Wrażliwa na wiek skuteczność ograniczenia kalorii w biogenezie mitochondriów i uszkodzeniu MtDNA w wątrobie szczura

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

Abstrakcyjny:Ograniczenie kalorii (CR) jest najskuteczniejszym sposobem opóźniania wystąpienia zmian związanych z wiekiem, takich jak dysfunkcja mitochondriów. Jednak wrażliwość markerów mitochondrialnych na CR i związane z wiekiem granice skuteczności CR nie są w pełni wyjaśnione. Użyliśmy próbek wątroby od szczurów karmionych ad libitum (AL), podzielonych na: 18-miesięczne (AL-18), 28-miesięczne (AL-28) , i 32-grupy w wieku miesiąca (AL-32) oraz z leczonych na CR (CR) 28-miesięcy (CR-28) i 32- miesięczne odpowiedniki (CR-32) w celu zbadania wpływu CR na kilka markerów mitochondrialnych. Związane z wiekiem spadki aktywności syntazy cytrynianowej, ilości białka TFAM, MFN2 i DRP1 oraz zawartości mtDNA w grupie AL-28 były zapobiegane w odpowiednikach CR-28. W związku z tym CR zmniejszył uszkodzenie oksydacyjne mtDNA oszacowane na podstawie częstości występowania utlenionych puryn w określonych regionach mtDNA u zwierząt CR-28. Te odkrycia potwierdzają przeciwstarzeniowy efekt CR do 28 miesięcy. Odwrotnie, ilości białka LonP1, Cyt c, OGG1 i APE1 oraz zawartość delecji mtDNA 4,8 Kb nie uległy zmianie u szczurów CR-28. Brak istotnych różnic między wartościami AL-32 a odpowiednikami CR-32 sugeruje granicę skuteczności CR w tym wieku związaną z wiekiem.purytanie witamina cJednak to tylko częściowo ogranicza korzyści CR w przeciwdziałaniu uogólnionemu spadkowi starzenia i powiązanemu zaangażowaniu mitochondriów.

Słowa kluczowe:wątroba szczura; starzenie się; ograniczenie kalorii; biogeneza mitochondrialna; uszkodzenie mtDNA; wrażliwa na wiek skuteczność CR

KSL21

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

1. Wstęp

Zgodnie z imponującym postępem badań nad procesem starzenia się, utworzono sekwencyjnie kilka różnych definicji tego procesu, a zestaw ścieżek i mediatorów zidentyfikowano jako tzw. cechy charakterystyczne starzenia [1,2]. Wśród nich kluczowymi czynnikami okazały się dysfunkcja mitochondriów, stres oksydacyjny i molekularne uszkodzenia mitochondriów. Ważną cechą starzenia się jest specyficzność tkankowa, która została podkreślona pod kątem zaangażowania mitochondriów [3,4], zmian epigenetycznych [5] i innych zmian, takich jak długość telomerów [6]. Spośród różnych metod leczenia mających na celu zapobieganie lub opóźnianie wystąpienia zmian związanych z wiekiem, ograniczenie kalorii (CR) jest najstarszą proponowaną strategią [7] i nadal stanowi złoty standard dla bardzo dużej liczby korzystnych skutków tej interwencji. Rzeczywiście, ostatnie badania nad mechanizmami molekularnymi wywołanymi przez CR wykazały, że ta interwencja żywieniowa [8-10] pozytywnie wpływa na kilka szlaków.sistancheCo więcej, odkrycia te również silnie potwierdzają istnienie „plastyczności” starzenia [5,9,11,12], która może być modulowana przez interakcje środowiskowe, takie jak interwencje żywieniowe lub farmaceutyczne lub nawyki związane ze stylem życia. Wykazano już, że CR przeciwdziała związanym z wiekiem zmianom biogenezy i metabolizmu mitochondriów w kilku tkankach szczurów z efektami specyficznymi dla tkanki [3,13,14]. Dokładniej, poprzednie badania naszej grupy na wątrobie szczura, która jest głęboko dotknięta starzeniem się na poziomie mitochondrialnym, badanie markerów organellarnych wykazało pozytywny wpływ CR na zmiany mitochondrialne związane z wiekiem. W rzeczywistości, u starszych 28-miesięcznych szczurów leczonych CR, zawartość mitochondrialnego DNA (mtDNA), ilość białek zaangażowanych w biogenezę mitochondriów lub wrażliwych na ROS oraz stopień wiązania mitochondrialnego czynnika transkrypcyjnego A (TFAM) w określonych regionach mtDNA prezentowały wartości znacznie różniące się od tych u odpowiedników dopasowanych wiekowo karmionych ad libitum (AL) i nie różniące się statystycznie od tych u młodszych 18-miesięcznych zwierząt karmionych AL [15]. Niedawno analiza biogenezy mitochondriów i uszkodzeń mtDNA w wątrobie u szczurów w wieku AL (28-miesięcznych) i bardzo starych (32-miesięcznych) pozwoliła nam zbadać różnorodną macierz parametrów mitochondrialnych i sugerować inne tempo starzenia się w zależności od zaangażowania mitochondriów u nielicznych zwierząt naturalnie osiągających długowieczność w stosunku do większości starzejących się [16,17]. Mając te przesłanki, chcieliśmy ocenić skuteczność CR na dużym zestawie markerów mitochondrialnych w różnym wieku w wątrobie szczura. Do tych celów wykorzystaliśmy zwierzęta z bardzo długowiecznego hybrydowego szczepu Fischer 344× Brown Norway, z którego jako kontrole wybrano 18-miesięczne szczury karmione ad libitum (AL-18). do porównania ze zwierzętami karmionymi ad libitum, w wieku (AL-28) i skrajnie starymi (AL-32) oraz odpowiednikami w odpowiednim wieku poddanymi leczeniu CR (CR-28 i CR{ {39}}). W tych grupach szczurów ocenialiśmy: Aktywność mitochondrialnego enzymu syntazy cytrynianu, ekspresję zestawu białek, w tym TFAM, proteazy Lon (LonP1) i cytochromu c(Cyt c), enzymów naprawczych mtDNA 8- glikozylaza okso DNA/liaza apurynowa lub apirymidynowa (AP) (OGG1) i endonukleaza apurynowa/apirymidynowa 1 (APE1) oraz białka dynamiki mitochondrialnej mitofuzyna 2 (MFN2) i białko związane z dynaminą 1 (DRP1). Na koniec określono również zawartość mtDNA i uszkodzenia oksydacyjne w określonych regionach.

2. Wyniki

2.1.Ocena wpływu wieku i CR na markery funkcjonalności mitochondriów

Aktywność syntazy cytrynianowej, która jest również markerem masy mitochondrialnej, została określona we wszystkich pięciu grupach szczurów w celu oceny wrażliwości funkcji mitochondriów na starzenie się i CR (ryc. 1).

Związany z wiekiem, statystycznie istotny spadek aktywności syntazy cytrynianowej zaobserwowano u szczurów AL-28(-41 procent ) i AL-32(-40 procent ) w porównaniu ze szczurami AL{{ 5}} kontrola wieku. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy między grupami AL-28 i AL-32. Efekt CR wykazano przez znacznie wyższą (+ 40%) aktywność enzymatyczną u szczurów CR-28 w porównaniu z wartością AL-28 szczura w tym samym wieku. Ponadto aktywność CR-28 była podobna do obserwowanej u młodszych szczurów kontrolnych AL-18 (Figura 1). Efekt ten został natomiast osłabiony u zwierząt CR-32. W rzeczywistości w starszym wieku 32 miesięcy nie można było zaobserwować różnic statystycznych między grupami AL i CR.

KSL22

cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Aby pogłębić analizę wpływu wieku i CR na funkcjonalność mitochondriów, w mitochondriach izolowanych ze wszystkich grup szczurów oznaczono ilość białka TFAM i LonP1 metodą Western blot, w której jako wewnętrzna kontrola obciążenia (rysunek 2).

Rycina 2. Ilości białek TFAM i LonP1 w izolowanych mitochondriach wątroby z AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 i CR-32-miesiąc -stare szczury. (A). Ilości białka TFAM w izolowanych mitochondriach wątroby z różnych grup szczurów. We wstawce przeprowadzono reprezentatywny Western blot na jednym szczurze z każdej z badanych grup. Pasma immunoreaktywne, od góry do dołu, reprezentują odpowiednio sygnały z TFAM i VDAC. Histogram przedstawia ocenę ilościową intensywności prążków TFAM, znormalizowanych do intensywności ilości białka VDAC.(B).LonP1 w izolowanych mitochondriach wątroby z różnych grup szczurów. We wstawce przeprowadzono reprezentatywny Western blot na jednym szczurze z każdej z badanych grup. Od góry do dołu prążki immunoreaktywne reprezentują odpowiednio sygnały z LonP1 i VDAC.co to jest cistanche?Histogram pokazuje kwantyfikację intensywności prążków LonP1, znormalizowanych do intensywności VDAC. (A, B)Dane reprezentują wyniki z potrójnych eksperymentów Western blot i zostały przeanalizowane przy użyciu testu jednokierunkowej ANOVA i testu wielokrotnego porównania Tukeya . Słupki reprezentują wartości średnie i SD dla pięciu grup eksperymentalnych. Dane znormalizowano względem wartości dla szczurów AL-18, ustalonej jako 1.*p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

KSL23

Aby ocenić wpływ starzenia i CR na inną funkcję metaboliczną mitochondriów, która jest inicjacją mitochondrialnego wewnętrznego szlaku apoptotycznego, określiliśmy, za pomocą eksperymentów Western blot, wewnątrzmitochondrialną ilość Cyt c (ryc. 3).

Rycina 3. Ilości białka Cyt c w izolowanych mitochondriach wątroby z AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 i CR-32-miesiąc- stare szczury. We wstawce przeprowadzono reprezentatywny Western blot na jednym szczurze z każdej z badanych grup. Od góry do dołu prążki immunoreaktywne reprezentują odpowiednio sygnały z Cyt c i VDAC. Histogram przedstawia kwantyfikację intensywności prążków Cytc znormalizowanych do intensywności VDAC. Wszystkie dane reprezentowały wyniki z potrójnych eksperymentów Western blot i były analizowane przy użyciu testu jednokierunkowej ANOVA i testu wielokrotnego porównania Tukey'a. Słupki reprezentują wartości średnie i SD dla pięciu grup eksperymentalnych. Dane znormalizowano względem wartości dla szczurów AL-18, ustalonej jako 1.* p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">Cistanche przeciw starzeniuEfekt CR nie był w ogóle istotny, ponieważ nie było znaczących różnic w ilościach białka Cyt c pomiędzy dobranymi wiekowo grupami AL i CR w 28, a także w 32 miesiącu. Związany z wiekiem spadek ilości Cyt c w dwóch grupach wykazał trend podobny do obserwowanego w grupach AL-28 i AL-32 z bardziej odpowiednim spadkiem liczby zwierząt CR-28 częściowo zapobiegany u starszych szczurów CR-32.

2.2.Ocena wpływu wieku i CR na enzymy naprawy mtDNA

Ponieważ wykazano, że starzenie się jest w dużej mierze związane z akumulacją uszkodzeń mtDNA, zmierzyliśmy, za pomocą eksperymentów Western blot, w izolowanych mitochondriach wątroby ekspresję dwóch głównych enzymów naprawczych mtDNA, a mianowicie 8-okso-DNA glikozylazy/apurinowego lub liaza apirymidynowa (AP) (OGG1) i endonukleaza apurynowa/apirymidynowa 1 (APE1), oba zaangażowane w naprawę przez wycięcie zasady (BER), która jest dominującym mechanizmem naprawy mtDNA (Figura 4).

Rysunek 4. Ilości białek OGG1 i APE1 w izolowanych mitochondriach wątroby z AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 i CR-32-miesiąc -stare szczury. (A). We wstawce przeprowadzono reprezentatywny Western blot na jednym szczurze z każdej z badanych grup. Pasma immunoreaktywne, od góry do dołu, reprezentują odpowiednio sygnały z OGG1 i VDAC. Histogram przedstawia ilościowe oznaczenie intensywności prążków OGG1 znormalizowanych do intensywności VDAC.(B). We wstawce reprezentatywny Western blot przeprowadzono na jednym szczurze z każdej z badanych grup.cistanche beneficiosOd góry do dołu prążki immunoreaktywne reprezentują odpowiednio sygnały z APE1 i VDAC. Histogram przedstawia kwantyfikację intensywności prążków APE1 znormalizowanych do intensywności VDAC. (A, B) Dane reprezentowały wyniki z potrójnych eksperymentów Western blot i zostały przeanalizowane przy użyciu jednokierunkowego testu ANOVA i testu wielokrotnego porównania Tukey'a. Słupki reprezentują wartości średnie i SD dla pięciu grup eksperymentalnych. Dane znormalizowano względem wartości dla szczurów AL-18, ustalonej jako 1. n: Liczba analizowanych zwierząt.

KSL24

Wewnątrzmitochondrialne ilości białka obu enzymów wykazywały podobne trendy jak w przypadku wieku i efektów CR. W szczególności, OGG1 i APE1 nie wykazały żadnych statystycznie istotnych zmian związanych z wiekiem w obu grupach AL i CR, co sugeruje brak wpływu wieku. Nieoczekiwanie, CR również nie wywoływał żadnego znaczącego wpływu na ilości OGG1 i APE1 w grupie CR-28 w porównaniu ze zwierzętami AL dobranymi pod względem wieku, jak również między grupami 32-miesięcznymi.

2.3. Ocena wpływu wieku i CR na dynamikę mitochondriów

Po wcześniejszym zgłoszeniu wyraźnego wpływu wieku na ekspresję białek zaangażowanych w fuzję (MFN2) i rozszczepienie (DRP1)[16], oceniliśmy tutaj wpływ CR w długim okresie czasu na te markery. W związku z tym ilości białka MFN2 i DRP1 określono za pomocą eksperymentów Western blot w izolowanych mitochondriach wątroby ze wszystkich grup szczurów (Figura 5).

Rysunek 5. Ilości białek MFN2 i DRP1 w izolowanych mitochondriach wątroby z AL-18, AL-28, CR-28, AL-32 i CR-32-miesiąc -stare szczury. (A). We wstawce przeprowadzono reprezentatywny Western blot na jednym szczurze z każdej z badanych grup. Od góry do dołu prążki immunoreaktywne reprezentują odpowiednio sygnały z MFN2 i VDAC. Histogram przedstawia kwantyfikację intensywności prążków MFN2 znormalizowanych do intensywności VDAC.(B). We wstawce przeprowadzono reprezentatywny Western blot na jednym szczurze z każdej z badanych grup. Pasma immunoreaktywne, od góry do dołu, reprezentują odpowiednio sygnały z DRP1 i VDAC. Histogram przedstawia kwantyfikację intensywności prążków DRP1 znormalizowanych do intensywności VDAC. (A, B) Dane reprezentują wyniki z potrójnych eksperymentów Western blot i zostały przeanalizowane przy użyciu testu jednokierunkowej ANOVA i testu wielokrotnego porównania Tukeya. Słupki reprezentują wartości średnie i SD dla pięciu grup eksperymentalnych. Dane znormalizowano względem wartości dla szczurów AL-18, ustalonej jako 1. *p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

Odkryliśmy statystycznie istotny spadek (-43 procent) MFN2 związany z wiekiem u szczurów AL-28 w porównaniu z grupą kontrolną AL-18. Takiemu spadkowi zapobiegło się u szczurów AL-32 wykazujących złożony efekt wieku, podobny do obserwowanego dla Cyt c. Jednak w odróżnieniu od Cyt c, CR miał bardzo pozytywny wpływ na 28-miesięczne zwierzęta, zapobiegając u szczurów CR-28 związanemu z wiekiem spadkowi liczby AL-28 zwierząt i co prowadzi do znacznego wyraźnego wzrostu (plus 52 procent) w MFN2 w porównaniu z odpowiednikiem AL w podobnym wieku. Ponadto ilość MFN2 u szczurów CR-28 nie różniła się od wartości w kontrolach AL-18, co wskazuje na skuteczne zapobieganie efektowi związanemu z wiekiem. Nie stwierdzono istotnej różnicy między grupami AL-32 i CR-32, co wskazuje na ograniczony wpływ CR u najstarszych zwierząt. Ponadto w grupie AL-32 nie stwierdzono żadnego efektu związanego z wiekiem dla MFN2 w porównaniu z odpowiednikiem AL-18. Podobnie ilości białka DRP1 wykazały znaczny spadek związany z wiekiem (-49 procent) u szczurów AL-28 w porównaniu z grupą AL-18, któremu zapobiegało CR w {{29 }} miesięcznych zwierząt. Rzeczywiście, grupa CR-28 wykazała dodatnią różnicę (plus 50 procent) w porównaniu z grupą AL-28, wykazując silny efekt CR. Jednakże brak różnicy między AL-32 i CR-32, jak w przypadku ilości białka DRP1 dalej wskazywał na ograniczoną skuteczność CR w przedłużonym starzeniu. Ponownie, nie było widocznego efektu wieku również dla kwot DRP1 przechodzących z grupy AL-18 do AL-32. Następnie wyznaczono wartości wskaźnika fuzji (FI jako stosunek MFN2/DRP1 dla każdego z badanych szczurów (Rysunek 6).

Wartości FI w grupie AL{{0}} obejmowały wąski zakres od 1,37 do 2,64, podczas gdy w grupie AL-28 wszystkie wartości były wyższe w zakresie od 2,20 do 8,24 . Wartości FI grupy CR{{10}} mieściły się w zakresie od 0,99 do 5,14 i były dość podobne do wartości szczurów AL-18. U zwierząt AL-32 wartości FI mieściły się w zakresie od 0,70 do 2,27, obejmując w ten sposób przedział podobny do tego dla grupy AL-18, co sugeruje brak wyraźnego efektu wieku. W grupie CR-32 wartości FI wahały się od 0,87 do 2,02 i były porównywalne z wartościami zwierząt AL-32, co potwierdza pogląd, że wydłużone starzenie się (32 miesiące) może być mniej wrażliwe na CR niż starzenie się (28 miesięcy).

Analizę statystyczną wartości FI ze wszystkich grup przedstawiono na rysunku 7. W porównaniu między grupami AL-18 i AL-28 wyższa wartość FI tej ostatniej wskazywała na związaną z wiekiem zmianę równowaga dynamiczna. Jeśli chodzi o szczury leczone CR, wartość grupy CR-28 nie różniła się od wartości odpowiednika AL-18 i potwierdzała skuteczność diety w porównaniu z odpowiednikami karmionymi AL w tym samym wieku . Analiza wartości AL-32 i CR-32 FI wykazała brak znaczącej różnicy między nimi, co wzmacnia ideę zmniejszonej skuteczności diety u zwierząt naturalnie osiągających wydłużone starzenie. Ponadto wartości FI obu 32-grup w wieku miesiąca nie różniły się od odpowiednika AL-18, co potwierdza brak wyraźnego efektu wieku u najstarszych zwierząt.