako marker wcześniejszej ekspozycji. Przeciwciała anty-schizontowe prawdopodobnie będą zatem skorelowane krzyżowo z wieloma innymi potencjalnymi mechanizmami odporności [22, 23, 32, 33]. Dlatego w dalszych badaniach odporności gospodarza oczekiwalibyśmy odpowiedzi specyficznych dla antygenu i przeciwciał funkcjonalnych, aby wyjaśnić pozostałą zmienność wyniku. Jest możliwe, że kilka mechanistycznych markerów będzie niezależnie powiązanych z wynikiem i że po dostosowaniu powiązania z innymi markerami narażenia zostaną osłabione lub ten wynik zostanie wyjaśniony przez szereg parametrów niezależnie. W obu przypadkach oczekuje się, że kontrolowane eksperymentalnie warunki pozostawią mniej niewyjaśnionych zmian niż te występujące w terenie ze względu na zmienną ekspozycję na ukąszenia komarów. W dalszych analizach konieczne będzie przeprowadzenie testów parametrów immunologicznych, w tym między innymi na przykład testów funkcjonalnych odporności we krwi [34, 35] i analiz mikromacierzy białkowych w celu identyfikacji antygenów w fazie krwi [36] w odniesieniu do PCR opisane tutaj parametry. Pomoże to w dalszej identyfikacji sygnatur lub korelatów odporności. Wcześniejsze badania immunoepidemiologiczne z wykorzystaniem kohort obserwacyjnych zidentyfikowały kilka markerów immunologicznych znacznie silniej związanych z odpornością niż przeciwciała przeciw schizontowi [11], a wyniki te można teraz przetestować przy użyciu podejścia CHMI na obszarach endemicznych malarii.

Skróty

AU: jednostka przeciwciała; CHMI: Kontrolowana ludzka infekcja malarią; CHMI-SIKA: Kontrolowana ludzka infekcja malarią u półodpornych dorosłych Kenijczyków; DVI: bezpośrednia inokulacja żylna; ELISA: test immunoenzymatyczny; qPCR: Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy; Prowokacja PfSPZ: Aseptyczne, oczyszczone, kriokonserwowane sporozoity P. falciparum.

Wkład autorów

MCK zaprojektował badanie i napisał pierwszą wersję manuskryptu. MCK i EO przeanalizowały dane. Firma DK przeprowadziła testy molekularne w celu wykrycia i oceny ilościowej pasożytów. MCK, RK i JT wykonali testy do wykrywania przeciwciał anty-schizontowych. PN i MH przyczyniły się do zebrania danych. BKLS przyczynił się do przygotowania i produkcji sporozoitów. MCK wymyślił badanie i kierował zespołem badawczym. Wszyscy autorzy przyczynili się do interpretacji analiz i korekty wstępnej wersji manuskryptu. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Finansowanie

Ta praca była wspierana przez grant Wellcome Trust (Grant Number 107499). Fundator nie odegrał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie i interpretacji ani w pisaniu manuskryptu.

Dostępność danych i materiałów

Dane zostaną udostępnione, w tym słowniki danych, po usunięciu danych identyfikacyjnych wolontariuszy. Dane będą dostępne dla badaczy, którzy prześlą wniosek na adres dgc@kemri-wellcome.org w celu uzyskania dostępu do danych po podpisaniu umowy o dostęp do danych. Protokół badania, formularze świadomej zgody i wszystkie inne powiązane dokumenty zostały wcześniej opublikowane.

Deklaracje

Zgoda etyczna i zgoda na udział

Badanie zostało przeprowadzone w ramach programu badawczego KEMRI Wellcome Trust Research Program w Kilif w Kenii i uzyskało etyczną zgodę KEMRI Scientific and Ethics Review Unit (KEMRI//SERU/CGMR-C/029/3190) oraz Komisji ds. Etyki Badań Tropikalnych Uniwersytetu Oksfordzkiego (OxTREC 2-16). Badanie zostało zarejestrowane na stronie ClinicalTrials.gov (NCT02739763), przeprowadzone w oparciu o zasady dobrej praktyki klinicznej (GCP) i zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Zgoda na udział w badaniu przez wszystkich ochotników uczestniczących w badaniu została wyrażona w formie pisemnej.

Zgoda na publikację

Nie dotyczy.

Konkurujące interesy

BKLS jest pełnoetatowym pracownikiem Sanaria Inc., producenta Sanaria PfSPZ Challenge. W związku z tym wszyscy autorzy związani z Sanaria Inc. mają potencjalne konflikty interesów. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Szczegóły autora

1 Centrum Badań nad Medycyną Geograficzną (Wybrzeże), Kenia Medical Research Institute-Wellcome Trust Research Program, PO Box 230, Kilif 80108, Kenia. 2 Centre for Tropical Medicine and Global Health, Nuffield Department of Medicine, University Oxford, Oxford OX3 7LG, Wielka Brytania. 3 Sanaria Inc., Rockville, MD 20850, USA.

Bibliografia

1. Kamau A, Mogeni P, Okiro EA, Snow RW, Bejon P. Systematyczny przegląd zmieniającego się obciążenia chorobą malarii w Afryce Subsaharyjskiej od 2000: porównanie przewidywań modelowych i obserwacji empirycznych. BMC Med. 2020;18:1–11.

2. Agnandji ST, Lell B, Soulanoudjingar SS, Fernandes JF, Abossolo BP, Conzelmann C i in. Pierwsze wyniki badania fazy 3 szczepionki przeciw malarii RTS, S/AS01 u afrykańskich dzieci. N angielski J Med. 2011;365:1863–75.

3. Datoo MS, Natama MH, Somé A, Traoré O, Rouamba T, Bellamy D i in. Skuteczność kandydata na szczepionkę przeciw malarii w niskiej dawce, R21 w adiuwancie MatrixM, z sezonowym podawaniem dzieciom w Burkina Faso: randomizowana, kontrolowana próba. Lancet. 2021;397:1809–18. https://doi.org/10.1016/S0140- 6736(21)00943-0.

4. Dufy PE, Patrick Gorres J. Szczepionki przeciw malarii od 2000: postęp, priorytety, produkty. npj Szczepionki. 2020;5:1–9.

5. Ogutu BR, Apollo OJ, McKinney D, Okoth W, Siangla J, Dubovsky F i in. Szczepionka przeciw malarii we krwi, wywołująca wysokie stężenia przeciwciał specyficznych dla antygenu, nie zapewnia żadnej ochrony małym dzieciom w zachodniej Kenii. PLoS JEDEN. 2009;4:e4708. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004708.

6. Thera MA, Doumbo OK, Coulibaly D, Laurens MB, Ouattara A, Kone AK i in. Próba terenowa mająca na celu ocenę szczepionki przeciw malarii we krwi. N angielski J Med. 2011;365:1004–13. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1008115.

7. Fowkes FJI, Richards JS, Simpson JA, Beeson JG. Związek między przeciwciałami przeciwko merozoitowi a częstością występowania malarii Plasmodium falciparum: przegląd systematyczny i metaanaliza. PLoS Med. 2010;7:e1000218. https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1000218.

8. Ndungu FM, Marsh K, Fegan G, Wambua J, Nyangweso G, Ogada E i in. Identyfikacja dzieci z nadmiernymi epizodami malarii po uwzględnieniu różnic w narażeniu: identyfikacja na podstawie badania podłużnego przy użyciu modeli statystycznych. BMC Med. 2015;13:1–8.

9. Bejon P, Warimwe G, Mackintosh CL, Mackinnon MJ, Kinyanjui SM, Musyoki JN i in. Analiza odporności na malarię gorączkową u dzieci, która odróżnia odporność od braku ekspozycji. Zainfekuj odporność. 2009;77:1917–23. https://doi.org/10.1128/IAI.01358-08.

10. Beeson JG, Osier FH, Engwerda CR. Najnowsze spostrzeżenia dotyczące humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej przeciwko malarii. Trendy Parazytol. 2008;24:578–548. https://doi.org/10.1016/j.pt.2008.08.008.

11. Osier FH, Mackinnon MJ, Crosnier C, Fegan G, Kamuyu G, Wanaguru M, et al. Malaria: nowe antygeny do wieloskładnikowej szczepionki przeciw malarii we krwi. Sci Transl Med. 2014;6:247ra102. https://doi.org/10.1126/scitr anslmed.3008705.

12. Drakeley CJ, Corran PH, Coleman PG, Tongren JE, McDonald SLR, Carneiro I i in. Szacowanie średnio- i długoterminowych trendów przenoszenia malarii za pomocą serologicznych markerów narażenia na malarię. Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102:5108–13. https://doi.org/10.1073/pnas.0408725102.

13. Manske M, Miotto O, Campino S, Auburn S, Almagro-Garcia J, Maslen G, et al. Analiza różnorodności Plasmodium falciparum w naturalnych infekcjach metodą głębokiego sekwencjonowania. Natura. 2012;487:375–9. https://doi.org/10.1038/natur e11174.

14. Kamau A, Mtanje G, Mataza C, Mwambingu G, Mturi N, Mohammed S, et al. Zakażenie, choroba i śmiertelność malarii wśród dzieci i dorosłych na wybrzeżu Kenii. Malar J. 2020;19:210. https://doi.org/10.1186/s12936-020-03286-6.

15. Kapulu MC, Njuguna P, Hamaluba M, Kimani D, Ngoi JM, Musembi J, et al. Monitorowanie bezpieczeństwa i PCR u 161 półodpornych dorosłych Kenijczyków po kontrolowanym zakażeniu ludzką malarią. Wgląd JCI. 2021. https://doi.org/10. 1172/jci.insight.146443.

16. Achan J, Reuling I, Yap XZ, ​​Dabira E, Ahmad A, Cox M i in. Markery serologiczne wcześniejszej ekspozycji na malarię i funkcjonalne przeciwciała hamujące wzrost pasożyta są związane z kinetyką pasożyta po zakażeniu człowieka kontrolowanym przez Plasmodium falciparum. Clin Infect Dis. 2019. https://doi.org/10.1093/cid/ciz740.

17. Lell B, Mordmuller B, Dejon Agobe JC, Honkpehedji J, Zinsou J, Mengue JB, et al. Wpływ cechy anemii sierpowatej i naturalnie nabytej odporności na niepowikłaną malarię po kontrolowanym ludzkim zakażeniu malarią u dorosłych w Gabonie. Am J Trop Med Hyg. 2017. https://doi.org/10.4269/ajtmh. 17-0343.

18. Kapulu MCMC, Njuguna P, Hamaluba MMM, Abdi AIAI, Abebe Y, Audi A i in. Kontrolowane zakażenie ludzką malarią u półodpornych dorosłych Kenijczyków (Chmi-sika): protokół badania w celu zbadania wzrostu pasożyta malarii Plasmodium falciparum in vivo w kontekście istniejącej wcześniej odporności [wersja 2; recenzowanie: 2 zatwierdzone]. Witamy Open Res. 2019;3:155.

19. Gómez-Pérez GP, Legarda A, Muñoz J, Sim BKL, Ballester MR, Dobaño C, et al. Kontrolowane zakażenie malarią u ludzi przez domięśniową i bezpośrednią żylną inokulację kriokonserwowanych sporozoitów Plasmodium falciparum u ochotników nieleczonych wcześniej malarią: wpływ objętości iniekcji i dawki na wskaźniki zakaźności. Malar J. 2015;14:306. https://doi.org/10.1186/s12936-015-0817-x.

20. Mordmuller B, Supan C, Sim KL, Gomez-Perez GP, Ospina Salazar CL, Held J i in. Bezpośrednia żylna inokulacja sporozoitów Plasmodium falciparum w celu kontrolowanego zakażenia malarią u ludzi: próba ustalenia dawki w dwóch ośrodkach. Malar J. 2015;14:117. https://doi.org/10.1186/s12936-015-0628-0.

For more information:1950477648nn@gmail.com