Kurkumina łagodzi starzenie się mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku psa podczas ekspansji in vitro, część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

2.5. Autofagia Inovoloes w wywieraniu ochronnego działania Cur w starzeniu się cBMSC

Aby zbadać wpływ autofagii indukowanej Cur na starzenie się cBMSC, poziom autofagii modulowano przez zastosowanie RAP (200 nM) lub 3-MA (5 mM).3-MA wywiera znaczące działanie hamujące na aktywność autofagiczną, objawiającą się znaczną regulacją w dół ekspresji mRNA związanego z mikrotubulami łańcucha lekkiego białka 1 3(LC3), genu związanego z autofagią (ATG)7, ATG12 i unc51-podobnej do kinazy aktywującej autofagię{ {14}}(ULK1); zmniejszony stosunek ekspresji białka 1 łańcucha lekkiego 3 typu Ⅱ/I związanego z mikrotubulami (LC3-I/I); oraz zwiększona ekspresja p62 w porównaniu z grupą kontrolną (Figura 5A, B). Odpowiednio, w porównaniu z grupą Cur, zaobserwowano spadek aktywności autofagicznej w grupie 3-MA plus Cur (Figura 5A, B). W przeciwieństwie do tego, zaobserwowano wzrost aktywności autofagicznej w grupie RAP, o czym świadczy zwiększona ekspresja mRNA LC3, ATG12 i ATG7; zwiększona konwersja LC3-I do LC3-II; i degradacja p62 (Figura 5A, B).

Po pierwsze, systematycznie badano aktywność autofagiczną. Tworzenie wakuoli autofagicznych (zwanych również autofagosomami) oceniano na podstawie obserwacji morfologicznych, a wyniki wskazywały, że w grupie Cur i grupie RAP było więcej wakuoli autofagicznych i kropek LC3 w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy zmniejszona liczba wakuoli autofagicznych i mniej kropek LC3 zaobserwowano w grupach 3-MA i 3-MA plus Cur (Rysunek 5C, E). Ponadto barwienie LysoTracker wykazało, że zakwaszenie lizosomów zostało wzmocnione przez RAP i Cur w cBMSC i zmniejszone w grupy 3-MA i 3-MA plus Cur (rysunek 5D). Wyniki pokazują, że Cur i RAP wywierają podobny pozytywny wpływ na aktywację autofagii i że aktywność autofagii jest tłumiona przez 3-MA.rozmiar penisa cistanche,Jednak hamujący wpływ 3-MA na autofagię można częściowo uratować przez zastosowanie Cur.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Aby potwierdzić, czy autofagia uczestniczy w regulacji starzenia się CB MSc, zbadaliśmy dalej fenotypy związane ze starzeniem się po promowaniu lub tłumieniu autofagii poprzez leczenie farmakologiczne. Wyniki wykazały, że zmniejszona liczba komórek SA- -gal-dodatnich była obecna w grupach Cur i RAP, podczas gdy w grupie {{5} zaobserwowano zwiększoną liczbę komórek SA- -gal-dodatnich }grupa MA w porównaniu z grupą kontrolną. Warto zauważyć, że liczba komórek SA- -gal-dodatnich była znacząco zwiększona w grupie 3-MA plus Cur w porównaniu z grupą Cur (Figura). Wyniki analizy RT-qPCR wykazały, że leczenie RAP i Cur zwiększyło poziom ekspresji SOX-2 i Nanog oraz zmniejszyło poziom ekspresji IL-6, TNF-a, p21 i p16 w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak hamowanie autofagii przez 3-MA podwyższało ekspresję p16, p21, TNF- i IL-6 (Figura 6C-E). Ponadto, w porównaniu z grupą kontrolną, wydajność tworzenia kolonii przez cBMSCs była zwiększona w grupach Cur i RAP, podczas gdy liczba i wielkość CFU-F były znacznie zmniejszone w grupie 3-MA. Dodatkowo wykazano, że zwiększony wpływ Cur na liczbę cBMSC tworzących kolonie można znieść poprzez wstępne kondycjonowanie za pomocą 3-MA (Figura 6B).proszek cistancheDowody te wskazują, że RAP i Cur mogą polepszać starzenie się cBMSC, podczas gdy 3-MA pogarsza starzenie się cBMSC i łagodzi korzystne efekty wywierane przez Cur.

Podsumowując, wyniki te sugerują, że hamowanie autofagii za pomocą 3-MA przyspiesza starzenie się cBMSC, podczas gdy aktywacja autofagii za pomocą Cur i RAP łagodzi starzenie się cBMSC (Figura 6F). Warto zauważyć, że ochronne działanie wywierane przez Cur zostało osłabione przez wstępne traktowanie 3-MA (Figura 6F), co sugeruje, że autofagia indukowana przez Cur jest potencjalnym mechanizmem molekularnym do poprawy starzenia się cBMSC.

3. Dyskusja

Organizmy stale naprawiają uszkodzone tkanki i opóźniają procesy związane ze starzeniem się dzięki charakterystycznym cechom funkcjonalnym MSC, które znajdują się w różnych tkankach i narządach [15]. Niestety, wiek i choroba są kluczowymi czynnikami starzenia się MSC in vivo, a wewnętrzne i zewnętrzne różnice w środowisku komórkowym przyspieszają starzenie się MSC in vitro, co negatywnie wpływa na ich zdolność do immunosupresji, różnicowania i migracji, ostatecznie zmniejszając skuteczność samopoczucia. -naprawa i przeszczep w MSC [7,14,49-51].ekstrakt z salsy cistancheOja i współpracownicy wskazali, że ludzkie BMSCs zaprzestały proliferacji przy piątym do dziewiątego pasażu hodowli o jakości klinicznej i wykazywały typowe fenotypy starzenia, takie jak hipertroficzna i płaska morfologia, aktywacja inhibitorów kinaz cyklu komórkowego p16 i p21, zmniejszona szybkość proliferacji oraz zwiększona aktywność SA- -gal [52]. Najwyraźniej ekspansja in vitro nieuchronnie prowadzi do przedwczesnego pojawienia się starzenia w MSC, które uważa się za ważny system modelowy w badaniach nad starzeniem się komórek in vitro [42, A4, A5]. Nasze obecne badanie wykazało, że cBMSC przed trzecim pasażem wykazywały jednolitą morfologię, ale zaobserwowano szereg zmian w zakresie morfologii komórkowej, fizjologii i ekspresji genów po szóstym pasażu (ryc. 2 i 7), zgodnych z przedwczesnym starzeniem się. .

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Coraz więcej dowodów wskazuje, że stymulacja farmakologiczna jest obiecującym podejściem do ratowania MSC przed starzeniem się [53,54]. Mając to na uwadze, wiele naturalnych i syntetycznych związków zostało szeroko zbadanych w celu określenia ich potencjału przeciwzapalnego, antyoksydacyjnego i przeciwstarzeniowego in vivo i in vitro [15,55]. Jako naturalnie występujący związek fenolowy Cur wzbudził duże zainteresowanie ze względu na jego korzystny wpływ na biologię MSC [36,37,56,57]. Jednak złożone skutki ekspozycji Cur na MSC należy dokładnie rozważyć przed wdrożeniem różnych badań biomedycznych. Yang i współpracownicy stwierdzili, że wysokie stężenia Cur (50 i 100 µM) mogą wywoływać ostre efekty toksyczne w ludzkich BMSC in vitro, podczas gdy ciągła ekspozycja (7 d) na 10 µM Cur hamuje proliferację ludzkiego BMSC i indukuje apoptozę komórek [58]. Co ciekawe, inne badanie wykazało, że leczenie Cur(<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Ostatnio aktywności biologiczne Cur zostały obszernie opisane na różnych modelach in vitro lub in vivo, szczególnie w odniesieniu do modulacji biologicznych właściwości MSC. Aktywność przeciwstarzeniowa Cur była często omawiana i stwierdzono, że Cur wykazuje korzystny wpływ na starzenie się i choroby związane z wiekiem na poziomie organizmu i komórek. Jednak mechanizm leżący u podstaw jego regulacji jest skomplikowany ze względu na różne dawki i formy Cur oraz mechanizm starzenia [19]. Jako główny wewnątrzkomórkowy mechanizm degradacji cząsteczek i obrotu organelli, autofagia odgrywa główną rolę w ochronie MSC przed warunkami stresowymi i utrzymywaniu homeostazy komórkowej. Modulacja autofagii jest uważana za nową strategię poprawy funkcji MSC [59]. Zgodnie z danymi zebranymi z istotnych badań, promowanie lub tłumienie autofagii przez Cur w różnych modelach komórkowych wywiera zadowalające efekty cytoochronne [38-40].łodyga cistancheNasze dane wykazały, że zwiększona aktywność autofagiczna została zaobserwowana po ekspozycji na Cur, co zidentyfikowano poprzez zwiększenie aktywności genów związanych z autofagią (LC3, ULK1, Atg7 i Atg12), generowanie LC3-II, wzrost liczby autofagiczne wakuole i kwaśne organelle pęcherzykowe oraz znaczny spadek poziomu białka p62 (ryc. 4). Ponadto lizosom jest uważany za niezbędne organelle dla autofagii, podczas gdy w procesie starzenia MSC obserwowano rozregulowanie pH lizosomów i zmianę aktywności H plus-ATPazy (v-ATPazy) w wakuolach, co sprzyjało zakwaszeniu lizosomów i autofagii oraz przyczyniało się do na opóźnienie starzenia się MSC [60]. Yan i współpracownicy wskazali, że Cur może aktywować funkcję lizosomów mysich embrionalnych fibroblastów (MEF) i indukować autofagię, która służy jako kluczowy sygnał przeżycia [38]. Podobnie zaobserwowaliśmy, że traktowanie Cur zwiększa zakwaszenie lizosomów w cBMSC (Figura 4), co sugeruje, że Cur może być zaangażowany w aktywację funkcji lizosomów, która jest niezbędna do wzmocnienia aktywności autofagicznej.

Autofagia jest głównie mechanizmem cytoprotekcyjnym, a coraz więcej dowodów wskazuje, że właściwości przeciwstarzeniowe związków naturalnych i syntetycznych są skorelowane z modulacją autofagii [29,54,61,62]. Jednak wpływ modulacji autofagii na starzenie się MSC i odpowiadające mu mechanizmy nie zostały jeszcze w pełni ocenione i zbadane. Wstępne doniesienia wskazywały, że autofagia jest głównie mechanizmem cytoprotekcyjnym i że zwiększony poziom autofagii może opóźnić starzenie się komórek poprzez zmniejszenie akumulacji toksycznych metabolitów i przywrócenie funkcji organelli [63]. Co ciekawe, ostatnie badania wykazały również, że podczas starzenia MSC zaobserwowano zwiększoną liczbę autofagicznych wakuoli i białek związanych z autofagią (LC3-II, ATG7 i ATG12), podczas gdy hamowanie autofagii za pomocą bafilomycyny A1 i {{11 }} Wykazano, że MA zmniejsza odsetek komórek SA- -gal-dodatnich oraz ekspresję p16 i p21 [35]. Aby dalej wyjaśnić związek między autofagią indukowaną Cur i jej wpływem na starzenie się cBMSC, autofagię modulowano przez wstępne traktowanie rapamycyną lub 3-MA. Oczywiście stwierdzono, że aktywność autofagiczna jest osłabiona przez 3-MA, podczas gdy wykazano, że RAP i Cur (1 uM) znacząco wzmacniają autofagię (Figura 5). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami [5], nasze odkrycia pokazują również, że hamowanie autofagii przez 3-MA przyspieszyło starzenie się komórek w cBMSC. Prawie spójny wpływ na aktywację autofagii wywierał Cur(1uMand RAP, podczas gdy analogiczne efekty cytoprotekcyjne w W związku z tym, gdy autofagia była hamowana przez 3-MA, ochronne działanie wywierane przez Cur uległo zmniejszeniu (Figura ), co sugeruje, że autofagia indukowana przez Cur jest potencjalnym mechanizmem molekularnym łagodzenia starzenia się cBMSC (Figura 7).

W warunkach fizjologicznych autofagia występuje na poziomie podstawowym we wszystkich komórkach eukariotycznych w celu utrzymania homeostazy komórkowej. Jednak różne warunki stresowe mogą prowadzić do nieprawidłowej autofagii, która ma wpływ na los komórek, chyba że autofagia zostanie przywrócona do optymalnego poziomu [41,44,64]. Nasze dowody potwierdziły, że autofagia indukowana Cur wykazuje korzystny wpływ na regulację starzenia się cBMSC. W tym scenariuszu przed leczeniem Cur należy dokładnie rozważyć różne bodźce wywołujące stres i ustawienia zewnątrzkomórkowe. Interesujące byłoby zbadanie, czy autofagia indukowana Cur może selektywnie poprawić funkcję MSC przy określonej dawce i czasie trwania. Dodatkowo, system dostarczania kurkuminy oparty na nanotechnologii wykazał lepszą rozpuszczalność w fazie wodnej i poziomy biodostępności [65,66]; może to być obiecujące narzędzie do opóźniania i przeciwdziałania starzeniu się MSC. Odpowiedź na pytanie, czy autofagia jest głównym mechanizmem leżącym u podstaw opóźniania starzenia się MSC, nadal wymaga więcej szczegółów, które zostaną dostarczone w przyszłych badaniach.

4. Materiały i metody

4.1.Zwierzęta

Próbki szpiku kostnego pobrano od 6 zdrowych, dorosłych samic chińskich psów wiejskich (12-miesięcznych). Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Wydziałowy Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt Sichuan Agricultural University (nr zatwierdzenia 2020-0608) i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi prawa ochrony zwierząt Chińskiej Republiki Ludowej.

4.2. Przygotowanie roztworu kurkuminy

Cur (HPLC Większy lub równy 98 procent, numer CAS:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Pekin, Chiny) rozpuszczono w DMSO do stężenia 20 mmol/ L. przesączono przez organiczną mikroporowatą membranę filtracyjną 0,22 μm i przechowywano w -80 stopniu. Różne roztwory Cur przygotowano w pożywce do badań in vitro.

4.3. Hodowla i ekspansja komórek

cBMSC uzyskano ze szpiku kostnego. Komórki hodowano w kompletnej pożywce składającej się z niskoglukozowej pożywki Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Pekin, Chiny ) i 1 procent penicyliny/streptomycyny. Przy 80-90 procentowej konfluencji przylegające komórki zostały uwolnione za pomocą Trypsin Digestion Solution (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) i dalej ekspandowane w stosunku 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Curie wzrostu komórek

Aby określić zdolność proliferacyjną cBMSC w pasażach (P)3,6 i 9, komórki wysiano na płytkach z trzema 48-dołkami (2500 komórek/dołek). Po 48 godzinach inkubacji komórki uwolniono za pomocą Trypsin Digestion Solution i zliczono hemocytometrem. Procedurę liczenia komórek powtarzano co 48 godzin i utrzymywano przez 14 dni.

4.5.Wykrywanie immunofenotypu cBMSCs metodą cytometrii przepływowej

W trzecim pasażu cBMSCs przemyto PBS i trypsynizowano. Komórki (3 x 105 komórek/ml) ponownie zawieszono w buforze barwiącym, a zawiesiny komórek 100 µl） inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi fluorescencyjnie FITC, PE lub APC przeciwko antygenom powierzchniowym CD45, CD34 i ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) i niefluorescencyjnie znakowane CD31, CD90 i CD105 (Biosynthesis biotechnology Co.Ltd. Pekin, Chiny) przez 15 minut w 4 stopniach. Komórki przepłukano PBS i inkubowano ze sprzężoną z FITC kozią anty-króliczą IgG przez 15 min w 4 stopniach. Antygeny powierzchniowe wykrywano metodą cytometrii przepływowej (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania CytExpert.

4.6. Test różnicowania in vitro

cBMSC wysiano z gęstością 5 x 104 komórek/ml na płytkach 6-studzienkowych. Przy 70-80 procentach konfluencji, pełną pożywkę zastąpiono pożywką indukującą różnicowanie osteogenne lub adipogeniczne i zmieniano co 3 dni (Cvagen, Suzhou, Chiny). Odkładanie się wapnia wykryto za pomocą barwienia Alizarin Red S (Solarbio, Pekin, Chiny) po 3 tygodniach indukcji osteogennej, a akumulację kropelek lipidów zaobserwowano przy użyciu barwienia Oil Red O (Solarbio, Pekin, Chiny) po 2 tygodniach indukcji adipogenicznej.

4.7.Wpływ Cur na żywotność komórek

Żywotność komórkową cBMSC określono przy użyciu zestawu CCK-8 (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Chiny).korzyści i skutki uboczne cistanche tubulosacBMSCs wstępnie hodowano na płytce 96-studzienkowej przez 24 h. cBMSCs traktowano Cur w różnych stężeniach (0.1, 0.5, 1, 5 i 1{ {14}} umol/l) przez 12h, 24h,48h i 72h. Komórki traktowano 0,1% DMSO, który był używany jako kontrola. Po inkubacji z 10 µl roztworu CCK-8 na studzienkę przez 2 godziny, gęstość optyczną mierzono za pomocą czytnika mikropłytek przy 450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Względną żywotność komórek obliczono zgodnie z instrukcjami producenta.

4.8. Test tworzenia kolonii

Skuteczność samoodnawiania cBMSCs wykryto przy użyciu testu CFU-F） z fibroblastami tworzącymi kolonię. cBMSC wysiano 3 x 10² komórek/studzienkę） na płytkach 6-studzienkowych. Po dwóch tygodniach hodowli komórki utrwalano 4% paraformaldehydem przez 30 min i obserwowano pod mikroskopem odwróconym (LX73, Olympus Corporation, Tokio, Japonia) po wybarwieniu 1% fioletem krystalicznym przez 10 min. Dla CFU-F zliczono ponad 50 komórek. Wydajność CFU-F obliczono w następujący sposób:

Wydajność CFU-F=liczba CFU-F/liczba nasion (300 komórek)[68].

4.9. Test barwienia beta-galaktozydazą

Aktywność galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA- -gal) w cBMSC oszacowano przy użyciu zestawu do barwienia SA- -gal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta . Po wybarwieniu komórki zbadano pod mikroskopem odwróconym. Pozytywnie wybarwione komórki zliczono w celu oceny starzenia się komórek.

4.10. Odwrotna transkrypcja Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

Całkowity RNA wyekstrahowano z osadu komórkowego przy użyciu metody odczynnika Trizol. cDNA zsyntetyzowano stosując zestaw odczynników PrimeScriptTM RT z gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japonia). Startery PCR (Tabela 2) oprócz GAPDH w nawiązaniu do wcześniejszych badań [67] zaprojektowano przy użyciu oprogramowania Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) w oparciu o sekwencje cDNA. qPCR przeprowadzono przy użyciu TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Japonia) na systemie wykrywania CFX96 Touch Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Warunki reakcji były następujące: 95 stopni przez 3 0 s, a następnie 39 cykli 95 stopni przez 5 sekund i 60 stopni przez 30 sekund. Analizę krzywej topnienia prowadzono zaczynając od 95 stopni przez 10 s, następnie w zakresie od 65 do 95 stopni, zwiększając się o 0,5 stopnia w każdym cyklu. GAPDH zastosowano jako kontrolę wewnętrzną w celu normalizacji wszystkich danych, a względną ekspresję obliczono metodą porównawczego progu cyklu (Ct).

4.11. Śledzenie luzosomalnego interfejsu użytkownika przy użyciu LysoTracker

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) zastosowano do śledzenia lizosomów, które mogą wykazywać zwiększoną intensywność fluorescencji po zakwaszeniu lizosomów. Zaszczepiliśmy cBMSC na płytkach z 12-studzienkami i traktowaliśmy je Cur przez 24 godziny, a następnie komórki traktowano Lyso-Tracker (60 nM) i Hoechst 33,342 (2 ug/ml) przez 20 min. Fluorescencję obserwowano przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego po przemyciu PBS.

4.12. Immunofluorescencja

cBMSCs (2x104 komórki/szkiełko) wysiano na szkiełka i utrwalono 4% paraformaldehydem przez 30 min. Po wspólnej inkubacji z 0,5% Triton X-100 przez 5 min (Solarbio, Pekin, Chiny), skrawki zanurzono w roztworze blokującym na 30 min. Zamknięty płyn usunięto, a komórki inkubowano z przeciwciałami anty-LC3B (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) przez noc w 4 stopniach, a następnie inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi skoniugowanymi z fluorochromem (Abcam, Cambridge, MA, USA) przez 50 min w 37°C. Na koniec komórki wybarwiono kontrastowo DAPI (Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny) i monitorowano pod mikroskopem konfokalnym.

4.13. Analiza Western Blotting

Próbki komórek poddano lizie z lizatem tkanek i komórek (Solarbio, Pekin, Chiny) zawierającym inhibitor proteazy po przemyciu lodowatym PBS. Lizaty komórkowe zawierające 15 μg białka na próbkę załadowano na żele sodowo-dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowe (SDS-PA) (Solarbio, Pekin, Chiny) i rozdzielono przez elektroforezę. Po przeniesieniu białek na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF), tę ostatnią blokowano niespecyficznie za pomocą 5% odtłuszczonego mleka w proszku (Solarbio, Pekin, Chiny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Błony inkubowano przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anty-p62/SQSTM1 (1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA ) i przeciw - -aktynie (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) w 4 stopniach, a bloty przemyto TBST (Solarbio, Pekin, Chiny) przed inkubacją z przeciwciałem drugorzędowym (1 : 2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) w 37 stopniach przez 1 godz. Następnie membrany opracowano przez wystawienie na działanie odczynników chemiluminescencyjnych (Millipore, Billerica, MA, USA) i zwizualizowano za pomocą systemów obrazowania ChemiDocTM (Tanon -5200, Szanghaj, Chiny). Gęstość prążków oznaczono ilościowo przy użyciu oprogramowania Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) dla każdej grupy i znormalizowano za pomocą β-aktyny.

4.14. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

Osad komórek trawiono i zbierano do 1,5 ml probówki do wirowania, a następnie utrwalano 2,5% aldehydem glutarowym (Solarbio, Pekin, Chiny) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Próbki utrwalano 1% czterotlenkiem osmu przez 1 godzinę po przemyciu PBS, następnie stopniowo zwiększaliśmy odwodnienie w roztworach acetonu i zanurzaliśmy je w 812 żywicy epoksydowej (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Pekin, Chiny). Następnie z ultramikrotomu (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Niemcy) otrzymano skrawki 50 nm. Skrawki barwiono octanem uranylu (Zhongjingkevi, Pekin, Chiny) przez 10-15 min i cytrynianem ołowiu (Zhongjingkei, Pekin, Chiny) przez 2 min. Wszystkie okazy oglądano na TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokio, Japonia).

4.15. Analiza statystyczna

Wyniki uzyskano z trzech niezależnych eksperymentów, a wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (SD). Wartości statystyczne zostały przeanalizowane przy użyciu IBM SPSs Statistics 25 i zilustrowane przy użyciu GraphPad Prism 9. 0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Różnice istotne statystycznie określono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu t-Studenta. wartości p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Wnioski

Nasze odkrycia rzucają światło na związek między Cur, starzeniem się cBMSC i autofagią. Dane z naszego badania sugerują, że Cur może złagodzić stan starzenia cBMSC, jednocześnie aktywując autofagię i promując zakwaszenie lizosomów. Co więcej, dalsze dowody wykazały, że autofagia indukowana Cur jest potencjalnym mechanizmem łagodzenia starzenia się cBMSC. Cur może być obiecującym aktywatorem i konserwatorem do poprawy funkcji MSC. Naszym zdaniem nie można lekceważyć pozytywnego wpływu Cur na starzenie się. Przyszłe badania powinny koncentrować się na wpływie regulacji Cur na los MSC w celu zwiększenia potencjału terapeutycznego MSC w różnych chorobach, takich jak uszkodzenia tkanek oraz choroby zwyrodnieniowe i zapalne.

Ten artykuł pochodzi z Int. J. Mol. Nauka. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms