Przestrajalna kontrola poziomu ekspresji genów za pośrednictwem CRISPRi za pomocą zmodyfikowanego jednoprzewodnikowego RNA w Escherichia Coli

ABSTRAKCYJNY

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-pasuj). Te sgRNA umożliwiły także modułową regulację z różnymi docelowymi sekwencjami DNA. Zastosowaliśmy ten system do redystrybucji strumienia metabolicznego, aby wytworzyć pochodne wiolaceiny w przewidywalnym stosunku i zoptymalizować produkcję likopenu. System ten pomógłby przyspieszyć procesy optymalizacji strumienia w inżynierii metabolicznej i biologii syntetycznej.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

WSTĘP

System typu II Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/związany z CRISPR (Cas) to system cięcia DNA kierowany przez RNA, składający się z RNA CRISPR (crRNA), transaktywującego RNA CRISPR (tracrRNA) i białka Cas9 (1 ,2). Cas9 ze Streptococcus pyogenes jest szeroko stosowany w inżynierii genomu ze względu na swoje dobrze scharakteryzowane właściwości (3,4). Kompleks białka spCas9, tracrRNA i crRNA wiąże i rozszczepia docelowy protoprzerywnik DNA komplementarny do 20-nukleotydowej (nt) sekwencji rozdzielającej crRNA w obecności motywu sąsiadującego z protoprzerywnikiem 5'-NGG-3' (PAM ) sekwencja (5,6). Aby uprościć system, można zastosować chimeryczny pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA), w którym crRNA i tracrRNA są połączone sztucznym łącznikiem zwanym tetraloopem (5). Pozwala na zastąpienie dwóch oddzielnych RNA pojedynczą cząsteczką RNA, dzięki czemu system jest łatwiejszy w zarządzaniu. Jeden z systemów opartych na CRISPR, interferencja CRISPR (CRISPRi), wykorzystuje katalitycznie nieaktywny Cas9 (dCas9) poprzez zastąpienie pewnych aminokwasów z każdej domeny endonukleazy (7). Ta modyfikacja tworzy kompleks rybonukleoproteiny (RNP), który może kierować docelowym DNA i wiązać się z nim oraz zakłócać polimerazę RNA (RNAP), hamując inicjację lub wydłużanie transkrypcji (7). W przeciwieństwie do nokautu przez system CRISPR/Cas9, CRISPR umożliwia odwracalny nokaut genów poprzez ekspresję dCas9 lub sgRNA pod indukowalnym promotorem, co pozwala na większą elastyczność w regulacji genów (7). System CRISPRi skutecznie wyciszył geny docelowe setki razy (7,8). Swoista docelowa represja genu umożliwia wysokowydajne fenotypowanie przy użyciu puli sgRNA obejmującej cały genom (9) lub przekierowuje strumień węgla w zmodyfikowanych bakteriach w stronę docelowej substancji chemicznej (10–12). Ponadto wykazano multipleksowy CRISPRi u różnych gospodarzy przy użyciu różnych metod stabilnej ekspresji wielu sgRNA, w tym długich macierzy crRNA, integracji przełącznika toehold i niepowtarzalnych, bardzo długich macierzy sgRNA (13.16). Te techniki jednoczesnego hamowania wielu genów wykorzystano do wykonywania bardziej złożonych zadań, takich jak redukcja toksycznych półproduktów lub blokowanie konkurencyjnych szlaków w fermentacji bakteryjnej (13,16–19). Jednak całkowite stłumienie nie zawsze jest pożądane w inżynierii metabolicznej. Poziomy ekspresji genów powinny być precyzyjnie kontrolowane, aby osiągnąć optymalną aktywność enzymatyczną pomiędzy szlakami wzrostu i produkcji, równoważąc wewnątrzkomórkowe stężenia prekursorów i unikając akumulacji toksycznych półproduktów (20–22). Opracowano różne techniki inżynierii skuteczności represji CRISPRi. Manipulowano kilkoma czynnikami, takimi jak ilość sgRNA i białka dCas9 lub wybór sgRNA. Kontrolowanie ekspresji dCas9 lub ekspresji zarówno dCas9, jak i sgRNA przy użyciu indukowalnego promotora regulowało ekspresję docelowego genu odpowiednio ponad 30-krotność lub 300-krotność (23,24). Jednakże zaobserwowano, że modulowanie stężenia dCas9 może prowadzić do niespójnej skuteczności represji na różnych protoprzerywnikach (23). Ograniczona liczba dostępnych indukowalnych promotorów również stwarza wyzwania projektowe pomimo wielu wysiłków (25). Inną strategią jest wprowadzenie aptameru RNA specyficznego dla liganda do sgRNA, gdzie mała pokrewna cząsteczka może odsłonić przerywnik, umożliwiając w ten sposób zależną od dawki kontrolę CRISPRi (26). SgRNA specyficzne dla liganda jest pomocne, jeśli dostępna jest odpowiednia para ligand i aptamer. Odległość od miejsca startu transkrypcji i orientacja wiązania dCas9 również wpływają na skuteczność CRISPRi (7). Dostosowanie odległości między miejscem wiązania sgRNA a miejscem rozpoczęcia transkrypcji może zoptymalizować szlak w inżynierii metabolicznej (17,27,28). Wydajność hybrydyzacji pomiędzy sekwencjami przerywnika i protoprzerywnika zmienia także skuteczność wiązania kompleksu RNP (29.31). Dlatego wprowadzono niedopasowania zaprojektowane poza obszarem zarodkowym w celu zmiany darmowej energii w celu zróżnicowania wydajności CRISPRi (31,32). Jednak dla każdej nowej sekwencji docelowej wymagane jest zaprojektowanie sgRNA, a osiągnięcie znaczącej różnicy w energii swobodnej jedynie w wyniku niedopasowania może być wyzwaniem. Ponadto istnieje możliwość zwiększonego wiązania poza celem (33). Niemniej jednak nadal ogranicza się to do precyzyjnej supresji wielu ekspresji genów w sposób modułowy, niezależnie od sekwencji docelowej. W tym badaniu opracowaliśmy przestrajalny system CRISPRi, który reguluje ekspresję genów z dużą precyzją i przewidywalnością. Dzięki iteracyjnemu sortowaniu komórek w oparciu o fluorescencję biblioteki sgRNA ukierunkowanej na tetrapętlę i jej region flankujący, osiągnęliśmy nawet 45--krotną skuteczność represji transkrypcji, nawet w przypadku zmiany docelowego DNA. System ten pozwala na przewidywalną redystrybucję strumienia metabolicznego bez manipulowania genomem gospodarza lub szlakami syntetycznymi, zapewniając obiecujące narzędzie do optymalizacji szlaków metabolicznych.

MATERIAŁY I METODY

Szczepy bakteryjne, plazmidy i odczynniki

Szczepy i plazmidy Escherichia coli zastosowane w tym badaniu wymieniono w tabeli uzupełniającej S1. Startery zastosowane w tym badaniu wymieniono w tabeli dodatkowej S2. Procedury klonowania opisano w metodach uzupełniających. Geny docelowe i ich docelowe sekwencje DNA dla systemu CRISPR pokazano w tabeli dodatkowej S3. Do ogólnego klonowania użyto Mach1-T1R. Bibliotekę skonstruowano przy użyciu NEB 5-alfa elektrokompetentnej E. coli (NEB). Rutynowe hodowle w celu konstruowania plazmidów i szczepów prowadzono w temperaturze 37°C w bulionie Luria-Bertani (LB) lub na płytce agarowej LB zawierającej odpowiednie antybiotyki (34 g/ml chloramfenikolu, 50 g/ml spektynomycyny). PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności Q5® (NEB). Plazmidy i produkty PCR oczyszczono przy użyciu zestawu GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit i Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology). Skuteczność represji mutantów sgRNA Całonocną pożywkę hodowlaną odświeżono do OD600 wynoszącego 0,05 i inkubowano aż do osiągnięcia wartości pomiędzy 0,6 a 0,8. Następnie pożywkę hodowlaną rozcieńczono do OD600 wynoszącego 0,05 za pomocą 20 ng/ml aTc i inkubowano przez 4 godziny. Fluorescencję pojedynczej kolonii mierzono przy 575 nm/616 nm przy użyciu czytnika mikropłytek Hidex Sense (Hidex), a wartość OD600 określono przy użyciu spektrofotometru Jenway 7300 (Jenway). Względną fluorescencję obliczono jako jednostki fluorescencji na wartość OD600, przy wartości PC ustawionej na 100%.

Skutki Cistanche tubulosa – leczy zaparcia

Przeszukiwanie biblioteki sgRNA

Zastosowano tę samą metodę hodowli, co opisana powyżej. Pożywkę hodowlaną rozcieńczono do [komórki]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

Ekstrakcja RNA

Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen) tylko przy użyciu zestawu miRNeasy Mini Kit (Qiagen) do oceny ilościowej sgRNA, po potraktowaniu odczynnikiem bakteryjnym RNAprotect (Qiagen) i przechowywaniu w temperaturze –80°C. Podczas procesu ekstrakcji przeprowadzono trawienie DNA na kolumnie przy użyciu zestawu DNazy wolnej od RNazy (Qiagen). Zanieczyszczenie DNA zweryfikowano metodą PCR bez odwrotnej transkrypcji. Stężenie i czystość każdej próbki oznaczono za pomocą NanoDrop One (Thermo Scientific), a jakość oceniono za pomocą DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) na LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Analiza RT-qPCR

Startery do RT-qPCR pochodziły albo z zasobów laboratoryjnych, albo zostały zaprojektowane przy użyciu narzędzia Primer3Plus (34) i wymienione w tabeli uzupełniającej S4. Gen CysG zastosowano jako gen referencyjny (35) we wszystkich eksperymentach RT-qPCR. Krzywą standardową wygenerowano poprzez 10-krotne rozcieńczenie szablonu od 107 kopii/l do 10−1 kopii/l. Granicę oznaczalności określono dopasowując liczbę kopii i dodatni współczynnik amplifikacji do funkcji sigmoidalnej i obliczając 95% dodatniej wartości liczby kopii. Liniowy zakres dynamiki zdefiniowano jako najniższą liczbę kopii, przy której obliczona wstecznie zmiana Cq jest mniejsza niż 35%. Zwalidowano wartości Cq powyżej 30 lub te, które nie uległy amplifikacji w kontroli bez matrycy. Dane krzywej standardowej są dostępne w tabeli dodatkowej S5 i rysunku dodatkowym S1. Łącznie 2,5 ng całkowitego RNA wykorzystano w 10 l reakcji RT-qPCR z zestawem Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w systemie StepOnePlus™ RealTime PCR (Applied Biosystems) z następującymi etapami: (i) odwrotna transkrypcja w temperaturze 55°C przez 10 min, następnie denaturacja w temperaturze 95°C przez 1 min; (ii) 40 cykli termicznych w temperaturze 95°C przez 10 s i 60°C przez 1 min; (iii) analiza krzywej topnienia w temperaturze 95°C przez 15 si 60°C przez 1 minutę, a następnie następuje wzrost temperatury od 60°C do 95°C z szybkością 0,3°C/min. Względną ocenę ilościową RNA określono przy użyciu metody delta-deltaCt (36) i analizowano za pomocą oprogramowania StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

Sekwencjonowanie RNA (seq RNA) i analiza danych

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}},92 w oparciu o FPKM (fragmenty na kilobazę transkryptów na milion zmapowanych odczytów). Geny o różnej ekspresji uzyskano od progu 1,5 (w oparciu o log2-) i 0,01 (wartość q).

Produkcja i pobieranie próbek prowiolaceiny i prodeoksywiolaceiny

Do produkcji wiolaceiny i prodeoksywiolaceiny zastosowano następujący skład pożywek: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l ekstraktu drożdżowego i 1{{20}} g/l glukozy. Nocną pożywkę hodowlaną odświeżono do OD600 wynoszącego 0,1 i hodowano aż do osiągnięcia OD600 pomiędzy 0,6 a 0,8. Następnie pożywkę hodowlaną rozcieńczono do OD600 wynoszącego 0,1 i uzupełniono 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG i 0,1 g/l L-tryptofanu do końcowej objętości 5 ml. Pobrano próbkę 300 l pożywki hodowlanej i odwirowano przy 14 000 obr./min przez 5 min w celu otrzymania osadu komórek do analizy HPLC, a 300 l pożywki hodowlanej pobrano w celu ekstrakcji RNA.

Analiza HPLC

Do analizy szlaku biosyntezy wiolaceiny osad komórkowy ponownie zawieszono w {{0}}metanolu, poddano sonikacji przez 5 minut, odwirowano i przesączono przez nylonowy filtr 0.22-m. Analizę HPLC przeprowadzono zgodnie z metodą (42) z kolumną Poroshell 120 EC-C18, 4,6 x 150 mm, 4 m (Agilent). Dwie fazy ruchome, A z 0,1% kwasem mrówkowym w DDW i B z 0,1% kwasem mrówkowym w acetonitrylu, zastosowano przy natężeniu przepływu 0,6 ml/min z następującym profilem gradientu: 95% A przez 1,5 min, rampa A od 95 % do 2% przez 4 min, utrzymywanie 2% A przez 2 min, zwiększanie A od 2% do 95% przez 30 s i utrzymywanie 95% A przez 10 min. Próbki wykrywano za pomocą detektora PDA i określano obszar HPLC przy 600 nm dla wiolaceiny i 610 nm dla prodeoksywiolaceiny.

Produkcja i pobieranie próbek likopenu

Do produkcji likopenu użyto podłoża o następującym składzie: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0,1 ml 1 M CaCl2 i 4 g/l glukozy (22). Zastosowano 27 g/ml chloramfenikolu i 50 g/ml spektynomycyny. Nocną pożywkę hodowlaną odświeżono do OD600 wynoszącego 0,1 do końcowej objętości 5 ml. Gdy OD600 osiągnęło pomiędzy 0,5 a 0,6, dodano aTc do końcowego stężenia 500 ng/ml, a gdy OD600 osiągnęło pomiędzy 0,9 a 1, dodano IPTG do końcowego stężenia 0,02 mM. Likopen ekstrahowano za pomocą acetonu, jak opisano w piśmiennictwie (22). Stężenie likopenu uzyskano z absorbancji przy 475 nm, stosując spektrofotometr Jenway 7300, stosując krzywą standardową. Do ekstrakcji RNA pobrano próbkę 300 l pożywki hodowlanej.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

WYNIKI I DYSKUSJA

Wpływ mutacji w sgRNA na skuteczność represji systemu CRISPR

System CRISPRi może tłumić ekspresję genów, gdy trójskładnikowy kompleks dCas9 – sgRNA – DNA silnie się ze sobą wiąże. Postawiliśmy hipotezę, że skuteczność represji systemu CRISPRi można zmienić do pewnego poziomu poprzez modulowanie tworzenia kompleksu RNP. Aby określić ilościowo skuteczność represji systemu CRISPR, zaprojektowaliśmy system raportowania fluorescencji oparty na obwodzie genetycznym, w którym dCas9 z S. pyogenes jest indukowany przez anhydrotetracyklinę (aTc), a zarówno gen reporterowy (mCherry), jak i warianty sgRNA ulegają konstytutywnej ekspresji (ryc. 1A). Po dodaniu aTc do pożywki, trójskładnikowy kompleks dCas9 – sgRNA – DNA blokuje transkrypcję genu reporterowego, a poziom fluorescencji odwrotnie wskazuje na skuteczność represji systemu CRISPR. SgRNA zawiera łącznie 96 nukleotydów (nts). Region rozdzielający (pierwsze 20 nt) wiąże się z docelową sekwencją DNA, a pozostałe 76 nt uczestniczy w tworzeniu kompleksu i stabilności. Ponieważ niedopasowania w regionie odstępnika mogą spowodować utratę specyficzności i zwiększenie efektów odbiegających od celu w systemie opartym na CRISPR (33,43), maksymalna długość sgRNA, którą można zmodyfikować, wynosi 76 nt. W tym przypadku należy uzyskać bibliotekę o rozmiarze 476 (około 1045), ale jest ona zbyt duża, aby ją zbudować. Zatem wymagane jest zawężenie rozmiaru biblioteki poprzez określenie konkretnych pozycji w sgRNA. Najpierw zbadaliśmy, jak mutacje w sgRNA w każdym regionie wpływają na represję w systemie CRISPR. Poprzednie badanie wykazało, że mutacje w pętli trzpienia 1 (sg mut01 i sg mut02) doprowadziły do ​​znacznego spadku aktywności nukleazy Cas9, podczas gdy mutacje w pętli trzpienia 2 (sg mut03) lub pętli 3 (sg mut04) nie miało wpływu na jego aktywność (44). Zrekonstruowany sgRNA (sg mut05) zawierający mutacje w regionie łodyga-pętla 1 oraz regiony powtórzeń, tetraloop, anty-powtórzenie i łodyga-pętla 2 również zmniejszyły aktywność nukleazy (44). Jednakże w systemie CRISPRi wszystkie pięć wariantów sgRNA miało niewielki wpływ na skuteczność represji w porównaniu z sgRNA typu dzikiego (sg WT), przy czym każdy wariant wykazywał 2–4% poziom fluorescencji w porównaniu z kontrolą pozytywną bez regionu rozdzielającego ( sg PC) (Rysunek 1B). Wyniki te sugerują, że tworzenie kompleksu dCas9 – sgRNA jest mniej wrażliwe na modyfikację sekwencji w regionie trzpień-pętla 1 w systemie CRISPRi, w przeciwieństwie do systemu CRISPR/Cas9. Postawiliśmy hipotezę, że usunięcie regionów związanych ze stabilnością kompleksu może być punktem wyjścia do dalszej kontroli ekspresji na wielu poziomach. W tym celu skonstruowaliśmy skrócony sgRNA (sg trcSL1) pozbawiony łącznika, łodygi-pętli 2 i łodygi-pętli 3. To skrócone sgRNA ma minimalną liczbę składników i wykazano, że znacznie zmniejsza aktywność nukleazy w CRISPR/ Układ Cas9 (5,44). Testowany w systemie CRISPRi, ten wadliwy mutant wykazywał 8% poziom fluorescencji w porównaniu z sg PC, co sugeruje, że może nadal wiązać się z dCas9 i tłumić interesujący gen na pewnym poziomie, nawet przy zmniejszonej stabilności kompleksu trójskładnikowego (Figura 1B). Analiza strukturalna kompleksu RNP sugeruje, że łącznik, regiony łodyga-pętla 2 i łodyga-pętla 3 sgRNA są odpowiedzialne za stabilizację kompleksu poprzez ich interakcje z domeną nukleazy dCas9, co prowadzi do znacznego spadku indel efektywność w systemie CRISPR/Cas9 (44). W przeciwieństwie do tego, powtórzenie: region antypowtórzeniowy i pętla pnia 1 sgRNA oddziałują głównie z domeną rozpoznawania i domeną oddziałującą z PAM dCas9 i nie wpływają znacząco na wydajność indel w systemie CRISPR/Cas9 (44). Wynik ten potwierdza obserwację, że sg trcSL1 wykazywał znaczące zmniejszenie aktywności nukleazy w systemie CRISPR/Cas9, jednocześnie nieznacznie wpływając na powinowactwo wiązania w systemie CRISPRi.

Rycina 1. Budowa systemu i wpływ mutacji sgRNA na skuteczność represji. (A) System dwóch plazmidów do ilościowego określenia skuteczności represji. Jeden plazmid z początkiem p15A zawiera gen dCas9 pod promotorem indukowalnym aTc i gen mCherry pod promotorem konstytutywnym. Drugi plazmid pochodzenia cloDF13 zawiera sgRNA typu dzikiego lub zmutowanego pod konstytutywnym promotorem. (B) Względna fluorescencja każdego mutanta sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 i sg trcSL1) i sg WT w porównaniu z sg PC. +1 do + 20 to sekwencja rozdzielająca, która wiąże się z genem mCherry. sg PC: sgRNA bez spacera jako kontrola pozytywna, sg WT: sgRNA typu dzikiego. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (n=3). Wartości P określono za pomocą testu t dla niesparowanych grup. ns: nieistotne, **P< 0.01

Zmienianie wydajności tworzenia kompleksu w celu wielopoziomowej kontroli ekspresji

Tetraloop to sztuczny łącznik łączący crRNA i tracrRNA w systemie CRISPR-Cas9 (5). Struktura krystaliczna kompleksu trójskładnikowego, składającego się z dCas9, crRNA i tracrRNA, pokazała, że ​​tetrapętla i jej regiony flankujące 5 i 3 mają niewielki kontakt z dCas9 (44). Jednocześnie regiony powtórzeń: zapobiegające powtórzeniom i pętla macierzysta 1 są krytyczne dla kompleksu funkcjonalnego (44). Ponieważ nie oddziałuje bezpośrednio z dCas9, tetrapętlę i jej regiony flankujące zbadano jako potencjalne miejsca inżynierii sgRNA z dodatkowymi składnikami, takimi jak włączenie sekwencji aptameru w celu rekrutacji dodatkowych białek do sgRNA (45,46). Jest prawdopodobne, że mutacje w tym regionie mogą różnicować powinowactwo wiązania między sgRNA i dCas9 bez całkowitego zakłócania kompleksu. Losową bibliotekę 12- merów (odpowiednio 4 nt regionu tetrapętli i 4 nt regionu tetrapętli i 4 nt regionu flankującego 5 i 3) skonstruowano przy użyciu sg trcSL1 jako matrycy, aby jeszcze bardziej obniżyć wydajność tworzenia kompleksu między sgRNA i dCas9 (Rysunek 2A ). Zastosowaliśmy dwuetapową strategię sortowania, aby uzyskać różne mutanty sgRNA obejmujące skuteczność represji między sg WT (stan w pełni tłumiący) i sg PC (stan nierepresyjny). Podzieliliśmy oryginalną bibliotekę na mniejsze biblioteki o różnych zakresach intensywności fluorescencji, a następnie indywidualnie zidentyfikowaliśmy fluorescencję każdego wariantu sgRNA z mniejszej biblioteki. Rozkład fluorescencji oryginalnej biblioteki uzyskanej za pomocą cytometrii przepływowej był prawie identyczny z rozkładem sg PC (Figura 2B). Jednakże po trzech kolejnych etapach sortowania każda biblioteka (wysoka, średnia i niska) miała odpowiednio 63%, 24% i 14% mediany poziomów fluorescencji w porównaniu z sg PC (Figura 2B). Z tych mniejszych bibliotek wyizolowano osiemdziesiąt dwie kolonie, których poziomy fluorescencji wahały się od 8% do 104% (Figura 2C). Wyniki te sugerują, że mutacja tetrapętli i jej regionu flankującego sgRNA może modulować powinowactwo wiązania między dCas9 i sgRNA w celu uzyskania różnej wydajności represji. Ilościowa analiza PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) 10 mutantów sgRNA (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10, tabela dodatkowa S6) z różnymi sygnałami fluorescencji między sg WT i sg PC wśród 82 kolonii sgRNA wykazała, że ​​poziomy fluorescencji wzrastały liniowo wraz ze wzrostem transkryptów mCherry , wskazując, że nasz system CRISPRi kontroluje ekspresję genów na poziomie transkrypcji (rysunek uzupełniający S2). Nasz przestrajalny system CRISPRi wykorzystuje zmodyfikowane sgRNA, które mogą osiągnąć nawet 45-krotną kontrolę represji, umożliwiając precyzyjne dostrojenie wydajności represji bez zmiany ilości dCas9 lub sgRNA. Godną uwagi zaletą naszego systemu jest to, że może on precyzyjnie dostroić skuteczność represji poprzez specyficzne warianty sgRNA bez możliwości wystąpienia niezamierzonych konsekwencji, nawet jeśli wymagane jest dodatkowe klonowanie. Co więcej, krzywa wzrostu sugeruje, że nasz system nie nakłada znaczącego obciążenia komórkowego (rysunek uzupełniający S3). Ponadto RNA-Seq na trzech wariantach sg trcSL1 o różnych poziomach efektywności represji wykazało, że ekspresja 51 do 83 genów została zmieniona, w przeciwieństwie do 262 genów zmienionych w sg WT (rysunek uzupełniający S4). Wyniki te sugerują, że warianty sg trcSL1 miały jeszcze mniejsze efekty niepożądane niż konwencjonalny system CRISPRi. Jest to szczególnie istotne w zastosowaniach inżynierii metabolicznej, gdzie optymalizacja szlaków metabolicznych często wiąże się z manipulacją wieloma genami. Możliwość dostrojenia ekspresji genów bez powodowania negatywnych skutków ubocznych może znacznie przyspieszyć proces optymalizacji i poprawić ogólną wydajność i produktywność systemu.

Rysunek 2. Struktura biblioteki sgRNA i przeszukiwanie biblioteki. (A) rusztowanie sgRNA użyte w tym badaniu. 12-mer zawierający tetrapętlę i jego sekwencja flankująca jest losowo mutowana z sg trcSL1 w celu uzyskania biblioteki sgRNA. (B) Rozkład fluorescencji uzyskany z cytometrii przepływowej przed (po lewej) i po (po prawej) sortowaniu. Każda dystrybucja zawiera 100,000 komórek. (C) Fluorescencja pojedynczych kolonii uzyskanych z (B). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (n=2).

Wpływ ilości dCas9 i sgRNA na skuteczność represji

Ponieważ modulowanie ilości dCas9 lub sgRNA może zmienić skuteczność represji systemu CRISPRi (23,24), istotne jest zbadanie wpływu ilości dCas9 i sgRNA na skuteczność represji. Przetestowaliśmy wydajność naszego systemu w różnych warunkach, zmieniając ilości dCas9 i sgRNA przy użyciu dziesięciu mutantów sgRNA (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10). Do ekspresji dCas9 zastosowano trzy różne stężenia (20, 100 i 500 ng/ml) induktora. W porównaniu z poziomem mRNA dCas9, gdy zastosowano 20 ng/ml induktora, został on dodatkowo zwiększony 15-krotnie (100 ng/ml) i 22-krotnie (500 ng/ml) (rysunek uzupełniający S5A ). Istnieją obawy dotyczące nadekspresji dCas9, ponieważ wysoki poziom dCas9 może być toksyczny dla komórek (47,48) lub czasami nie (49). Jednakże szybkość wzrostu została zmniejszona o mniej niż 10%, gdy zastosowano do 500 ng/ml aTc, zgodnie z krzywymi wzrostu przy różnych stężeniach induktora (rysunek uzupełniający S6). Sugeruje to, że ilość dCas9 nie miała toksycznego wpływu na E. coli w testowanych warunkach. Skuteczność represji uległa marginalnej zmianie, gdy wyrażono różną ilość dCas9 (Rysunek 3A). Było zgodne z poprzednim badaniem, że system CRISPRi osiągnął maksymalną skuteczność represji przy [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Rysunek 3. Charakterystyka i modułowość przestrajalnego systemu CRISPRi. (A) Względna fluorescencja przy różnych stężeniach aTc (20, 100 i 500 ng/ml). (B) Względna fluorescencja pod różnymi promotorami (J23100 i UPJ23119). (C) Względna fluorescencja pod różnymi protoprzerywnikami. Oś x wskazuje względną fluorescencję mCherry, a oś y wskazuje względną fluorescencję lacI33-mCherry (czerwony) i araC33-mCherry (niebieski). Do końca 5-mCherry (56) dodano 33 bp dodatkowych sekwencji z lacI i araC. (D) Energia swobodna 12-meru i względna fluorescencja. Linie przerywane wskazują 95% przedział predykcji, a linie ciągłe wskazują linię regresji. Wartości dG sg trcSL1c2 nie można było uzyskać przy użyciu mFold i dlatego wykluczono ją z analizy. (A–D) Wszystkie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (n=3).

Modułowość przestrajalnego systemu CRISPRi

Nasze podejście wykorzystujące specyficzne warianty sgRNA w celu utrzymania określonego poziomu ekspresji docelowego DNA może zostać wykorzystane jako system modułowy. Aby zademonstrować wykonalność przestrajalnego systemu CRISPRi do namierzania różnych protoprzerywników, skonstruowaliśmy dwa geny fuzyjne (lacI{0}}mCherry i araC33-mCherry), dodając 33 bps sekwencji z lacI i araC do 5 -końca mCherry (56). Genom E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) zawiera dwie kopie sekwencji protoprzerywnika dla lacI33- mCherry i jedną kopię dla araC33-mCherry. Jednakże te sekwencje chromosomalne nie mają sekwencji PAM i dlatego nie mogą być celem kompleksu dCas9-sgRNA (43). Kiedy siRNA zaprojektowano tak, aby celowały w każdy protoprzerywnik, skuteczność represji była konsekwentnie utrzymywana dla wszystkich protoprzerywników z lacI33, araC33 i mCherry (Figura 3C). Odkrycia te sugerują, że nasz przestrajalny system CRISPRi może skutecznie regulować ekspresję genów na pewnym poziomie niezależnie od sekwencji protoprzerywników. Jednym z potencjalnych wyjaśnień obserwowanego związku między tworzeniem kompleksu RNP a efektywnością represji jest zmiana energii swobodnej podczas tworzenia kompleksu. Sztuczny łącznik tetrapętlowy i jego region flankujący zawierają dwie pary zasad A: U i G: C Watsona-Cricka oraz parę zasad A: G inną niż Watson-Crick (44). Ponieważ wiązanie crRNA i tracrRNA ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kompleksu, mutacje ukierunkowane na tetraloop wpłyną na powinowactwo wiązania między dCas9 i sgRNA. Powinowactwo to można obliczyć na podstawie różnicy energii swobodnej między stanami ograniczonymi i nieograniczonymi. Jednakże obliczenie energii swobodnej stanów ograniczonych stanowi wyzwanie (57). Przypuszczaliśmy, że ogólna struktura i stabilność stanu ograniczonego nie ulegają zmianie, ponieważ sgRNA posortowane z biblioteki nie zakłóciły całkowicie jego funkcji. Co więcej, tetrapętla i jej obszar flankujący mają niewielki kontakt z dCas9 (44). Zatem na powinowactwo wiązania pomiędzy dCas9 i sgRNA będzie miała głównie wpływ stabilność drugorzędowej struktury tetrapętli i jej sekwencji flankującej. W oparciu o ten pomysł obliczyliśmy energię swobodną tetrapętli i jej sekwencji flankujących za pomocą formy (58). Różnicę w energii swobodnej fałdowania spowodowanej mutacjami definiuje się jako różnicę między energią swobodną sekwencji zmutowanych i typu dzikiego. Można ją bezpośrednio obliczyć na podstawie swobodnej energii zwijania mutantów, ponieważ energia zwijania sekwencji typu dzikiego jest stała i wynosi –4,3 kcal/mol. Wraz ze wzrostem darmowej energii składania wzrastał sygnał fluorescencji (rysunek 3D). Skuteczność represji była najwyższa, gdy energia fałdowania obszaru zawierającego tetrapętlę była bliska lub niższa od 0 kcal/mol i malała liniowo, gdy energia fałdowania przekraczała 0 kcal/mol. Obserwacja ta sugeruje, że efektywność tworzenia kompleksu między dCas9 i sgRNA jest zdeterminowana przez drugorzędową strukturę regionu tetraloop, co pomaga wyjaśnić modułowość naszego systemu. W celu dalszego potwierdzenia tej zależności zmierzono skuteczność represji dodatkowego 85 sgRNA z różnymi sekwencjami 12-merów z biblioteki. Pokazało również korelację zaobserwowaną dla wariantów sg trcSL1 (rysunek 3D i tabela uzupełniająca S7), sugerując, że łącznik tetraloopowy odgrywa kluczową rolę w tworzeniu kompleksu RNP i że mutacje w tym regionie mogą wpływać na wydajność systemu CRISPR. Ponadto zależność ta wskazuje na możliwość komputerowego projektowania wariantów sgRNA o pożądanej wydajności represji.

Zastosowanie przestrajalnego systemu CRISPRi do redystrybucji strumienia na szlaku biosyntezy wiolaceiny u E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-krotność) w porównaniu z innymi genami, obliczona na podstawie krzywych standardowych. Natomiast ekspresja innych nieuregulowanych enzymów w szlaku wiolaceiny (vioA, vioB i vioE) pozostała niezmieniona. Wyniki te sugerują, że nasz system może specyficznie celować i modulować ekspresję poszczególnych genów bez wpływu na inne geny na szlaku. Bezpośrednie oznaczenie ilościowe PV i PDV nie było możliwe ze względu na brak dostępnych na rynku standardów analizy HPLC. Zatem zmierzyliśmy miana w dowolnych jednostkach, stosując powierzchnię piku HPLC. Miano produktu osiągnęło maksimum po 8 godzinach po indukcji, a następnie stopniowo spadało (rysunek uzupełniający S8), prawdopodobnie z powodu konwersji produktu do innych produktów ubocznych, takich jak chromowiridany, przez nieznany mechanizm (42,64). Zaobserwowane mniejsze piki w widmie HPLC wskazywały na obecność dodatkowych mniejszych produktów ubocznych. Poprzednie badania wykazały, że logarytm miana każdego produktu w dowolnych jednostkach można przewidzieć poprzez liniowe kombinacje siły promotora każdego genu zaangażowanego w szlak biosyntezy wiolaceiny (42). Ten model regresji log-liniowej był również ważny w naszym systemie, a zwiększone transkrypty vioD były powiązane ze zwiększoną produkcją PV (Rysunek 4B). Wiadomo, że inżynieria promotora lub 5 -UTR każdego genu zaangażowanego w szlak biosyntezy wiolaceiny umożliwiła redystrybucję strumienia i optymalizację szlaku (65,66). Nasz system mógłby działać jako alternatywna metoda ilustrująca kontrolę transkrypcji bez manipulacji promotorami zaangażowanymi w szlak przy użyciu syntetycznych sgRNA, które są krótkie i można je złożyć metodami jednoetapowymi. Badania przesiewowe za pomocą przestrajalnego systemu CRISPRi umożliwiają przekierowanie szlaku z przewidywalnym strumieniem przed bezpośrednią manipulacją szczepami gospodarza lub kasetami genowymi, co potencjalnie przyspiesza proces.

Zastosowanie przestrajalnego systemu CRISPRi do równoważenia strumienia węgla w komórkach E. coli wytwarzających likopen

Efektywna produkcja cennych związków w inżynierii metabolicznej wymaga zrównoważenia strumienia węgla. Szlak 4-fosforanu metyloerytrytolu (MEP) to szlak metaboliczny wykorzystujący proste prekursory, takie jak pirogronian i 3-fosforan aldehydu glicerynowego (GAP), do wytwarzania elementów budulcowych izoprenoidów, pirofosforanu dimetyloallilu i pirofosforanu izopentenylu (67,68) . Cząsteczki te syntetyzują pirofosforan geranylu, który przekształca się w pirofosforan farnezylu (FPP) (67,68). Likopen, wysoko ceniony karotenoid o silnych właściwościach przeciwutleniających i różnorodnych zastosowaniach w różnych gałęziach przemysłu (69), jest syntetyzowany z FPP w szeregu reakcji enzymatycznych z crtE, crtB i crtI (ryc. 4C) (22,70). Prekursor GAP jest niezbędny nie tylko dla szlaku MEP, ale także dla szlaku glikolizy (22). Wykazano, że zmniejszona ekspresja genu gapA, który koduje dehydrogenazę aldehydu glicerynowego-3-fosforanu (GAPDH) w szlaku glikolizy, zwiększa produkcję likopenu poprzez zwiększenie puli GAP (22). Dlatego obraliśmy za cel gapA z pięcioma wariantami, w tym trzema wariantami sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 i sg trcSL1c6), które wykazały różną skuteczność represji, sg PC i sg WT. Jednakże gapA jest genem niezbędnym, którego nie można całkowicie zniszczyć (71,72). Próby stłumienia gapA za pomocą konwencjonalnego CRISPRi przy użyciu sg WT zakończyły się niepowodzeniem, nawet przy małej nieszczelności dcas9 pod promotorem tet (73). Z drugiej strony, wielopoziomową represję ekspresji genu gapA przy użyciu przestrajalnego systemu CRISPRi uzyskano bez defektów wzrostu i skutkowało 2,7-krotnym wzrostem produkcji likopenu przez sg trcSL1c6 w porównaniu ze szczepem w pełni wyrażającym gen gapA po 15 godzinach hodowli (rysunek 4D i rysunek uzupełniający S9). Doniesiono, że tylko 10% naturalnej ekspresji genu gapA prowadzi do zwiększonej puli GAP bez znaczących zmian w dalszych metabolitach na szlaku glikolizy, takich jak 2-fosfoglicerynian i 3-fosfoglicerynian ( 22). Łącznie wyniki te pokazują, że przestrajalny CRISPRi może precyzyjnie tłumić ekspresję genów na wielu poziomach bez inżynierii chromosomowej.

Rysunek 4. Zastosowanie przestrajalnego systemu CRISPRi do szlaku biosyntezy wioloceiny. (A) Szlak biosyntezy wioolaceiny i konstrukcja plazmidu. Pięć genów (vioA, vioB, vioC, vioD i vioE) odpowiedzialnych za wytwarzanie wiolaceiny sklonowano do plazmidu wyrażającego dCas9-. Wytwarzane są cztery główne produkty (wiolaceina, prowiolaceina, deoksywiolaceina i prodeoksywiolaceina). sg WT dla vioC i pięć wariantów sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 i sg trcSL1c9) dla vioD, wykazujące różną skuteczność represji, sklonowano do innego plazmidu. Trp: L-tryptofan, V: wiolaceina, PV: prowiolaceina, PDV: prodeoksywiolaceina, DV: deoksywiolaceina, PDVA: kwas protodeoksywiolaceinowy, PVA: kwas protowiolaceinowy. (B) Zależność między transkryptami vioD, fluorescencją mCherry i mianem PDV i PV. Oś x wskazuje względny RNA vioD uzyskany z RT-qPCR, oś y po lewej stronie wskazuje względną fluorescencję mCherry z Figury 3, a oś y po prawej stronie wskazuje stosunek powierzchni HPLC. Próbki o najwyższej wartości vioD RNA ustawiono na 100% w celu normalizacji. (C) Szlak biosyntezy likopenu i konstrukcja plazmidu. Trzy geny (crtE, crtB, crtI) odpowiedzialne za produkcję likopenu sklonowano do plazmidu wyrażającego dCas9-. gapA atakowano wariantami sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6), a sg PC klonowano do drugiego plazmidu. Glc: glukoza, GAP: 3-fosforan aldehydu glicerynowego, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfoglicerynian, DMAPP: pirofosforan dimetyloallilu, IPP: pirofosforan izopentenylu, FPP: pirofosforan farnezylu. (D) Związek między transkryptami gapA, fluorescencją mCherry i produkcją likopenu. Oś x wskazuje względną przerwę RNA otrzymaną z RT-qPCR, oś y po lewej stronie wskazuje względną fluorescencję mCherry z Figury 3, a oś y po prawej stronie wskazuje miano likopenu. (B, D) Wszystkie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (n=3).

WNIOSEK

Zaprojektowaliśmy przestrajalny system CRISPRi, który mógłby precyzyjnie kontrolować ekspresję genów na pożądanym poziomie. Mutując tetrapętlę i jej region flankujący, syntetyczne sgRNA ukierunkowane na różne sekwencje protoprzerywników mogą regulować gen na pewnym poziomie. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten system do przekierowania interesującego strumienia metabolicznego na szlaku biosyntezy wiolaceiny w celu wytworzenia pochodnych indolu w przewidywalnym stosunku. Dodatkowo wykazaliśmy, że zastosowanie przestrajalnego CRISPRi doprowadziło do 2,7-krotnego wzrostu produkcji likopenu, co podkreśla wszechstronność naszego systemu w zakresie poprawy produkcji innych cennych związków. System ten przyspieszyłby procesy optymalizacji strumienia przed trwałą manipulacją informacją genetyczną gospodarza, taką jak wymiana promotora lub sekwencji 5-UTR.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

BIBLIOGRAFIA

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P. i Siksnys, V. (2011) System Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas zapewnia odporność na Escherichia coli. Kwasy nukleinowe Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. i Siksnys, V. (2012) Kompleks rybonukleoproteinowy Cas9-crRNA pośredniczy w specyficznym rozszczepianiu DNA w celu uzyskania odporności adaptacyjnej u bakterii. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA i in. . (2013) Multipleksowa inżynieria genomu z wykorzystaniem systemów CRISPR/Cas. Nauka, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA i Zhang, F. (2013) Inżynieria genomu z wykorzystaniem systemu CRISPR-Cas9. Nat. Protok., 8, 2281–2308.

5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA i Charpentier,E. (2012) Programowalna endonukleaza DNA kierowana podwójnym RNA w adaptacyjnej odporności bakteryjnej. Nauka, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. i Jinek, M. (2014) Podstawy strukturalne rozpoznawania docelowego DNA zależnego od PAM przez endonukleazę Cas9. Natura, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP i Lim, WA (2013) Zmiana przeznaczenia CRISPR jako platformy kierowanej za pomocą RNA do kontroli ekspresji genów specyficznej dla sekwencji. Komórka, 152, 1173–1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS i Qi, LS (2013) Interferencja CRISPR (CRISPRi) w celu specyficznej dla sekwencji kontroli ekspresji genów. Nat. Protok., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. i Ingolia, NT (2021) Biblioteka przewodników interferencyjnych CRISPR w skali genomu umożliwia kompleksowe profilowanie fenotypowe u drożdży. BMC Genomika, 22, 205.

10. Yoon, J. i Woo, HM (2018) Inżynieria metaboliczna Corynebacterium glutamicum za pośrednictwem interferencji CRISPR do produkcji homomaślanu. Biotechnologia. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF i Lu, TK (2016) Corynebacterium glutamicum inżynieria metaboliczna z interferencją CRISPR (CRISPRi). Syntezator ACS. Biol., 5, 375–385.

12. Zhang, GQ, Ren, XN, Liang, XH, Wang, YQ, Feng, DX, Zhang, YJ, Xian, M. i Zou, HB (2021) Poprawa mikrobiologicznej produkcji aminokwasów: od konwencjonalnych podejść do najnowszych trendów. Biotechnologia. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH i Lee, SG (2017) CRISPR kierowana interferencją multipleksowa represja endogennych konkurujących genów szlaku do przekierowania strumienia metabolicznego u Escherichia coli. Mikrob. Fakt komórkowy, 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. i Machner, MP (2021) Multipleksowe narzędzie interferencyjne CRISPR do badania genów zjadliwości u Legionella pneumophila. komuna. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH i Chen, W. (2019) GRNA bramkowany przez ryboregulację dla programowalnej funkcji CRISPR-Cas9. Nat. Chem. Biol., 15, 217–220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR i Salis, HM (2019) Jednoczesna represja wielu genów bakteryjnych przy użyciu niepowtarzalnych, bardzo długich macierzy sgRNA. Nat. Biotechnologia, 37, 1294–1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. i Lee, TS (2019) Przekierowanie strumienia metabolicznego poprzez kombinatoryczną multipleksową represję za pośrednictwem CRISPRi do produkcji izopentenolu w Escherichia coli. Syntezator ACS. Biol., 8, 391–402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. i Eikmanns, BJ (2019) Prosty, podwójnie indukowalny system interferencji CRISPR do celowania w wiele genów w Corynebacterium glutamicum. Plazmid, 103, 25–35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. i Hudson, EP (2016) Represja wielu genów u sinic przy użyciu CRISPRi. Syntezator Acs. Biol., 5, 207–212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. i Jung, GY (2016) Optymalne przywrócenie równowagi szlaku wytwarzania kwasu 3-hydroksypropionowego z glicerolu w Escherichia coli. Syntezator ACS. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ i Yan, Y. (2015) Regulowanie metabolizmu malonylo-CoA poprzez syntetyczne antysensowne RNA w celu zwiększenia biosyntezy produktów naturalnych. Metab. Inż., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK i Jung, GY (2016) Precyzyjne równoważenie prekursorów do produkcji izoprenoidów poprzez precyzyjną kontrolę wyrażenia gapA w Escherichia coli. Metab. Inż., 38, 401–408.

23. Li, XT, Jun, Y., Erickstad, MJ, Brown, SD, Parks, A., Court, DL i Jun, S. (2016) tCRISPRi: przestrajalna i odwracalna, jednoetapowa kontrola ekspresji genów. Nauka. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Ham, JY, Zalatan, JG i Carothers, JM (2018) Regulowana ekspresja sgRNA dostraja CRISPRi w E. coli. Biotechnologia. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW i Sandoval, NR (2020) Bioczujniki oparte na czynnikach transkrypcyjnych i systemy indukowalne w bakteriach niemodelowych: bieżący postęp i przyszłe kierunki. Aktualny Opinia. Biotechnologia, 64, 39–46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. i in. (2019) Kontrolowanie CRISPR-Cas9 za pomocą sgRNA aktywowanych i dezaktywowanych ligandami. Nat. Komunia, 10, 2127.

27. Ferreira,R., Skrekas,C., Hedin,A., Sanchez,BJ, Siewers,V., Nielsen,J. i David, F. (2019) Wspomagane modelem dostrajanie centralnego metabolizmu węgla w drożdżach poprzez regulację opartą na dCas9-. Syntezator ACS. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. i Qi, Q. (2019) Dostrajanie hemB przy użyciu CRISPRi w celu zwiększenia produkcji kwasu 5-aminolewulinowego w Escherichia coli. Przód. Mikrobiol., 10, 1731.

29. Zheng, T., Hou, Y., Zhang, P., Zhang, Z., Xu, Y., Zhang, L., Niu, L., Yang, Y., Liang, D., Yi, F . i in. (2017) Profilowanie specyficzności RNA z pojedynczym przewodnikiem ujawnia sekwencję rdzeniową wrażliwą na niedopasowania. Nauka. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. i Marraffini, Los Angeles (2013) edycja genomów bakteryjnych pod kontrolą RNA przy użyciu systemów CRISPR-Cas. Nat. Biotechnologia.,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, H. i Gross, Kalifornia (2021). Potok obliczeniowy do projektowania przewodników RNA dla mismatch-CRISPRi. Protokół STAR, 2, 100521.

32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. i Gross, Kalifornia (2020) Mismatch-CRISPRi ujawnia współzmienne zależności ekspresji i dopasowania podstawowych genów w Escherichia coli i Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR i Martin, SE (2019) Celowanie w wiele genów i tolerancja na niedopasowanie mogą zakłócać analizę genomu szerokie, połączone ekrany CRISPR. Genom Biol., 20, 21.

34. Rozen, S. i Skalecki, H. (2000) Primer3 w Internecie dla zwykłych użytkowników i programistów-biologów. Metody Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. oraz Too, HP (2011). Nowe geny referencyjne do ilościowego określania odpowiedzi transkrypcyjnych Escherichia coli na nadekspresję białka metodą ilościowej PCR. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ i Schmittgen, TD (2001) Analiza danych względnej ekspresji genów przy użyciu ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym i metody 2(-Delta Delta C(T)). Metody, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: Narzędzie kontroli jakości danych sekwencyjnych o dużej przepustowości. wersja 0.11.9 wyd.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. i Salzberg, SL (2009). Ultraszybkie i wydajne pod względem pamięci dopasowanie krótkich sekwencji DNA do ludzkiego genomu. Genom Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM i in. (2021) Dwanaście lat SAMtools i BCFtools. Giganauka, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ i Pachter,L. (2010) Składanie transkryptu i kwantyfikacja za pomocą RNA-Seq ujawnia transkrypty bez adnotacji i przełączanie izoform podczas różnicowania komórek. Nat. Biotechnologia, 28, 511–515.

41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL i Pachter,L. (2013) Analiza różnicowa regulacji genów przy rozdzielaniu transkryptów za pomocą sekwencji RNA. Nat. Biotechnologia, 31, 46–53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ i Dueber, JE (2013) Optymalizacja poziomu ekspresji szlaku wielu enzymów przy braku testu o wysokiej przepustowości. Kwasy nukleinowe Res., 41, 10668–10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. i in. (2013) Specyficzność DNA ukierunkowana na nukleazy Cas9 kierowane przez RNA. Nat. Biotechnologia, 31, 827–832.

44. Nishimasu,H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. i Nureki, O. (2014) Struktura krystaliczna Cas9 w kompleksie z przewodnikiem RNA i docelowym DNA. Komórka, 156, 935–949.

45. Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO i Skok, JA (2016) Skafoldy CRISPR-dCas9 i sgRNA umożliwiają dwukolorowe obrazowanie na żywo sekwencji satelitarnych i wielokrotnie wzbogacane indywidualne loci. Nat. Komuni., 7, 11707.

46. ​​Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, H. i Houben, A. (2020) Zastosowanie aptamerów poprawia obrazowanie na żywo telomerów roślin w oparciu o CRISPR. Przód. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA i Voigt, Kalifornia (2014) Wielowejściowe obwody genetyczne CRISPR/Cas, które łączą sieci regulacyjne gospodarza. Mol. System. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC i Moon, TS (2016) Programowalna kontrola ekspresji genów bakterii za pomocą 44, 2462–2473.

49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. i van Teeffelen, S. (2018) Dostrajanie zdolności dCas9 do blokowania transkrypcji umożliwia solidne i bezszumowe niszczenie genów bakteryjnych. Mol. System. Biol., 14, e7899.

50. Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y. i poszedł. (2012) Opracowanie i zastosowanie systemu ekspresji indukowanego arabinozą poprzez ułatwienie wychwytu induktora przez Corynebacterium glutamicum. Aplikacja Otaczać. Microbiol., 78, 5831–5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. i Keasling, JD (2018) Izolacja i charakterystyka nowych mutacji w miejscu pochodzenia pSC101, które zwiększają liczbę kopii. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. i Polak, T. (2020) Przestrajalny plazmid ekspresyjny indukowany L-arabinozą dla bakterii kwasu octowego Gluconobacter oxydans. Aplikacja Mikrobiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR i Park,S. (2021) Charakterystyka in vivo indukowalnego układu promotorów 3-dehydrogenazy hydroksypropionowej u Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty,NS, Graham,AE, Studena,L. i Ledesma-Amaro, R. (2020) Multipleksowane technologie CRISPR do edycji genów i regulacji transkrypcji. Nat. Komunia, 11, 1281.

55. Yan, Q. i Fong, SS (2017) Badanie efektów wiązania transkrypcji in vitro i szumu przy użyciu promotorów konstytutywnych w połączeniu z sekwencjami elementów UP w Escherichia coli. J. Biol. Inż., 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. i Jung, GY (2013) Projekt predykcyjny regionu inicjacji translacji mRNA w celu kontrolowania wydajności translacji prokariotycznej. Metab. Inż., 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. i Das, R. (2019) Ślepe testy przewidywania powinowactwa wiązania RNA z białkami. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA, 116, 8336–8341.

58. Żuker, M. (2003) Serwer sieciowy Mfold do zwijania kwasów nukleinowych i przewidywania hybrydyzacji. Kwasy nukleinowe Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. i Xie, X. (2021) Redystrybucja strumienia centralnego metabolizmu węgla w celu wydajnej produkcji l-tryptofanu u Escherichia coli. Biotechnologia. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. i Hu, H. (2019) (13)C inżynieria metaboliczna Escherichia coli pod kontrolą analizy strumienia metabolicznego w celu poprawy produkcji acetolu z glicerolu. Biotechnologia. Biopaliwa, 12, 29.

61. Duran, N. i Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: przegląd perspektyw farmakologicznych i przemysłowych. Krytyczny. Ks. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ i Walsh, CT (2006) Biosynteza in vitro wiolaceiny z L-tryptofanu przez enzymy VioA-E z Chromobacterium violaceum. Biochemia, 45, 15444–15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY i Lee, JW (2021) Ewolucja adaptacyjnego laboratorium wspomaganego biosensorami do produkcji wiolaceiny. Wewnętrzne J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. i Salas, JA (2006) Reevaluation of the violacein biosynthetic szlak i jego związek z biosyntezą indolokarbazolu. Chem. Bio. Chem., 7, 1231–1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ i Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a kombinatoryczne podejście do równoważenia transkrypcji szlaków metabolicznych. Nauka. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. i Wang, Y. (2021) Bezpośrednia inżynieria RBS biosyntetycznego klastra genów w celu wydajnej produktywności wiolacein w E. coli. Mikrob. Fakt komórkowy., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Niemewalonianowy szlak biosyntezy prekursorów izoprenoidów. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer, M. (1999) Odkrycie niezależnego od mewalonianu szlaku biosyntezy izoprenoidów u bakterii, alg i roślin wyższych. Nat. Szturchać. Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Caris-Veyrat, C., Lowe, G. i Bohm, V. (2016) Likopen i jego rola przeciwutleniająca w profilaktyce chorób układu krążenia – recenzja krytyczna. Krytyczny. Wielebny Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD i Misawa, N. (1998) Produkcja karotenoidów likopenu, beta-karotenu i astaksantyny w drożdżach spożywczych Candida utilis. Aplikacja Otaczać. Mikrobiol., 64, 1226–1229.

71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA i Henderson,IR (2018) The Essential genome of Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL i Mori,H. (2006) Konstrukcja Escherichia coli K-12 w ramce, jednogenowe mutanty z nokautem: kolekcja Keio. Mol. System. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram, R. i Hillen, W. (2008) Zastosowanie represora Tet w regulacji i ekspresji genów prokariotycznych. Mikrob. Biotechnologia, 1, 2–16.