Potencjał kosmeceutyczny ekstraktów pochodzących z pozostałości przemysłu rybnego: odpady sardynek i ramki dorsza cz. 1

Abstrakcyjny: Rybołówstwo generuje duże ilości odpadów (20–75 procent (w/w) całkowitej masy złowionych ryb). Odzyskiwanie związków bioaktywnych z pozostałości i włączanie ich do kosmetyków stanowi obiecującą szansę rynkową i może przyczynić się do trwałej waloryzacji sektora. W pracy scharakteryzowano ekstrakty bogate w białko otrzymane technologiami wysokociśnieniowymi (woda w stanie nadkrytycznym CO2 i woda podkrytyczna) z odpadów sardynek (Sardina pilchardus) i ramek dorsza (Gadus morhua) pod kątem ich potencjału kosmeceutycznego. Działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwbakteryjne oceniano za pomocą testów chemicznych (test ORAC), enzymatycznych (hamowanie elastazy i tyrozynazy), wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus i Cutibacterium acnes) oraz komórkowych (w keratynocytach-HaCaT) . Ekstrakty z sardynek wykazywały najwyższą aktywność przeciwbakteryjną, a skrawki otrzymane przy wyższej temperaturze ekstrakcji (250 ◦C) i bez etapu odtłuszczania wykazały najniższe wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) (1,17; 4,6; {{24} } 0,59 mg/ml odpowiednio dla K. pneumoniae, S. aureus i C. Acnes). Próbki dorsza ekstrahowane w niższych temperaturach (90°C) okazały się najskuteczniejszymi środkami przeciwzapalnymi (stężenie 0,75 mg/ml obniżało poziom IL-8 i IL-6 odpowiednio o 58 procent i 47 procent w stosunku do kontroli pozytywnej). Podkreślono, że treonina, walina, leucyna, arginina i całkowita zawartość białka w ekstraktach silnie korelują ze zgłoszonymi bioaktywnościami (R2 większy lub równy 0,7). Wyniki te przemawiają za potencjalnym zastosowaniem ekstraktów z odpadów przemysłu rybnego w produktach kosmeceutycznych o działaniu bioaktywnym.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniami DNA spowodowanymi przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silne zdolności wymiatania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA oraz mają pewien wpływ ochronny na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i ma zdolność wychwytywania reaktywnych form tlenu i zapobiegania degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ naprawczy na uszkodzenia anionowe wolnych rodników tyminy.

Kliknij Suplement Cistanche Tubulosa

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Słowa kluczowe: waloryzacja strumieni odpadów rybnych; aktywność antyoksydacyjna; działanie przeciwzapalne; Aktywność przeciwbakteryjna; przeciw starzeniu się; przeciw hiperpigmentacji; kosmeceutyki

1. Wstęp

Wraz z ciągłym poszukiwaniem innowacji, zwłaszcza w zakresie składników aktywnych, przemysł kosmetyczny rozwija się i wykazuje zamiar zastąpienia składników ropopochodnych w kierunku związków naturalnych [1]. Właściwości przeciwutleniające naturalnych składników aktywnych mogą pomóc w zapobieganiu wielu problemom skórnym spowodowanym stresem oksydacyjnym i starzeniem [2,3]. Starzenie się skóry może być wywołane zarówno przez czynniki wewnętrzne (takie jak stan zapalny czy skracanie telomerów), jak i zewnętrzne (środowiskowe) [4]. Starzenie się skóry prowadzi do utraty dojrzałego kolagenu i zmian w macierzy pozakomórkowej (ECM), co upośledza funkcję bariery, co skutkuje suchym wyglądem i podatnością na czynniki zewnętrzne, zwiększając ryzyko chorób skóry [5]. Proces ten może być przyspieszony przez kilka enzymów, takich jak elastazy, metaloproteinazy macierzy (MMP) i hialuronidazy, które mogą indukować degradację ECM [6], a nawet przez gromadzenie się cesywnych reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą upośledzać normalne funkcjonowanie komórki [7]. Czynniki środowiskowe, takie jak ekspozycja na promieniowanie UV, prowadzą do generowania dużych ilości ROS, które indukują te same odpowiedzi molekularne i komórkowe, co starzenie wewnętrzne, ale ze wzmocnionymi efektami. Co ważne, ROS mogą nasilać aktywność enzymów związanych ze starzeniem się skóry czy procesami pigmentacji skóry [8,9], stąd obecność antyoksydantów n odgrywa ważną rolę w kosmetyce.

W 2018 roku światowa konsumpcja ryb została oszacowana przez FAO na 20,5 kg na pita [10], co prowadzi do powstawania dużych ilości produktów ubocznych, głównie skóry i kości. Wytworzone pozostałości odpowiadają 20–75 procentom (w/w) całkowitej masy złowionych ryb, co może prowadzić do problemów środowiskowych [11,12]. Jednak pozostałości te nadal zawierają znaczną ilość lipidów, białek i składników mineralnych i powinny być odpowiednio waloryzowane. W ostatnich latach ekstrakty z odpadów wytwarzanych przez przemysł rybny wykazały aktywne właściwości, takie jak: przeciwnadciśnieniowe, przeciwutleniające, przeciwdrobnoustrojowe, neuroprotekcyjne, przeciwhiperglikemiczne, przeciwstarzeniowe i przeciwzapalne [13–19]. Dorsz atlantycki (Gadus rhea) i sardynka (Sardina pilchardus) należą do najczęściej spożywanych ryb w Portugalii, a trakty otrzymane z jego pozostałości wykazały obiecujący potencjał nutraceutyczny, taki jak działanie przeciwutleniające, antyproliferacyjne lub przeciwzapalne [11,20–22]. Jednakże, ponieważ eksploatacja i waloryzacja odpadów przemysłu rybnego są wciąż na wczesnym etapie, istnieje wiele miejsca na zbadanie możliwości przekształcenia tych odpadów w bioprodukty rynkowe o wysokiej wartości, w tym składniki kosmetyczne.

W poprzedniej pracy badaliśmy wykorzystanie technologii wysokociśnieniowych (nadkrytyczny CO2 i woda podkrytyczna) do izolowania bioaktywnych frakcji z odpadów sardynek i ramek dorsza z obiecującymi korzyściami zdrowotnymi [11,22]. W przypadku odpadów z sardynek wykazaliśmy, że stosując pierwszy etap z węglem w stanie nadkrytycznym (ScCO2) (w celu usunięcia frakcji lipidowej), a następnie proces ekstrakcji wodą w stanie podkrytycznym (SW), możliwe było uzyskanie hydrolizatów białkowych o wysokim potencjale przeciwutleniającym i działaniu antyproliferacyjnym w komórki raka jelita grubego [22]. Ekstrakcję/hydrolizę wody podkrytycznej zastosowaliśmy również do uzyskania ekstraktów wzbogaconych białkami, peptydami i aminokwasami z ramek dorsza i wykazaliśmy, że niższe temperatury obróbki (90 ◦C) sprzyjają ekstrakcji związków o potencjale przeciwzapalnym w komórce nabłonka jelita człowieka model [11]. Większość białek obecnych w ekstraktach z ramek dorsza to kolagen i jego fragmenty. Inne związki obejmują niewielkie ilości lipidów, popiołu i niektórych cukrów. Ekstrakty z sardynek były bogate w peptydy i aminokwasy, a także lipidy, popiół i cukry. Ponieważ białka i peptydy pochodzące z ryb mogą stać się ważnym surowcem dla przemysłu kosmetycznego, niniejsze badanie ma na celu dalszą ocenę aktywnego potencjału tych ekstraktów pochodzących z odpadów i produktów ubocznych przetwórstwa ryb, spowodowaną oceną ich potencjału kosmeceutycznego [23]. . W tym celu zastosowano szereg testów chemicznych, enzymatycznych i komórkowych w celu zbadania działania przeciwutleniającego, przeciwstarzeniowego, przeciw hiperpigmentacji, przeciwzapalnego i przeciwdrobnoustrojowego wyekstrahowanych próbek. Przeprowadzono również badania korelacji w celu zidentyfikowania głównych składników bioaktywnych o potencjale kosmeceutycznym.

2. Materiały i metody

2.1. Odczynniki

3,4-dihydroksy-1-fenyloalanina (L-DOPA), tyrozynaza grzybowa, świńska elastaza trzustkowa (PPE) typ III, N-sukcynylo-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN), Tris (4- {11}}amino- 2-hydroksymetylo-propan-1,3-diol), 2,20 -azobis(2-metylopropionamidyno)dichlorowodorek (AAPH) i 20 ,70 -dioctan dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) zakupiono od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dostosowany do wapnia bulion Muellera Hintona (CAMHB) zakupiono od BD (Sparks, MD, USA). Wlew mózgowo-sercowy (BHI) zakupiono od Avantor (Radnor, PA, USA). Saszetki AnaeroGen™ Compact zakupiono od firmy Oxoid (Hampshire, Wielka Brytania). PrestoBlue™, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę-streptomycynę otrzymano z Invitrogen (San Diego, CA, USA). Ludzka unieśmiertelniona nienowotworowa linia komórkowa keratynocytów HaCaT została uzyskana z Cell Line Service (Eppelheim, Niemcy). Zestawy rozwojowe ludzkiego IL-8 i IL-6 Mini TMB ELISA uzyskano z Peprotech (Londyn, Wielka Brytania). Wszystkie inne odczynniki i rozpuszczalniki użyte w niniejszym badaniu były czystości analitycznej i zostały zakupione od dostępnych dostawców.

2.2. Próbki

Ekstrakty użyte w tej pracy były ekstraktami opracowanymi w naszych poprzednich badaniach ukierunkowanych na optymalizację procesu [11,22]. W skrócie, ramy dorsza zostały dostarczone przez Pascoal i Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portugalia) i składały się z kręgosłupa rybiego i przylegających mięśni. Odpady z sardynek, wykonane z głów, kolców i wnętrzności, dostarczyła firma Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portugalia). Przybliżony skład użytych surowców przedstawialiśmy we wcześniejszych pracach [11,22]. Białko (47% mas.) i popiół (39% mas.) były głównymi składnikami ramek dorsza, z niewielkimi ilościami lipidów i węglowodanów (odpowiednio 2% mas. i 0,3% mas.). Stwierdzono, że kolagen jest głównym białkiem w ramkach dorsza iw tym przypadku stanowi ok. 65 procent całkowitej zawartości białka w pierwotnych odpadach. Natomiast sardynka jest rybą tłustą, stąd jej odpady są znacznie bogatsze w lipidy niż ramki dorsza. Odpady z sardynek wykazywały zawartość lipidów 26% wagowych i zawartość białka 52% wagowych, reszta to popiół (17% wagowych) i węglowodany (3% wagowe).

Ekstrakty z ramek dorsza (Cf1, Cf2, Cf3 i Cf4) oraz odpady sardynek (S1, S2 i S3) wybrane do tej pracy zostały uzyskane za pomocą technologii wysokociśnieniowej w aparacie na skalę laboratoryjną, jak opisano wcześniej [11, 22 ,24] stosując warunki podsumowane w tabeli 1. W skrócie, 60 g mielonych ramek dorsza lub odpadów sardynek (odtłuszczonych lub nieodtłuszczonych) załadowano do reaktora wysokociśnieniowego, który umieszczono w piecu. Włączono pompę wodną przy żądanym natężeniu przepływu (ok. 10 ml/min) i ustawiono ciśnienie na 100 barów. Gdy tylko ciśnienie osiągnęło tę wartość, włączono piekarnik elektryczny i rozpoczęto eksperyment. Różne ekstrakty zbierano przez 30 minut w różnych temperaturach (90–250 ◦C). Ekstrakty S1 i S3 otrzymano po procesie odtłuszczania odpadów sardynek ScCO2 przed ekstrakcją SW. Powtórzono eksperymenty ekstrakcji wody podkrytycznej. Dla każdej wyekstrahowanej próbki pobrano 25 ml w trzech powtórzeniach, liofilizowano i zważono, aby obliczyć odpowiednią wydajność ekstrakcji. Dane analityczne — zawartość białka — wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z trzech powtórzeń. Informacje dotyczące charakterystyki tych ekstraktów pod kątem zawartości białka, profilu aminokwasowego, głównych związków mineralnych czy metali toksycznych i ciężkich opisaliśmy w naszych wcześniejszych pracach [11,22].

Roztwory podstawowe Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 i S2 przygotowano w Milli-Q H2O w stężeniu 100 mg/ml. Pozostałe próbki, a mianowicie S1 i S3, rozpuszczono w DMSO (odpowiednio 300 i 550 mg/ml) ze względu na ich mniejszą rozpuszczalność w wodzie. Próbki zamrożono i przechowywano w temperaturze -20 ◦C do dalszego użycia. Do testów komórkowych próbki były uprzednio sterylizowane termicznie (121°C, 15 min) w autoklawie (Tuttnauer 3870 el, Breda, Holandia).

2.3. Test pojemności absorpcyjnej rodników tlenowych (ORAC).

Test ORAC przeprowadzono w celu oceny zdolności przeciwutleniającej próbek wobec rodników nadtlenowych (ROO•), zgodnie z metodą opracowaną przez Huang i in. [25], z pewnymi korektami opisanymi wcześniej [26]. Pokrótce, w czarnej 96-studzience mikropłytki, 150 µl fluoresceiny disodowej (0,3 µM) dodano do 25 µl rozcieńczeń próbek i inkubowano przez 10 min w 37°C. Następnie reakcję zainicjowano przez dodanie 25 µl dichlorowodorku 2,20 -azobis(2-amidynopropanu) (AAPH, 153 mM) i fluorescencję (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm) mierzono przez 40 minut w temperaturze 37°C w fluorescencyjnym czytniku mikropłytek FLx800 (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Krzywą wzorcową sporządzono przy użyciu 5, 10, 20, 30 i 40 µM kwasu (6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromanu-2- karboksylowego (Trolox )). Wszystkie roztwory przygotowano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 75 mM, pH 7,4. Wyniki wyrażono jako mikromole ekwiwalentu zdolności przeciwutleniającej Troloxu na gram ekstraktu (µmol TEAC/g ekstraktu).

2.4. Testy enzymatyczne

2.4.1. Test hamowania elastazy

Test ten oparto na pracy Wittenauera i in. [27] z pewnymi modyfikacjami opisanymi wcześniej [6]. Aktywność hamowania elastazy określa się metodą spektrofotometryczną przy użyciu elastazy trzustkowej świni (PPE) i N-sukcynylo-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidu (AAAPVN) jako enzymu-substratu, monitorując uwalnianie p-nitroaniliny w temperaturze 41 { {19}} nm. PPE rozpuszczono w 100 mM buforze Tris (2-amino-2-hydroksymetylo-propan-1,3-diolu)-HCl (pH=8.0) do stężenia 1 mg/ml i przechowywać w 20 ◦C w porcjach. W dniu testu pobrano porcję i rozcieńczono w buforze do stężenia 0,03 U/ml, 10 µl załadowano do studzienek płytek do mikromiareczkowania wraz ze 100 µl buforu Tris-HCl i 30 µl każdej próbki. Po 20 minutach wstępnej inkubacji w temperaturze 25°C reakcję zapoczątkowano przez dodanie 40 µl substratu AAAPVN (0,55 mM). Absorbancję mierzono przez 20 minut po dodaniu AAAPVN w czytniku mikropłytek spektrofotometru EPOCH 2 firmy BioTek Instruments. Obliczenia wykonano jak opisano w równaniu (1), gdzie kontrola A i próbka reprezentują absorbancję przy 410 nm, odpowiednio, pod nieobecność lub w obecności próbki. Ponieważ DMSO użyto do rozpuszczenia próbek S1 i S3, ten rozpuszczalnik również przetestowano i zastosowano jako kontrolę dla tych próbek. Potencjał ekstraktów do hamowania elastazy oceniano przy rosnących stężeniach, aby określić zależności zależne od dawki i ustalić wartości połowicznych maksymalnych stężeń hamujących (IC50), wskazujących na zdolność każdej próbki do hamowania aktywności enzymatycznej w zakresie 50 procent.

Wszystkie wyniki wyrażono jako średnie wartości IC50 z dolną i górną granicą 95-procentowego przedziału ufności, uzyskane z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.

2.4.2. Test hamowania tyrozynazy

Potencjał hamujący tyrozynazę ekstraktów oceniano spektrofotometrycznie stosując tyrozynazę grzybową i L-DOPA jako substrat [28]. Tyrozynaza przekształca L-DOPA w dopachinon, który kolejno cyklizuje, tworząc dopachrom. Tworzenie dopachromu można zaobserwować mierząc absorbancję przy 475 nm. Substrat dodano do enzymu w obecności rozcieńczeń próbek, do końcowego stężenia 30 U/ml tyrozynazy i 2,5 mM L-DOPA. Ponieważ DMSO użyto do rozpuszczenia próbek S1 i S3, ten rozpuszczalnik również przetestowano i zastosowano jako kontrolę dla tych próbek. Po inkubacji w 37°C przez 30 min, zmierzono absorbancję przy 475 nm na spektrofotometrze do mikropłytek BioTek Instruments EPOCH 2. Wszystkie odczynniki przygotowano w buforze fosforanu sodu (SPB; 0,1 M, pH 6,8), przygotowanym przez zmieszanie dwuwodnego dwuzasadowego fosforanu sodu i jednowodnego jednozasadowego fosforanu sodu, a obliczenia przeprowadzono jak opisano w równaniu (1). Wszystkie wyniki wyrażono jako średnie wartości IC50 z dolną i górną granicą 95-procentowego przedziału ufności, uzyskane z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.

2.5. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe

Mikroorganizmami docelowymi wybranymi do testów aktywności przeciwbakteryjnej były bakterie Gram-ujemne Klebsiella pneumoniae CECT 8453 oraz bakterie Gram-dodatnie Staphylococcus aureus ATCC 6538 i Cutibacterium acnes ATCC 6919T. W przypadku K. pneumoniae CECT 8453 i S. aureus ATCC 6538 testy przeprowadzono zgodnie z metodą mikrorozcieńczeń w bulionie zgodnie z wytycznymi CLSI M{7}}A10, jak opisano wcześniej w Rodrigues i in. [29]. W skrócie, roztwory podstawowe ekstraktów rozprowadzono w okrągłodennej 96-płytce do mikromiareczkowania i 2-krotnie rozcieńczono seryjnie w bulionie Muellera Hintona z dodatkiem wapnia (CAMHB; BD, Sparks, MD, USA) w celu uzyskania zakres stężeń roztworów. Inokulum przygotowano metodą wzrostową do uzyskania jednorodnej zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej. Dostosowane inokulum zostało dodatkowo rozcieńczone w CAMHB, aby zagwarantować, że po inokulacji każda studzienka zawierała około 5 x 104 CFU. Płytki inkubowano w warunkach tlenowych w temperaturze 37°C przez 16 do 20 godzin. W przypadku C. acnes testy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, stosując bulion mózgowo-sercowy (BHI) (Avantor, Radnor, PA, USA) zamiast CAMHB i inkubując płytki do mikromiareczkowania przez 70–74 hw 37°C C w beztlenowych słoikach zawierających system generowania atmosfery AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, Wielka Brytania).

Dla każdego analizowanego roztworu podstawowego kontrola pozytywna (CAMHB lub BHI i rozcieńczone inokulum), kontrola sterylności pożywki (nieszczepiony CAMHB lub BHI) i kontrola sterylności ekstraktu (niezaszczepiony 2-roztwór podstawowy ekstraktu w CAMHB lub BHI) zostały wykonane odpowiednio. Wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) były najniższym stężeniem próbki, które w widoczny sposób hamowało wzrost drobnoustrojów po inkubacji. W razie potrzeby wartości MIC potwierdzano przy użyciu odczynnika żywotności komórek PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA USA) zgodnie z wytycznymi producenta. Ustalono również dodatkową wartość MIC, oznaczoną jako MIC*, i zdefiniowano ją jako najniższe stężenie próbki, przy którym wizualnie i różnicowo wpłynęło to na wzrost bakterii w porównaniu z kontrolą pozytywną. Wartości minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC) podano jako najniższe stężenie w próbce prowadzące do co najmniej 99,9% zmniejszenia liczby żywych bakterii w porównaniu z początkowym inokulum i przy takim samym czasie inkubacji. Wyniki wyrażono jako medianę wartości uzyskanych po trzech powtórzeniach biologicznych. Ponieważ DMSO użyto do rozpuszczenia próbek S1 i S3, ten rozpuszczalnik został również przetestowany, aby upewnić się, że końcowe zastosowane stężenie nie koliduje z docelowym mikroorganizmem, stąd test.

2.6. Testy komórkowe

2.6.1. Hodowlę komórkową

Ludzką linię komórkową keratynocytów HaCaT (CLS, Niemcy) hodowano w standardowej pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10 procentami (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 procentem (obj./obj.) penicyliną-streptomycyną. Komórki rutynowo utrzymywano jako monowarstwy w kolbach hodowlanych o powierzchni 75 cm2 i inkubowano w temperaturze 37°C z 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.

2.6.2. Cytotoksyczność in vitro

Oznaczenia cytotoksyczności wykonano zgodnie z wcześniejszymi pracami [6]. Pokrótce, komórki HaCaT wysiano z gęstością 1,4 × 105 komórek/cm2 w 96-studzienkowych płytkach. Po 3 dniach komórki inkubowano z różnymi stężeniami każdej próbki (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2-5{24}}, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, {{3{32}}} }.78, 0.39; S1—3, 1,5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3 — 5,5, 2,75, 1,38, 0,69, 0,34, 0,17, 0,09, 0,04 mg/ml) rozcieńczono w pożywce hodowlanej (pożywka DMEM zawierająca 0,5 procent FBS). Jako kontrolę zastosowano studzienki zawierające komórki inkubowane tylko z pożywką hodowlaną uzupełnioną 0,5% (obj./obj.) FBS. Przeprowadzono również kontrolę rozpuszczalnika z 50 procentami wody lub 1 procentem DMSO w pożywce hodowlanej, aby wykluczyć toksyczność rozpuszczalnika. Po 24 h inkubacji żywotność komórek oceniano przy użyciu PrestoBlue® (5% obj./obj. w pożywce hodowlanej) przez 2 hw 37°C, 5% CO2, zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie zmierzono fluorescencję każdej studzienki (Przykł./Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm) w fluorescencyjnym czytniku mikropłytek FLx800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Żywotność komórek wyrażono jako procent żywych komórek w stosunku do kontroli. Trzy niezależne eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

2.6.3. Komórkowa aktywność przeciwutleniająca

Aktywność antyoksydacyjną komórek oceniano zgodnie z wcześniej opisanymi metodami [6,30], z pewnymi modyfikacjami. Pokrótce, komórki HaCaT wysiano z gęstością 1,4 × 105 komórek/cm2 w 96-dołkowych płytkach i monitorowano tworzenie wewnątrzkomórkowych RFT przy użyciu dioctanu 20,70 -dichlorofluoresceiny ( DCFH-DA) jako sonda fluorescencyjna. 72 godziny po wysianiu komórki przemyto PBS i inkubowano z nietoksycznymi stężeniami próbek (0,1875 mg/ml; 0,375 mg/ml; 0,75 mg/ml) plus 25 µM DCFH-DA w PBS przez 1 godzinę. Następnie komórki ponownie przemyto PBS i inkubowano z induktorem stresu (600 µM AAPH w PBS) przez 1 godzinę. Następnie zmierzono fluorescencję w czytniku fluorescencji do mikropłytek FL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm). Wyniki wyrażono jako procent ROS w stosunku do nietraktowanej kontroli (komórki traktowane DCFH-DA i AAPH). Trzy niezależne eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

2.6.4. Ocena wydzielania IL{3}} i IL-8

Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [31], z kilkoma modyfikacjami. Pokrótce, komórki HaCaT wysiano z gęstością 1 × 105 komórek/cm2 w 12-studzienkowych płytkach. Po 3 dniach komórki stymulowano 15 µg/ml lipopolisacharydów (LPS) z Escherichia coli i współinkubowano z trzema różnymi stężeniami każdego ekstraktu ({{10}},1875 mg/ml; {{ 14}},375 mg/ml; 0,75 mg/ml) rozcieńczono w pożywce hodowlanej (pożywka DMEM zawierająca 0,5 procent FBS). Komórki inkubowane tylko z LPS i komórki inkubowane tylko z pożywką hodowlaną zastosowano odpowiednio jako kontrolę pozytywną i negatywną. Po 24 godzinach zebrano supernatanty, wirowano przez 10 min przy 2000 g i przechowywano w temperaturze -80 ◦C do dalszej analizy. Poziomy IL{20}} i IL-8 oceniano za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), stosując dostępne w handlu zestawy (PeproTech; Londyn, Wielka Brytania), zgodnie z instrukcjami producenta, z absorbancją mierzoną przy 450 nm z korekcją długości fali ustawioną na 620 nm w spektrofotometrze do mikropłytek (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Wyniki wyrażono jako procent IL-6 lub IL-8 w stosunku do kontroli pozytywnej (komórki stymulowane LPS). Trzy niezależne eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

2.7. Analiza statystyczna

Wyniki ORAC i testów komórkowych wyrażono jako wartość średnią ± SD, otrzymaną z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. W przypadku testów enzymatycznych i cytotoksyczności wartości IC50 określono z krzywych dawka-odpowiedź za pomocą wykresów log10 przy użyciu GraphPad Prism 8.4.3. oprogramowanie (GraphPad Software, Inc., La Jolla, Kalifornia, USA). Wyniki przedstawiono jako IC50 z 95-procentowym przedziałem ufności. Analiza statystyczna wyników została przeprowadzona przy użyciu poprzedniego oprogramowania. Po zweryfikowaniu jednorodnej wariancji i normalnego rozkładu danych wyniki przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie przeprowadzono test Tukeya dla porównań wielokrotnych. W przypadku heterogenicznych wariancji lub jeśli dane nie miały rozkładu normalnego, przeprowadzono odpowiedni niesparowany test t-Studenta w celu określenia, czy średnie były istotnie różne. Wartość p mniejsza lub równa 0,05 została uznana za istotną statystycznie we wszystkich przypadkach. Wyniki oznaczania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe wyrażono jako medianę uzyskaną z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.

3. Wyniki i dyskusja

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>Wybrano 45,7 g/100 g). Wyniki dotyczące całkowitej zawartości białka w każdym ekstrakcie przedstawiono w tabeli 1.

3.1. Działanie przeciwutleniające, przeciwstarzeniowe i przeciw hiperpigmentacji

Potencjalny efekt kosmeceutyczny ekstraktów został początkowo zbadany za pomocą testów chemicznych i enzymatycznych w celu oceny ich działania przeciwutleniającego, przeciwstarzeniowego i przeciw przebarwieniom. W przypadku zdolności antyoksydacyjnej wybrano test ORAC, który mierzy zdolność próbek do wychwytywania biologicznie istotnych ROS, czyli rodników nadtlenowych, które są uważane za jeden z głównych induktorów starzenia się skóry [2,32]. Działanie przeciwstarzeniowe oceniano również poprzez hamowanie elastazy, ponieważ według doniesień enzym ten jest odpowiedzialny za degradację elastyny ​​i innych białek ECM [6]. W przypadku efektu przeciwdziałającego hiperpigmentacji zastosowano test tyrozynazy, aby ocenić zdolność próbek do hamowania produkcji melaniny. Tabela 2 podsumowuje wartości ORAC i IC50 wszystkich ekstraktów.

Nasze wyniki pokazują, że ekstrakty z sardynek i dorsza wykazują działanie przeciwutleniające i hamujące aktywność enzymów elastazy i tyrozynazy. Wśród próbek sardynek S1 wykazał najwyższą wartość ORAC (1,94 ± 0,08 µmol TEAC/mg ekstraktu), a następnie S3 i S2. Wyniki te pochodzą z wcześniejszej oceny przeciwutleniaczy metodą alternatywną (test 2,2-difenylo-1-pikrylhydrazylo-DPPH), w której ekstrakt S1 wykazywał najniższe wartości IC50 [22]. Wyższa zdolność wychwytywania rodników nadtlenowych próbki S1 może pochodzić od peptydów o różnych sekwencjach aminokwasowych obecnych w ekstraktach, ponieważ interakcje między nimi mogą wpływać na zdolność wychwytywania rodników [33]. Dodatkowo związki powstające w reakcji Maillarda lub innych reakcjach termoutleniania mogą wpływać na aktywność antyoksydacyjną próbek [34]. Pomimo najniższej wartości ORAC, próbki S2 i S3 miały największą zdolność hamowania odpowiednio aktywności tyrozynazy i elastazy.

Wykazano, że spośród ekstraktów z dorsza Cf4 ma najwyższą aktywność przeciwutleniającą i przeciw przebarwieniom. Analiza SEC-GPC ekstraktów wykazała, że ​​przy zwiększeniu temperatury ekstrakcji do 250 ◦C uzyskano peptydy o malejącej masie cząsteczkowej [11]. Zdolność hamowania elastazy tej próbki mieści się w zakresie wartości stwierdzonych dla innych ekstraktów Cf, a mianowicie Cf1 i Cf3. Jednak dla badanych stężeń te dwa ekstrakty nie wykazywały aktywności hamującej wobec tyrozynazy.

W literaturze niektóre doniesienia wskazują, że ekstrakty z morskich produktów ubocznych wykazują odpowiednią aktywność przeciwutleniającą i hamowanie tyrozynazy. Na przykład ekstrakty pochodzące z produktów ubocznych pochodzenia morskiego (Scophthalmus maximus) w wyniku hydrolizy alkalicznej wykazały aktywność przeciwutleniającą dostępną w różnych testach chemicznych: 1,1-difenylo-2- pikrylhydrazyl (DPPH) zdolność wychwytywania rodników ( 36,12 procent w stosunku do kontroli), metoda ABTS (2,20 -azynobis-(3-etylo-benzotiazolino-6-kwas sulfonowy) (12,81 µg BHT/mL) i test wybielania krocyny (8,{ {28}}3 µg Trolox/mL) [35].W innym badaniu enzymatyczna ekstrakcja meduz solonych ałunem (Lobonema smithii) wykazała, że ​​powstają hydrolizaty o wysokiej aktywności przeciwutleniającej (IC{{20}}). 9 mg/mL dla testów ABTS e DPPH) i potencjał hamowania tyrozynazy, z wartościami IC5{36}} w zakresie od 14,1 do 24,5 mg/mL [36], które są tego samego rzędu wielkości, co uzyskane w tej pracy Dodatkowo ekstrakty o zbliżonych wartościach przeciwutleniających (wartości ORAC – 0,4 do 3,5 µmol TEAC/mg ekstraktu) otrzymano z innego rodzaju pozostałości przemysłu spożywczego, a mianowicie strumieni odpadów winiarskich [6]. Jednak te ekstrakty pozostałości winiarskich wykazywały wyższe zdolności hamowania tyrozynazy (IC50 od 4,0 do 0,14 mg ekstraktu/ml) i elastazy (IC50 od 3,4 do 0,1 mg ekstraktu/ml) niż te uzyskane w tej pracy, prawdopodobnie ze względu na obecność związków fenolowych o których wiadomo, że mają kilka aktywności biologicznych. Należy wspomnieć, że w naszym badaniu użyliśmy tyrozynazy grzybowej do przeszukiwania działania ekstraktów przeciw hiperpigmentacji, ponieważ enzym ten był szeroko stosowany w testach o dużej przepustowości [37]. Niemniej jednak, ponieważ istnieją pewne kontrowersje dotyczące podobieństwa i homologii tego enzymu z ssaczą/ludzką tyrozynazą [38–40], należy rozważyć przyszłe badania z udziałem linii komórkowych ssaków w celu oceny potencjalnego działania ekstraktów z sardynek i dorsza przeciw hiperpigmentacji.

Aby określić, które związki mogą być odpowiedzialne za odpowiedź bioaktywną ekstraktów, przeprowadzono badania korelacji między danymi dotyczącymi bioaktywności a składem aminokwasowym ekstraktów opisanym wcześniej [11,22] (Tabela S1). Dla aktywności antyoksydacyjnej najwyższe korelacje (R2 Większe lub równe 0},7) uzyskano między wartością ORAC a treoniną całkowitą, wolną waliną oraz wolną i całkowitą leucyną dla wszystkich ekstraktów. W przypadku próbek sardynek wysoką korelację (R2 Większy lub równy 0,94) uzyskano również dla zawartości tryptofanu wolnego i całkowitego. Odpowiednio, wszystkie te aminokwasy zostały wcześniej zgłoszone jako mające właściwości przeciwutleniające w kilku systemach modelowych [41-43]. W przypadku aktywności hamowania elastazy i tyrozynazy najwyższe współczynniki korelacji (R2 większe lub równe 0,8) uzyskano odpowiednio dla całkowitej zawartości białka i wolnej argininy, co sugeruje, że związki te mogą odgrywać ważną rolę w potencjalnym działanie przeciwstarzeniowe i przeciw przebarwieniom ekstraktów z odpadów przemysłu rybnego.

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】