Wykrywanie i charakterystyka nanocząstek mineraloorganicznych w ludzkich nerkach

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng- Yeu Wu^1,2,3,* i inni

Zwapnienie ektopowe jest związane z różnymi chorobami człowieka, m.in. miażdżycą, rakiem,chronicznynerkachoroba, orazcukrzycamellitus. Chociaż nanocząsteczki mineralne wykryto w zwapniałych naczyniach krwionośnych, natura i rola tych cząsteczek w ludzkim ciele pozostaje niejasna. Tutaj po raz pierwszy pokazujemy, że człowieknerkatkanki uzyskane ze schyłkowej fazychronicznynerkachorobalub pacjenci z rakiem nerki zawierają okrągłe, wielowarstwowe cząstki mineralne o długości od 50 do 1500 nm, podczas gdy u zdrowych osób kontrolnych nie obserwuje się żadnych cząstek. Cząstki mineralne znajdują się głównie w macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej zwinięte kanaliki, przewodach zbiorczych i pętlach Henlego, a także w cytoplazmie komórek wytyczających kanaliki i składają się z polikrystalicznego fosforanu wapnia, podobnego do minerału występującego w kościach i zwapnieniach ektopowych. ThenerkaNanocząsteczki mineralne zawierają kilka białek surowicy, które hamują ektopowe zwapnienie w płynach ustrojowych, w tym albuminę, fetuinę A i apolipoproteinę A1. Ponieważ nanocząsteczki mineralno-organiczne znajdują się nie tylko w zwapniałych osadach, ale także w obszarach pozbawionych mikroskopijnych zwapnień, nasze obserwacje wskazują, że nanocząsteczki mogą być prekursorami zwapnień i kamieni nerkowych u ludzi.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zwapnienie ektopowe jest związane z miażdżycą, rakiem,chronicznynerkachorobaoraz cukrzyca1–3. Ostatnie badania wskazują, że miażdżyca ichronicznynerkachorobapacjenci z objawami zwapnienia naczyń wykazują zwiększone ryzyko zachorowalności i śmiertelności, co sugeruje, że zwapnienie pozamaciczne jest szkodliwe dla zdrowia ludzkiego1,3. Niepożądane zwapnienia obserwuje się również u osób starzejących się, a większość osób w wieku powyżej 60 lat wykazuje oznaki zwapnienia naczyń4. Z tych powodów ważne jest odszyfrowanie czynników wywołujących zwapnienie pozamaciczne i opracowanie skutecznego leczenia.

Ektopowe zwapnienie można zdefiniować jako brak równowagi między inhibitorami i induktorami zwapnienia w organizmie. Inhibitory zwapnienia obejmują białka surowicy, takie jak albumina, fetuina-A, osteopontyna i białko macierzy GLA, a także małe związki, takie jak pirofosforan, podczas gdy hiperfosfatemia i stan zapalny są głównymi induktorami zwapnienia5-7. Ostatnie badania wskazują, że induktory zwapnienia aktywują proces komórkowy podobny do tworzenia kości podczas zwapnienia naczyń7,8. Pęcherzyki macierzy podobne do tych, które indukują mineralizację w rozwijających się kościach, wykryto również w zwapniałych tkankach miękkich7–9. Te pęcherzyki macierzy są prawdopodobnie uwalniane przez komórki mięśni gładkich naczyń, które różnicują się w komórki podobne do osteoblastów, które indukują zwapnienie7.

Nanocząsteczki mineralne (NP) wykryto w tkankach miękkich wykazujących oznaki zwapnienia ektopowego. Cena i in. odkryli, że surowica szczurów leczonych bisfosfonianem etidronianem lub witaminą D zawiera kompleksy mineralno-białkowe zawierające inhibitory zwapnienia fetuinę-A i białko macierzy GLA10,11. Podobnie Jahnen-Dechent i in. zaobserwowali, że w płynie puchlinowym u pacjentów z wapniejącym zapaleniem otrzewnej można było wykryć kompleksy mineralne zawierające fetuinę-A, które nazwano cząstkami kalcyproteiny (CPPs). Ostatnie badanie przeprowadzone przez Bertazzo i in. wykazali obecność mineralnych NP w zastawkach aortalnych i tętnicach wieńcowych zarówno u pacjentów z miażdżycą, jak i gorączką reumatyczną13. Podczas gdy badania nad powstawaniem cząstek mineralnych koncentrowały się zwykle na układzie sercowo-naczyniowym człowieka, pozostaje niejasne, czy cząstki można znaleźć w innych tkankach i czy te jednostki odgrywają rolę w zdrowiu lub chorobie.

Zaobserwowaliśmy wcześniej, że minerały-organiczne NPS tworzą się spontanicznie w płynach ustrojowych ludzi i zwierząt14–28. Te mineralne NP zostały początkowo opisane jako nanobakterie (NB) i uważano, że są nie tylko najmniejszymi komórkami na ziemi29, ale także możliwą zakaźną przyczyną wielu chorób, w tym choroby Alzheimera, miażdżycy, raka,nerkazłógformacja, policystycznanerkachorobai zapalenie gruczołu krokowego30–32. Jednak nasze wyniki wykazały, że NB to w rzeczywistości nieożywione mineralne NP, które naśladują pospolite bakterie pod względem ich morfologii, wzrostu, proliferacji i subkultury15,18,22. Pozostaje do zbadania możliwość, że cząstki mineralne podobne do tzw. NB można znaleźć w tkankach ludzkich i czy cząstki te odgrywają rolę w chorobie.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy podejście nanomateriałowe do wykrywania i analizy minerałów-organicznych NP u chorego człowiekanerkatkanki. Pokazujemy, że tkanki nerek pacjentów ze schyłkową przewlekłą chorobą nerek i rakiem nerki zawierają wielowarstwowe mineralne NP podobne do biomimetycznych cząstek mineralnych, które spontanicznie wytrącają się w płynach ustrojowych in vitro. Nasze wyniki ujawniają krytyczne spostrzeżenia dotyczące składu biochemicznego, mechanizmu powstawania i funkcji biologicznej tych minerałów-cząstek organicznych i rzucają światło na mechanizmy wapnienia ektopowego i inicjacji chorób w organizmie człowieka.

Wyniki

Zbadaliśmy tkanki nerki usunięte chirurgicznie od pacjentów ze schyłkową przewlekłą chorobą nerek (n=2) lub rakiem nerki (n=18; patrz Tabela 1; w przypadku próbek raka nerki skupiliśmy się na -rakowa część tkanki). Jako zdrowa grupa kontrolna przebadaliśmy biopsje nerki uzyskane od pacjentów z urazem lub krwiakiem, ale u których wcześniej nie występowała nieprawidłowa czynność nerek (n=2; Tabela 1).

Tkanki nerki zdrowych osobników wykazywały normalne cechy histologiczne, a po barwieniu metodą von Kossy nie zaobserwowano zwapnienia ektopowego (ryc. 1A, B). Z drugiej strony, tkanki nerek uzyskane od chorych osób i wybarwione hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazywały oznaki uszkodzenia tkanki (ryc. 2A-C, wskazane strzałkami), a 80 procent zbadanych chorych tkanek wykazywało zmineralizowane złogi, jak ujawniono przez barwienie von Kossy (ryc. 1C–T, ryc. 2E, F, zwapnienie jest widoczne jako czarny materiał oznaczony czarnymi strzałkami; patrz także tabela 1). Zwapnienia zauważono w korze i rdzeniu, w tym w przestrzeni zewnątrzkomórkowej otaczającej dystalne kanaliki kręte, proksymalne kanaliki kręte, kanaliki zbiorcze i pętle Henlego oraz cytoplazmę komórek wyznaczających kanaliki i kanaliki (ryc. 1C-T i ryc. 2E, F). W krwinkach nerkowych nie wykryto zwapnień (ryc. 2D).

Aby zbadać naturę osadów mineralnych, przygotowaliśmy ultracienkie skrawki nerki do obserwacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). W próbkach zawierających mikroskopijne złogi mineralne wykryto cząstki lub granulki mineralne w cytoplazmie komórek nabłonka nerki, w macierzy pozakomórkowej pod błoną podstawną oraz w świetle kanalików krętych proksymalnych i dystalnych (ryc. 3A, B, cząstki są powiększone w panelach A1–A4 i B1–B4). Mineralne NP obserwowano również w komórkach wyściełających pętle Henlego i przewodów zbiorczych (ryc. 3C, D, powiększone w panelach C1, C2 i D1). Niektóre cząstki znaleziono w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych w komórkach nerki (ryc. 3A, panele A1 i A2). Zastosowane tutaj podejście mikroskopii elektronowej pozwoliło nam również na wizualizację wnętrza cząstek mineralnych; niektóre cząstki zawierały gęste elektronowo pierścienie naprzemiennie z lekkimi, przepuszczającymi elektrony warstwami (ryc. 3A, panele A3 i A4, ryc. 3C, panel C1). Kilka naczyń krwionośnych, takich jak vasa recta (proste tętnice nerkowe), otacza nas duża liczba mineralnych NP (ryc. 3D, panel D1). Mineralne NP zostały zatem znalezione w różnych miejscach we wszystkich ludzkich tkankach nerek wykazujących oznaki zwapnienia ektopowego, podczas gdy w badanych zdrowych kontrolach nie znaleziono żadnych cząstek.

Cząsteczki mineralne znalezione w tkankach nerek wydają się być bardzo podobne do opisanych w naszych poprzednich badaniach mineraloorganicznych NP tworzących się spontanicznie w płynach ustrojowych15,17 (które nazwaliśmy bionami24). Aby zweryfikować tę możliwość, przygotowaliśmy mineralne organiczne NP (lub biony) przy użyciu metody strącania, jak opisano wcześniej15. Metoda ta polega na dodaniu wytrącających się jonów, takich jak wapń i fosforan, do pożywki do hodowli komórek (pożywka Eagle'a w modyfikacji Dulbecco lub DMEM) zawierającej płyn ustrojowy, taki jak ludzka surowica (HS), a następnie inkubacja w warunkach hodowli komórkowej (patrz Metody). Wytworzone w ten sposób cząstki (HS-NPS) były kuliste lub elipsoidalne i wykazywały gładką lub krystaliczną powierzchnię mineralną (ryc. 4A–E), podobną do cząstek opisanych wcześniej w płynach ustrojowych22,23 oraz w wodobrzuszu u ludzi12 i zwapnione tętnice13. Cząstki mineralne były bardzo podobne do mineralnych NP lub granulek obserwowanych w tkankach nerek pod względem ich ogólnej morfologii, struktury wielowarstwowej i właściwości powierzchni (ryc. 4F-J). Wielkość cząstek pochodzących z HS i granulek nerkowych również była porównywalna, wahając się od 50 do 1500 nm średnicy (ryc. 4A-E, F-J). Jak zauważono powyżej, niektóre granulki nerkowe były otoczone błoną lipidową, prawdopodobnie reprezentującą wewnątrzkomórkowe pęcherzyki ładunkowe lub pęcherzyki błony zewnątrzkomórkowej (ryc. 4H, I, błony oznaczono strzałkami); takich błoniastych struktur nie było w próbkach HS-NP przygotowanych in vitro (ryc. 4A–E). Obserwacje te sugerują, że granulki nerkowe są podobne do mineralo-organicznych NP zgromadzonych w surowicy.

Stosując analizę dyfrakcji elektronów na wybranym obszarze, zaobserwowaliśmy, że faza mineralna HS-NP przygotowanych in vitro składała się z nanomateriału polikrystalicznego (rys. 4E, wstawka; zwróć uwagę na słabe koncentryczne pierścienie). Podobne wyniki uzyskano dla ziarnistości nerkowych (ryc. 4J, wstawka) oraz kości i zwapnień ektopowych, jak opisano we wcześniejszych badaniach33,35.

Zbadaliśmy skład chemiczny HS-NP i granulek nerkowych za pomocą spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX). HS-NP wykazywały główne piki węgla (C), wapnia (Ca), tlenu (O) i fosforu (P) (ryc. 4K), zgodne z obecnością minerału fosforanu wapnia. Niski pik krzemu (Si) odnotowano również w HS-NP (ryc. 4K), prawdopodobnie reprezentujący drobny składnik cząsteczkowy. Granulki nerkowe również wykazywały piki węgla, wapnia, tlenu i fosforu, wskazujące na mineralny fosforan wapnia, wraz z dodatkowymi pikami krzemu i żelaza (Fe) (ryc. 4L). Piki uranu (U) przypisano octanowi uranylu stosowanemu jako odczynnik kontrastujący podczas przygotowywania próbki (obecność uranu w niektórych próbkach cząstek mineralnych, takich jak granulki nerkowe, i jego brak w tkance kontrolnej na ryc. 4M można przypisać wysokiej powinowactwo uranu do fosforanu, jak opisano wcześniej35). Widma kontrolne EDX tkanki nerek otaczającej cząstki wykazały piki węgla i tlenu (ryc. 4M), co sugeruje, że wapń i fosfor znaleziono głównie w cząstkach mineralnych.

Stosunki wapń: fosfor (Ca:P) w HS-NP i granulkach nerkowych wahały się od 0,65 do 1,18. Te stosunki różnią się od wartości teoretycznej 1,67 obserwowanej dla stechiometrycznego hydroksyapatytu, ale nadal mieszczą się w zakresie obserwowanym wcześniej dla kryształów fosforanu wapnia i apatytu obserwowanych przy różnych stopniach krystalizacji15. Razem odkrycia te potwierdzają, że granulki nerkowe składają się z nanocząsteczek fosforanu wapnia.

Stwierdzono, że różne białka hamują ektopowe zwapnienie w organizmie w sposób ogólnoustrojowy36,37. Ponadto uważa się, że korona białkowa znajdująca się na powierzchni syntetycznych nanocząsteczek determinuje biodystrybucję i wpływ cząstek na komórki in vivo38,39. Z drugiej strony, skład białkowy mineraloorganicznych nanocząsteczek występujących w tkankach ludzkiej nerki pozostaje nie do końca poznany. Wcześniej stwierdziliśmy, że albumina, fetuina-A i apolipoproteina-A1 (apo-A1) są głównymi białkami oddziałującymi z mineraloorganicznymi nanocząsteczkami powstającymi w płynach ustrojowych17,20. Tutaj zastosowaliśmy znakowanie immunogoldem, aby zbadać obecność i ultrastrukturalną lokalizację tych białek w ziarnistościach nerkowych.

Użyliśmy przeciwciał poliklonalnych przeciwko albuminie surowicy ludzkiej (HSA), fetuinie A surowicy ludzkiej (HSF), ludzkiej apo-1A i całemu HS, aby zbadać obecność białek surowicy w NP-HS i ziarnistościach nerkowych. Swoistość przeciwciał poliklonalnych (przygotowanych jak opisano wcześniej25) zweryfikowano metodą Western blot (Fig. 5). Każde z przeciwciał poliklonalnych reagowało pozytywnie z HS-NP przygotowanymi in vitro, jak również z granulkami mineralnymi znajdującymi się w tkankach ludzkiej nerki (ryc. 6A, B, panele A1–A3 i B1–B3; czarne kropki). Przeciwciała reagowały głównie z warstwami gęstymi elektronami lub ciemnym rdzeniem HS-NP i ziarnistościami nerkowymi (ryc. 6A, B), co wskazuje, że te ciemne obszary mogą zawierać wyższy poziom białek w porównaniu z obszarami przepuszczającymi elektrony. Kontrole negatywne przeprowadzone bez przeciwciał pierwotnych nie wywołały reakcji (ryc. 6A, B, panele A4 i B4, kontrola). Doszliśmy do wniosku, że granulki nerkowe reprezentują mineralo-organiczne NP podobne do HS-NP nie tylko ze względu na ich morfologię i skład mineralny, ale także na ich wiązanie z głównymi inhibitorami zwapnienia obecnymi w surowicy.

Następnie zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną w celu potwierdzenia obecności granulek mineralnych zawierających HSA i HSF w chorych nerkach ludzkich. Przy użyciu tej techniki wykazano, że ludzkie tkanki nerki

dodatnie barwienie dla dwóch białek w różnych obszarach, w tym w śródmiąższu otaczającym kanaliki nerkowe, jak również w cytoplazmie komórek wyznaczających kanaliki (ryc. 7A, panele A1 i A2). W tych obszarach zaobserwowano również agregaty białkowe zawierające zarówno albuminę, jak i fetuinę-A, aczkolwiek w mniejszych ilościach w porównaniu z barwieniem pojedynczych białek (ryc. 7A i panel A3, połączone barwienie na żółto). W szczególności zauważyliśmy, że barwienie białka wykryte przez immunofluorescencję ściśle nakładało się na wzór zwapnienia ektopowego obserwowanego przy użyciu barwienia von Kossy (ryc. 7A, B, zwapnienie jest widoczne jako czarny materiał wskazany strzałkami w B). Wyniki te dostarczają dalszych dowodów na obecność cząstek mineraloorganicznych w badanych tkankach nerek człowieka.

Dyskusja

Chociaż poczyniono postępy w zrozumieniu interakcji między syntetycznymi nanocząsteczkami a komórkami ludzkimi, znacznie mniej wiemy o skutkach mineraloorganicznych nanocząsteczek, które tworzą się spontanicznie w płynach ustrojowych. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że cząstki te tworzą się w płynach biologicznych, gdy stężenia wapnia i fosforanów przekraczają nasycenie15,16. Zaobserwowaliśmy również, że cząstki te są internalizowane przez komórki odpornościowe, ale tylko duże cząstki wywołują prozapalne reakcje immunologiczne23. Jednak do tej pory nie zbadano rozmieszczenia tych cząstek w tkankach człowieka i tego, czy odgrywają one jakąkolwiek fizjologiczną lub patologiczną rolę w organizmie.

W niniejszym badaniu po raz pierwszy wykryliśmy mineraloorganiczne NP w nerkach ludzkich pacjentów cierpiących na schyłkową chorobę nerek lub raka nerki. Wykryte mineraloorganiczne NP zawierają słabo skrystalizowany fosforan wapnia podobny do minerału kostnego, a także albuminę, fetuinę-A i apo-A1, które działają jako ogólnoustrojowe inhibitory zwapnienia w płynach ustrojowych. Nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami opisującymi obecność kompleksów mineralno-białkowych w tkankach naczyniowych i płynach ustrojowych12,13,34,40. Ponieważ obserwowane przez nas cząstki zostały znalezione w obszarach nie zawierających mikroskopijnych zwapnień, nasze obserwacje sugerują, że cząstki mogą stanowić prekursory zwapnień ektopowych w tkankach ludzkich. Biorąc pod uwagę możliwość, że mineraloorganiczne NP mogą stopniowo zwiększać swój rozmiar i ulegać konwersji z cząstek w błonę w sprzyjających warunkach, jak opisano w naszych poprzednich badaniach15,18, przedstawione tu obserwacje sugerują, że prekursory minerałów mogą prowadzić do tworzenia większych złogi mineralne in vivo, takie jak płytka nazębna Randalla i kamienie nerkowe.

Nasze obserwacje, że mineralne zwapnienia ektopowe i mineraloorganiczne NP występują w różnych strukturach anatomicznych nerek, są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami dotyczącymi zwapnień ektopowych w tym narządzie41. Obserwacje Evana i wsp. wskazują, że mineralizacja w nerkach pacjentów z kamicą nerkową może rozpocząć się i zachodzić głównie w tkance śródmiąższowej pętli Henlego40,42. Autorzy ci zaobserwowali, że osady mineralne tworzące się w tym obszarze mogą wystawać od podstawy nabłonka dróg moczowych i prowadzić do powstawania kamieni nerkowych. Nasze obserwacje sugerują, że oprócz pętli Henlego, inne obszary nerek mogą zawierać mineralne NP, które mogą ostatecznie ewoluować, tworząc duże złoża minerałów w ludzkich nerkach. Badamy również możliwość, że mineralne NP powstające w krążeniu krwi mogą przenosić się do tkanek nerek i wywoływać ektopowe zwapnienie i tworzenie kamieni w nerkach.

Kilka ziarnistości nerkowych wykrytych w niniejszym badaniu znajduje się w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych (ryc. 4H, I) i są one podobne do pęcherzyków macierzy, jak wykazano, że indukują zwapnienie w kościach i zębach7,8. Ostatnio zaobserwowaliśmy, że pęcherzyki wyizolowane z surowicy ludzkiej i zwierzęcej indukują tworzenie mineralnych NP i mikroskopijnych osadów in vitro25. Schlieper i wsp.34 również zaobserwowali, że cząstki mineralne znajdujące się w tętnicach są związane ze strukturami błonowymi i zaproponowali, że pęcherzyki macierzy lub ciała apoptotyczne mogą reprezentować zarodki cząstek mineralnych w tych tkankach. Podobnie Khan i in. donoszą, że złogi fosforanu wapnia znajdujące się w nerkach pacjentów z idiopatyczną kamicą nerkową są związane z włóknami kolagenowymi i pęcherzykami macierzy9. Wyniki te sugerują, że mineraloorganiczne NP wykryte w tkankach nerek mogą powstawać w mechanizmie obejmującym pęcherzyki błonowe, co jest sytuacją analogiczną do tej obserwowanej w tętnicach miażdżycowych7,8. Z drugiej strony niedawne badanie wykazało, że ektopowe zwapnienie stwierdzane w tętnicach piersi kobiet nie było związane z markerami komórek osteogennych lub apoptotycznych43, co sugeruje, że mechanizm zwapnienia może być specyficzny dla danego narządu lub kontekstu biologicznego. Ponadto mineralo-organiczne NP, takie jak opisane tutaj, ludzkie tkanki nerek mogą również powstawać z powodu braku utrzymania fizjologicznych stężeń jonów (np. wapnia i fosforanu) i inhibitorów zwapnienia (np. albuminy, fetuiny-A i apo -A1) w płynach ustrojowych człowieka.

Nasze wyniki sugerują, że gęsta elektronowo warstwa i rdzeń minerałów-organicznych NP może zawierać wyższy poziom białek i cząsteczek organicznych w porównaniu z obszarami przepuszczającymi elektrony cząstek (ryc. 6A, B). Te gęste elektronowo warstwy wydają się być zmineralizowane, co widać po krystalicznej naturze tego materiału w TEM (patrz Rys. 4A-J). Inni autorzy, w tym Ryall41 i Evan i wsp.44, zaproponowali, że warstwa przepuszczająca elektrony może reprezentować minerały, podczas gdy warstwy o dużej gęstości elektronów mogą odpowiadać cząsteczkom organicznym. Interpretacje te mogą przynajmniej częściowo wynikać ze sposobu, w jaki próbki zostały przetworzone i zbadane w każdym badaniu, a także z charakteru użytych tkanek wyjściowych.

Oprócz odgrywania roli w ektopowym zwapnieniu, cząstki mineralno-organiczne mogą wywoływać stany zapalne w tkankach nerek. Niedawno wykazaliśmy, że chociaż mineraloorganiczne NP nie indukują wydzielania prozapalnej interleukiny-1 przez ludzkie makrofagi, to agregaty mineralne większe niż 1 μm są w stanie to zrobić23. Wykazano, że uwalnianie interleukiny-1 w odpowiedzi na materiały krystaliczne zależy od aktywacji wewnątrzkomórkowych kompleksów molekularnych zwanych inflamasomami45-47. Ponadto cząstki mineralne wykryto w nerkach z guzami, a związek między rakiem a stanem zapalnym jest obecnie dobrze poznany48. Pozostaje do zbadania możliwość, że zagregowane cząstki mineralne mogą aktywować inflamasom i przyczyniać się do rozwoju stanu zapalnego i raka w nerkach lub innych tkankach.

Oprócz zwapnienia ektopowego opisane tu granulki mineralne mogą uczestniczyć w innych procesach chorobowych. Na przykład wcześniej sugerowaliśmy, że mineralne NP mogą wiązać się z różnymi białkami w płynach ustrojowych i wyczerpywać te cząsteczki organiczne z płynów ustrojowych20,26. Z drugiej strony organizm ludzki może zapobiegać tworzeniu i gromadzeniu się mineralnych nanocząsteczek w normalnych warunkach, polegając na obecności inhibitorów zwapnienia i układu siateczkowo-śródbłonkowego (tj. makrofagów). Mineralne nanocząsteczki mogą zatem akumulować się tylko wtedy, gdy układowa lub lokalna homeostaza wapnia jest zaburzona i gdy mechanizmy ochronne w ludzkim ciele zawiodą.

Proponujemy, aby opracowane tutaj podejście nanomateriałowe można było wykorzystać do badania powstawania mineraloorganicznych NP w tkankach zwierzęcych i ludzkich. Na przykład, przeciwciała wytworzone przeciwko białkom hamującym zwapnienie, takim jak albumina, fetuina-A i apo-A1 mogą być stosowane w połączeniu z analizą mineralną w celu wykrycia i scharakteryzowania tworzenia mineraloorganicznych NP w tkankach modeli zwierzęcych. Wyniki uzyskane przy użyciu tego podejścia można zastosować do pomiarów klinicznych wykonywanych na płynach ustrojowych człowieka w celu identyfikacji parametrów biologicznych, które odzwierciedlają stan tworzenia cząstek mineralnych i ektopowego zwapnienia w organizmie. Spodziewamy się, że ta wiedza może doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych w zapobieganiu i leczeniu ludzkich chorób i stanów związanych z ektopowym zwapnieniem.

Metody

Tkanki nerkowe.Wykorzystanie tkanek ludzkich i eksperymenty przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital; metody i eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi. Od pacjentów uzyskano pisemną świadomą zgodę. Kontrolne zdrowe tkanki nerek uzyskano z biopsji pacjentów po urazach i krwiakach bez historii choroby nerek (n=2); tkanki nerki pobrano również od pacjentów z rakiem nerki (n=20) oraz od pacjentów ze schyłkową chorobą nerek (n=2), których nerki usunięto lub wykonano biopsję podczas operacji przeszczepu (Tabela 1). W przypadku tkanek raka nerki, nienowotworową część tkanki wycięto i przeanalizowano w niniejszym badaniu.

Analiza histologiczna.Tkanki nerkowe nałożono na bloczki parafinowe. Bloki pocięto na skrawki i plastry tkanki ogrzewano na gorącej płytce w temperaturze 70 stopni przez 30 minut w celu usunięcia parafiny. Skrawki zanurzono w świeżym roztworze ksylenu trzy razy na 15 minut w celu całkowitego usunięcia pozostałej parafiny. Skrawki nawadniano za każdym razem 95-procentowym, 80-procentowym i 70-procentowym etanolem przez 5 minut. Uwodnione próbki płukano wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) przez 5 min. Jądra komórkowe barwiono hematoksyliną przez 8 min. Barwnik usuwano z próbek ciepłą wodą przez 10 min. Próbki nerek przepłukano w ddH2O i zanurzono 10 razy w 95% etanolu. Próbki traktowane etanolem barwiono kontrastowo eozyną Y przez 1 min. Próbki odwadniano 95 procentami i 100 procentami etanolu przez 10 minut za każdym razem, po czym następował etap odwadniania w ksylenie przez 10 minut. Ostateczne próbki odwodnionej nerki umieszczono na szkiełkach z 50% glicerolem i obserwowano pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę cyfrową.

Próbki odparafinowane i nawodnione przygotowano zgodnie z opisem dla barwienia H&E. Nawodnione skrawki wybarwiono azotanem srebra (5 procent), a następnie wystawiono na działanie światła UV przez 20 min. Roztwór przemywano ddH2O przez 15min. Skrawki barwiono tiosiarczanem sodu (5 procent) przez 5 min, a następnie płukano ddH2O przez 15 min. Skrawki barwiono czerwienią jądrową szybkotrwałą (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) przez 5 min. Zabarwione próbki były kolejno odwadniane w 95 procentach i 100 procentach etanolu przez 10 minut każda, a następnie odwadniane w ksylenie przez 10 minut. Próbki nerek umieszczano na szkiełkach i badano jak opisano powyżej.

Mikroskopia elektronowa i analiza EDX.Próbki nerek pocięto na małe kawałki o grubości poniżej 1 mm przy użyciu mikroskopu do preparacji LGPS (Olympus, Tokio, Japonia). Tkanki utrwalano 2,5% aldehydem glutarowym i 1% paraformaldehydem w 0,1 M buforze kakodylanowym w temperaturze 4°C przez noc. Utrwalone próbki przemyto trzykrotnie 0.1 M buforem kakodylanowym w 8 procentowej sacharozie (pH 7,2) na lodzie przez 10 min. Przemyte tkanki inkubowano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) zawierającej 1% tetratlenku osmu i 1,5% żelazocyjanku potasu przez 2 godziny na lodzie. Tkanki trzykrotnie przemywano ddH2O na lodzie 10 min. Przemyte tkanki barwiono na lodzie 1% octanem uranylu w ddH2O przez 1 godzinę, przed trzykrotnym płukaniem ddH2O na lodzie. Tkanki nerki odwadniano 30, 50, 70, 80 i 90 procentowym etanolem przez 10 minut za każdym razem, z wyjątkiem sytuacji, gdy etanol osiągnął 70 procent, w którym to przypadku próbki przechowywano przez noc w temperaturze 4°C. Tkanki barwiono 1% kwasem fosforowolframowym w 95% etanolu przez 15 min, przed odwodnieniem w 95% etanolu przez 5 min. Próbki zanurzano w tlenku propylenu w 40, 57, 67 i 100 procentach w etanolu za każdym razem na 10 minut, a następnie ponownie zanurzano w 100 procentach tlenku propylenu na 5 minut. Tkanki nerek infiltrowano 50, 70 i 100% Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) za każdym razem przez 1 godzinę. Próbki nerek z osadzonym eponatem 812- przygotowano przez dwukrotną inkubację w 100% eponate. Zatopione próbki inkubowano w piecu w temperaturze 60 stopni przez noc, aby umożliwić polimeryzację żywicy.

Przemyte pastylki HS-NP otrzymane jak powyżej utrwalano aldehydem glutarowym (2,5 procent) i paraformaldehydem (1 procent) w ddH2O przez 4h w 4 stopniach. Utrwalone peletki przemywano ddH2O trzy razy po 10 minut za każdym razem. Peletki odwadniano z kolejnymi inkubacjami w 30, 50, 70, 80, 90, 95 i 100% etanolu, za każdym razem przez 10 minut, z wyjątkiem sytuacji, gdy etanol osiągnął 70%, w którym peletki przechowywano przez noc w 4 stopniach. Inne roztwory etanolu kontaktowano z peletami tylko na 10 min. Odwodnione peletki infiltrowano białą pożywką do zatapiania LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) stosując różne proporcje etanolu i pożywki LR (3:1, 1:1 i 1:3) przez 30 min każda. Peletki infiltrowano świeżą pożywką LR (100 procent) przez noc przed polimeryzacją. Peletki infiltrowane pożywką LR inkubowano w piecu w temperaturze 60 stopni przez 2 dni, aby umożliwić polimeryzację żywicy. Za pomocą mikrotomu Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Niemcy) pocięto bloki nerki i HS-NP, aby uzyskać plastry o grubości 70–100 nm. Skrawki tkankowe wybarwiono 4% octanem uranylu przed wizualizacją pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym JEM 1230 (JEOL, Tokio, Japonia) pracującym przy 100 kV. Dyfraktogramy elektronów uzyskano przy użyciu tego samego systemu. Jako podporę zastosowano siatki niklowe.

Do analizy EDX cienkie skrawki tkanek nerki barwiono octanem uranylu i przemywano ddH2O jak powyżej, a następnie suszono w elektronicznej szafce z eksykatorem. Próbki obserwowano pod wysokorozdzielczym transmisyjnym mikroskopem elektronowym (JEOL) JEM 2100 pracującym przy napięciu 120 kV. Widma EDX otrzymano w trzech powtórzeniach przy użyciu systemu INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, Wielka Brytania). Obserwowano cienkie skrawki HS-NP bez barwienia.

Przygotowanie mineralo-organicznych NP.Wszystkie roztwory wyjściowe doprowadzono do pH 7,4 i wysterylizowano przez filtrację przez membrany 0,2 μm przed użyciem. HS uzyskano od zdrowych ludzkich ochotników przy użyciu konwencjonalnej techniki nakłucia żyły. Wykorzystanie ludzkich płynów biologicznych w tym badaniu zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną szpitala im. Linko Chang Gung Memorial Hospital, a ochotnicy uzyskali pisemną świadomą zgodę. HS-NP przygotowano przez dodanie 3 mM CaCl2 i Na2HPO4 każdy do DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) zawierającego 10% HS, a następnie inkubację przez tydzień w warunkach hodowli komórkowej (37°C, 5% CO2, wilgotne powietrze). Cząstki osadzono przez wirowanie przy 16 000 xg przez 15 min w 4 stopniach i przemyto dwukrotnie buforem HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) stosując tę ​​samą procedurę wirowania.

SDS-PAGE i Western blot.Analizę SDS-PAGE i Western blot przeprowadzono zasadniczo jak poprzednio15. W skrócie, 0,2 ug (ryc. 5A,D) lub 1,2 ug (ryc. 5B,C) białek HS, 47 ug (ryc. 5A,B,D) lub 590ug białek HS-NP (ryc. 5C), 0,1 ug HSA (ryc. 5A-D) i 0,6 ug (ryc. 5A, C, D) lub {{23} },15 ug HSF (ryc. 5B) rozpuszczono w 5-krotnym „buforze ładującym” (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 0,05% błękit bromofenolowy, 50% gliceryna, 12,5% - merkaptoetanol) do końcowego stężenia 1x, przed ogrzewaniem w 95 stopniach przez 5 minut i rozdzieleniem w warunkach denaturujących i redukujących na 10 procentowej SDS-PAGE przy użyciu systemu mini-żelu (Hoefer, Holliston, MA). Kontrola NP (stosowana w ścieżce 1 na ryc. 5A-D) składała się z mineralnych NP przygotowanych przez dodanie 3 mM CaCl2 i Na2HPO4 każdy do DMEM (końcowa objętość 1 ml), a następnie inkubacja przez jeden dzień w warunkach hodowli komórkowej; Cząstki osadzono przez odwirowanie przy 16,000 xg przez 15 min, przemyto dwukrotnie buforem HEPES i ponownie zawieszono w 50 ul buforu HEPES. Próbkę 20 ul zawieszonych cząstek poddano obróbce do SDS-PAGE jak powyżej. Błony PVDF blokowano przez 1 godzinę w 5% (wag./obj.) odtłuszczonym mleku w temperaturze pokojowej. Pierwotne przeciwciała wytworzone we własnym zakresie, jak opisano wcześniej25, zastosowano w rozcieńczeniu 1:1,000 (-apo-A1 i -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) lub 1:6,000 (-HSA). Kozie przeciwciało drugorzędowe przeciw króliczym skoniugowanym z peroksydazą chrzanową zastosowano w oparciu o instrukcje dostarczone przez producenta (Millipore, Billerica, MA). Bloty zostały ujawnione przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (Amersham Biosciences, Amersham, Wielka Brytania) i filmów autoradiograficznych.

Znakowanie złotem.Próbki przygotowano do obserwacji TEM. Bloki HS-NP pocięto na plastry o grubości poniżej 70 nm. Skrawki próbek na siatkach zablokowano 1% żelatyną rybią (Sigma) w 0,1 M buforze HEPES (pH 8,0) przez 25 min. Siatki inkubowano z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Kontrola negatywna nie zawierała przeciwciała pierwszorzędowego (1% żelatyny rybiej w buforze HEPES). Inkubowane sekcje płukano buforem HEPES przez 15 min. Wypłukane skrawki zablokowano 1% żelatyną rybią w buforze HEPES przez 20 min. Próbki traktowano przez 1 godzinę drugorzędową kozią anty-króliczą IgG sprzężoną z 5-nm-złotem. Próbki płukano buforem HEPES przez 10 min, przed płukaniem ddH2O przez 10 min. Obserwacje TEM przeprowadzono jak powyżej.

Mikroskopia fluorescencyjna.Szkiełka histologiczne tkanki nerki przygotowane jak powyżej zablokowano 1% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Szkiełka inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami poliklonalnymi w rozcieńczeniu 1:4, 000. Po etapach płukania próbki inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi kozim antykróliczym FITC (492/520nm) i kozim antykróliczym-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) o godzinie 1:100 dla 1h. Kompleksy płukano PBST przez 15 min. Barwnik fluorescencyjny 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) zastosowano w stężeniu 10 ug/ml przez 15 min. Próbki wybarwione DAPI były odwadniane 95- i 100-procentowym etanolem przez 10 minut każda, a następnie odwadniane w ksylenie przez kolejne 10 minut. Próbki odwodnionej nerki mocowano za pomocą pożywki montażowej Vectashield fluorescence H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i obserwowano pod mikroskopem konfokalnym (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Niemcy) wyposażonym w kamerę Spot Flex.

Cistanche tubulosa zapobiega chorobie nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

Bibliografia

1. Giachelli, CM Ektopowe zwapnienie: zbieranie twardych faktów na temat mineralizacji tkanek miękkich. Am J Pathol 154, 671-675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Zwapnienie naczyń: mechanizmy i konsekwencje kliniczne. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Zwapnienie w miażdżycy. Nat Rev Cardiol 6, 681-688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Wzorce i czynniki ryzyka układowej zwapnionej miażdżycy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. i in. Niedobory białek regulujących wapń u pacjentów dializowanych: nowa koncepcja zwapnienia układu krążenia w mocznicy. Nerka Int Suppl 84, S84-87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Celowanie w zwapnienie naczyń: zmiękczenie twardego celu. Curr Opin Pharmacol 9, 84-89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Regulacja wapnia w pęcherzykach macierzy pochodzących z komórek mięśni gładkich naczyń. Trendy Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM i in. Zwapnienie w miażdżycy: biologia kości i przewlekłe zapalenie na skrzyżowaniu tętnic. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Stowarzyszenie płytek Randalla z włóknami kolagenowymi i pęcherzykami błonowymi. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biochemiczna charakterystyka kompleksu fetuina-minerał surowicy. J Biol Chem 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Poziomy kompleksu mineralno-fetuinowego w surowicy korelują ze zwapnieniem tętnic u szczura. J Biol Chem 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. i in. Hierarchiczna rola fetuiny-A i kwaśnych białek surowicy w tworzeniu i stabilizacji cząstek fosforanu wapnia. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. i in. Nanoanalityczna mikroskopia elektronowa ujawnia fundamentalny wgląd w zwapnienie ludzkiej tkanki sercowo-naczyniowej. Nat Mater 12, 576-583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Rzekome nanobakterie w ludzkiej krwi jako nanocząstki węglanu wapnia. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549-5554 (2008).

15. Young, JD i in. Domniemane nanobakterie stanowią fizjologiczne pozostałości i produkty uboczne hodowli normalnej homeostazy wapnia. Plos Jeden 4, e4417 (2009).

16. Young, JD i in. Charakterystyka granulacji wapnia i apatytu w surowicy jako pleomorficznych kompleksów mineralo-proteinowych oraz jako prekursorów domniemanych nanobakterii. Plos Jeden 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuina-A/albumina-mineralne kompleksy przypominające granulki wapnia w surowicy i domniemane nanobakterie: demonstracja koncepcji podwójnego wysiewu inhibicji. Plos Jeden 4, e8058 (2009).

18. Young, JD i Martel, J. Powstanie i upadek nanobakterii. Sci Am 302, 52-59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Krytyczna ocena napromieniowanej gamma surowicy stosowanej jako podajnik w hodowli i demonstracja domniemanych nanobakterii i zwapniających nanocząstek. Plos Jeden 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. i in. Kompleksowa analiza proteomiczna nanocząstek mineralnych pochodzących z płynów ustrojowych człowieka i analizowana metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas. Anal Biochem 418, 111-125 (2011).