Modelowanie chorób za pomocą organoidów nerkowych

Abstrakcyjny:Choroby nerekczęsto brakuje optymalnego leczenia, co powoduje miliony zgonów każdego roku. Zatem opracowanie odpowiednich systemów modelowych do badaniachoroba nerek człowiekama ogromne znaczenie. Do najbardziej obiecujących modeli nerek człowieka należą organoidy lub małe zbiorowiska tkanek przypominające narządy, pochodzące z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Jednak bardziej przypominają pierwszy trymestrnerka płoduniż dorosła nerka. Dlatego potrzebne są nowe strategie, aby przyspieszyć ich dojrzałość. Mają ogromny potencjał w modelowaniu chorób i ewentualnie terapii pomocniczej, jeśli osiągną dojrzałośćdorosła nerka. W tym przeglądzie omówimy obecny stan organoidów nerkowych pod kątem ich podobieństwa do ludzkiej nerki i dotychczasowy sposób wykorzystania ich jako systemu modelowania chorób. Następnie omówimy potencjalne ścieżki rozwojudojrzałość nerekorganoidy pasujące do nerki dorosłej w celu dokładniejszego modelowania chorób u ludzi.

Słowa kluczowe: organoidy;nerka; rozwój; metanercze; moczowodowy; cewka; żeton; nefrologia; modelowanie chorób

KLIKNIJ TUTAJ, ABY POBRAĆ CISTANCHE DO LECZENIA PChN

1. Wstęp

Do niedawna choroby człowieka modelowano na dwa sposoby: na zwierzętach lub na dwuwymiarowej hodowli komórkowej. Modele zwierzęce umożliwiają badanie ścieżek chorobowych i opracowywanie leków w całych organizmach, ale nie uwzględniają budowy genetycznej i anatomicznej człowieka. Z drugiej strony hodowla komórek ludzkich pozwala naukowcom badać mechanizmy chorobowe specyficzne dla człowieka i oceniać metody leczenia z dużą i precyzyjną głębią molekularną. Jednakże hodowla komórkowa nie odzwierciedla złożonej trójwymiarowej struktury i fizjologii narządu.

Organoidy ludzkie to uproszczone wersje narządów ludzkich, z realistyczną trójwymiarową mikroanatomią i funkcjami na poziomie narządów (np. wytwarzanie łez w organoidach mlecznych i wzrost włosów w organoidach skóry) [1,2]. W procesie samoorganizacji powstają one in vitro z komórek tkankowych lub pluripotencjalnych komórek macierzystych. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), wynalezione w 2008 roku przez Takahashiego i Yamanakę, są najpopularniejszymi komórkami do tworzenia organoidów [3]. Wynika to z kilku istotnych zalet, jakie oferują iPSC. Po pierwsze, stanowią nieograniczone odnawialne źródło komórek i mogą różnicować się w wiele typów komórek. Co ważniejsze, reprezentują one podstawowy skład genetyczny pacjentów. Zatem ludzkie iPSC pochodzące od pacjenta (hiPSC) można wykorzystać do badania chorób za pośrednictwem organoidów na poziomie indywidualnym, umożliwiając postęp w medycynie spersonalizowanej. Do chwili obecnej do badania chorób wykorzystywano modele organoidalne różnych narządów człowieka, takich jak serce i mózg. W tym przeglądzie skupimy się na organoidach nerkowych i omówimy, w jaki sposób można je wykorzystać do modelowania ludzkiej nerek i związanych z nią chorób, badań przesiewowych pod kątem toksyczności leków i być może uzupełniania funkcji nerek.

Choroby nerek dotykają 10% światowej populacji [4]. Pomimo zidentyfikowania genetycznej przyczyny wielu postaci chorób nerek, nie ma dostępnych optymalnych metod leczenia. Ta niefortunna sytuacja odzwierciedla brak systemów modeli in vitro, które podsumowują chorobę nerek u ludzi na potrzeby ukierunkowanego rozwoju terapii. Organoidy nerkowe stanowią dostosowaną do potrzeb człowieka platformę badawczą 3-D służącą do badania genetycznych chorób nerek, uszkodzeń nerek i toksyczności leków. Organoid nerkowy, oprócz swojej zdolności do pełnienia roli układu modelującego, ma potencjał, który może przyczynić się do rozwoju medycyny transplantacyjnej. Zatem, aby zmaksymalizować swój potencjał w obu tych obszarach, organoid nerkowy musi przypominać strukturę i funkcję nerek dorosłego człowieka. W tym miejscu dokonamy przeglądu obecnego stanu organoidu ludzkiej nerki pochodzącego z komórek pluripotencjalnych, jego potencjalnych zastosowań i obszarów wymagających ulepszeń.

2. Nerka ludzka a organoidy nerkowe

HiPSC służą jako zastępcze embrionalne PSC. Zatem utworzenie organoidu nerkowego z hiPSC pociąga za sobą replikację rozwoju ludzkich embrionalnych nerek. Poniżej przyjrzymy się rozwojowi organoidu nerkowego i porównamy go z nerką ludzką.

2.1. Rozwój nerek człowieka

Krew jest filtrowana w trzech odrębnych fazach rozwoju embrionalnego. W pierwszej fazie w 4-tygodniowym zarodku ludzkim rozwija się struktura zwana przednerczem, która przetwarza krew w okolicy szyjki macicy aż do około 5 tygodnia [5]. Następnie w okolicy klatki piersiowej zarodka tworzą się śródnercze, które filtrują krew od początku 5. do około 10. tygodnia rozwoju embrionalnego. Podczas gdy mezonefros filtruje krew, ostateczny system filtracji, który ostatecznie stanie siędorosła nerka, zaczyna się tworzyć (Rysunek 1). Tworzy się z dwóch części: mezenchymu metanerkowego i pączka moczowodu. Mezenchym metanerczy tworzy wszystkie części nefronu z wyjątkiem przewodu zbiorczego, podczas gdy zawiązek moczowodu tworzy przewód zbiorczy. Struktury te przechodzą cykl wzajemnej indukcji, podczas którego mezenchym metanerczy i zawiązek moczowodu stymulują wzajemny wzrost i łączą się, tworząc strukturę zwaną metanerczycami. Nowo utworzone metanercze filtrują krew z gałęzi biodrowych w dół do okolicy miednicy. W tym samym czasie zawiązek moczowodu rozwidla się i nadal rozgałęzia, tworząc w nerce wiele kanalików zbiorczych [6,7]. Następnie te połączone struktury metanercze wznoszą się do obszaru brzucha embrionu w miarę jego rozwoju i zapewniają dopływ krwi z prymitywnej aorty. Procesy te podsumowano na rycinie 1. Należy zauważyć, że komórki mezenchymu metanerkowego i zawiązków moczowodu są prymitywne, a zatem zachowują potencjał multipotencjalny, podczas gdy zróżnicowane komórki nerek dorosłych są przypisane do swojego szczególnego rodowodu [8].

Rycina 1. Rozwój układu moczowego człowieka od 4. do 9. tygodnia życia w macicy.

2.2. Protokoły wytwarzania organoidów nerkowych

Organoidy nerkowe mogą powstawać ze zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanki lub pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby wyhodować organoid nerki z komórek pochodzących z tkanek, można rozmieścić zróżnicowane dorosłe komórki w trójwymiarowej przestrzeni ex vivo, aby naśladować architekturę narządów ludzkich [9]. Protokoły organoidów dla zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanek opisano gdzie indziej. W tym przeglądzie skupimy się na organoidach nerek pochodzących z komórek macierzystych. Aby stworzyć takie systemy, naukowcy mogą hodować pluripotencjalne komórki macierzyste w obecności specyficznych dla nerek endogennych morfogenów i składników zewnątrzkomórkowych. Komórki macierzyste mogą następnie samoorganizować się w struktury przypominające nerki, naśladując rozwój embrionalny nerek. Narządy takie jak jelito zawierają populacje endogennych komórek macierzystych w dorosłej tkance, za pomocą których naukowcy mogą tworzyć organoidy [10]. Ponieważ jednak nie ma jednoznacznych dowodów na to, że nerka dorosłego człowieka zawiera niszę komórek macierzystych, organoidy nerkowe pochodzące z komórek macierzystych muszą być wykonane z pluripotencjalnych komórek macierzystych (embrionalnych lub hiPSC) [11].

Organoidy nerkowe pochodzące z komórek macierzystych można podzielić na dwie następujące kategorie: organoidy progenitorowe nefronów (NP) i organoidy zawiązków moczowodu (UB). Obydwa typy organoidów mają ugruntowaną pozycję jako modele chorób. Organoidy NP przypominają mezenchym metanerczowy, który zawiera multipotencjalne komórki NP. W rzeczywistości pojedyncza komórka mezenchymalna metanerki może dać początek wszystkim komórkom nabłonkowym nefronu, z wyjątkiem przewodu zbiorczego [8]. Metodologie generowania organoidów NP pochodzących z hiPSC obejmują hodowlę 2D z późniejszą agregacją na porowatej płytce transwell (np. Takasato i in. (2016), Morizane i in. (2015)) lub hodowlę 3D w hydrożelu (np. Freedman i in. (2015)) [12–14]. Te organoidy rozwijają struktury kłębuszkowe i kanalikowe. Organoidy NP pochodzące z dwóch najpopularniejszych protokołów NP autorstwa Takasato i Morizane porównano w obszernej analizie omikowej przeprowadzonej przez Wu i in. (2018) [15]. Odkryli, że podczas gdy protokół Takasato generuje około 11% komórek podocytopodobnych i 21% komórek poza celem na organoid, protokół Morizan generuje około 28,5% komórek podocytopodobnych i 14,3% komórek poza celem [15]. Wydaje się, że organoidy Takasato również rozwijają niewielką liczbę regionów podobnych do UB, ale głównie imitują mezenchym metanerczy, klasyfikując je w ten sposób jako organoidy NP [12]. Ponadto Moriane i in. (2015) oraz Takasato i in. (2016) w protokołach brakuje zewnątrzkomórkowego środowiska hydrożelowego, które występuje w pracy Freedmana i wsp. (2015) [14]. Garreta i in. (2019) argumentują, że obecność hydrożelu w tworzeniu organoidów poprawia tworzenie struktury nerek i wzmaga wytwarzanie wczesnych markerów IM, tylnych markerów IM i przednich markerów IM [16].

W przeciwieństwie do organoidów NP, organoidy UB imitują zawiązek moczowodu, z którego powstaje układ przewodów zbiorczych. Metody wytwarzania organoidów UB zostały niedawno opracowane i obejmują hodowlę ciałek embrionalnych i późniejszą agregację do słabo przylegających dołków [17]. Organoidy te mają struktury rurowe i zbiorcze. Wreszcie, organoidy NP i UB również połączono, aby wygenerować struktury współkultury wyższego rzędu, aby podsumować dorosłego człowiekafenotypy nerek[17]. Najpopularniejsze protokoły dlaorganoid nerkowypodsumowano na rycinie 2 poniżej [12–14,17–19].

Rysunek 2. Podsumowanie najpopularniejszych protokołów tworzenia organoidów

2.3. Jak się układają: organoidy nerkowe kontra ludzkie nerki

Protokoły opisane powyżej obejmują przede wszystkim samoorganizację hiPSC w organoidy. Naśladują warunki płodu, aby indukować różnicowanie hiPSC w linie specyficzne dla nerek i tworzenie struktur specyficznych dla nerek. Pierwszym odtwarzanym przez nich stanem płodu jest prymitywna sygnalizacja smugowa. Prymitywna smuga to część zarodka, która rozwija się przed oddzieleniem trzech listków zarodkowych. Większość protokołów robi to poprzez wykorzystanie agonisty sygnalizacji WNT CHIR. Następnie, aby wyprowadzić linię NP, należy indukować mezodermę tylno-pośrednią (PIM), a w przypadku linii UB należy indukować mezodermę przednio-pośrednią (AIM) [17]. Co ciekawe, Takasato i in. (2015) odkryli, że im dłuższy okres podawania CHIR, tym rozwinęła się mezoderma bardziej tylna, natomiast im krótszy ten okres, tym rozwinęła się mezoderma bardziej przypominająca przednią [20]. Zatem zwiększony czas sygnalizacji WNT prowadzi do generowania bardziej kłębuszkowej i proksymalnej struktury, a skrócony czas sygnalizacji WNT prowadzi do generowania bardziej dystalnej struktury.

Po zakończeniu protokołu NP rozwijają się organoidy z obszarami kłębuszkowymi i kanalikowymi. Są jednak niedojrzali. Badania wykazały, że organoidy nerkowe pochodzące z hiPSC naśladują płód w pierwszym trymestrze ciąży [20]. Jedną z najobszerniejszych analiz na ten temat przeprowadzili Subramanian i in. (2019), którzy wykorzystali sekwencję RNA do porównania organoidów nerek z nerkami ludzkimi w okresie 8-tygodniowym, 17-tygodniowym i dorosłym. Doszli do wniosku, że organoidy nerkowe są bardziej podobne do nerek ludzkich w 8. i 17. tygodniu u płodu niż w nerkach dorosłych [21]. Co więcej, organoidy nerek wykazują barwienie prymitywnych markerów multipotencjalnych, takich jak SIX2+ w całej nerce, podczas gdy zróżnicowana nerka człowieka dorosłego nie wykazuje ekspresji takich markerów [22]. Dlatego też, aby wykorzystać organoid nerki jako zastępczą nerkę dorosłego człowieka do badania choroby, musi ona być w zaawansowanym wieku ciążowym.

Organoidy nerkowe mogą nie tylko bardziej naśladować wczesne śródnercze niż właściwa nerka człowieka dorosłego, ale mogą nawet bardziej przypominać śródnercze niż śródnercze, jeśli stężenie morfogenów jest nieprawidłowo regulowane [23]. Odnosząc się do tych obaw, Tsujimoto i in. (2020) badali różnicowanie hiPSC in vitro w mesonephric NP, metanephric NP i komórki UB [24]. W badaniu tym zidentyfikowano kilka czynników różnicujących te trzy linie rodowe, dlatego można je zastosować w przyszłych badaniach tych trzech odrębnych systemów [24]. Inne kluczowe postępy w dojrzewaniu organoidów obejmują interakcje NP-UB i unaczynienie. Niektóre z najbardziej znaczących badań poświęconych tym kwestiom przeprowadzili Taguchi i Nishinakamura (2017) oraz Tsujimoto i in. (2020) [17,24]. W badaniach tych wygenerowano wspólnie hodowane organoidy MM-UB i przeszczepiono je myszom, gdzie uległy unaczynieniu. Wytwarzanie tych metanerkowych struktur wyższego rzędu znacząco zwiększyło podobieństwo struktury nerek pochodzącej z komórek macierzystych do rzeczywistych nerek ludzkich. Jednak nawet te zaawansowane systemy nie były w stanie odtworzyć bardziej rozległego rozgałęzienia UB, które występuje in vivo w drugim i ostatnim trymestrze ciąży [24]. Odkrycia te podkreślają potrzebę odtworzenia endogennych funkcji dojrzałych nerek i interakcji, których brakuje obecnym organoidom, takich jak przepływ płynów.

3. Organoidy nerkowe jako układy modelowe

Podobieństwo organoidów nerkowych do nerek ludzkich sprawia, że ​​nadają się one do modelowania chorób i badań przesiewowych leków. Można je wykonać w czasie krótszym niż miesiąc, personalizować pod konkretną osobę i produkować masowo [12–14,17–19]. Ponadto można je hodować in vitro lub przeszczepiać myszom, szczurom lub jajom kurzym, tworząc kompletne modele in vivo. Poniżej przeanalizujemy analizy, które można przeprowadzić w przypadku organoidów nerkowych, a także obecne i przyszłe zastosowania organoidów nerkowych w badaniach biomedycznych.

3.1. Analiza organoidów nerek

3.1.1. Testy in vitro

Na organoidach nerek można przeprowadzić różne testy fizjologiczne, molekularne i funkcjonalne. Jeśli chodzi o testy molekularne, z powodzeniem przeprowadzono różne analizy transkryptomiczne w organoidach nerek [25]. Na przykład Takasato i in. (2015) wyodrębnili RNA z organoidów i przeprowadzili sekwencjonowanie RNA oraz analizy qRTPCR [20].

Inni, jak Wu i in. (2018) przeprowadzili izolację jąder i sekwencjonowanie snRNA, oprócz sekwencjonowania scRNA DropSeg w organoidach nerek. Oprócz poziomów RNA określono ilościowo różne poziomy białek i porównano je z lizatu organoidów nerkowych za pomocą immunoblotu (np. Cruz i in., 2017; Morais i in., 2022) [26,27]. Ponadto rutynowo przeprowadza się analizę immunocytochemiczną organoidów nerek w celu zbadania specyficznych struktur nefronów. Często przeprowadza się to w formie barwienia całych organoidów; alternatywnie do sondowania wykorzystywano również skrawki tkanek (np. Takasato i in., 2015; Cruz i in., 2017) (20,26). Badania te wykazały, że organoidy nerek wykazują kłębuszki, kanalik proksymalny, kanalik dystalny, błonę podstawną i układ przewodu zbiorczego (20,27). Ryc. 3 poniżej przedstawia przykład zatopionych w parafinie i podzielonych na kawałki organoidów ludzkiej nerki wygenerowanych przy użyciu protokołu Takasato i wsp. (2016). (12) Skrawek barwiono pod kątem kłębuszków, kanalików bliższych i dystalnych białka markerowe kanalików i wykazuje ciągłe struktury nefroniczne od kłębuszków do kanalików dystalnych. Oprócz tych struktur wiadomo, że organoidy nerki wykazują również układ naczyniowy, jednakże jest on ograniczony, szybko zanika i nie jest zorganizowany jak w typowej nerce (28).

Na organoidach nerek można także przeprowadzić wiele testów funkcjonalnych. Na przykład, jak opisali Freedman i in. (2022) organoidy nerek można poddawać testom impulsowym, podczas których do pożywek można dodać różne cząsteczki fluorescencyjne przed zastąpieniem ich nową pożywką pozbawioną fluorescencji [29]. Organoidy można następnie analizować pod kątem wychwytu tych cząsteczek, a uzyskane informacje można wykorzystać do wywnioskowania informacji na temat akumulacji, obrzęku, filtracji, układu hormonalnego lub uszkodzenia [29]. Jednakże jednym z problemów związanych z tym testem na platformach organoidowych jest to, że cząsteczki mogą być wprowadzane z zewnątrz do zamkniętych struktur rurowych zamiast przez powierzchnię wierzchołkową, jak miałoby to miejsce in vivo. W związku z tym cząsteczki fluorescencyjne mogą zostać zaabsorbowane z zewnętrznej błony podstawno-bocznej, ponieważ nie ma możliwości kontrolowania, dokąd te cząsteczki mogą się przedostać po całkowitym wprowadzeniu do środowiska. Ponadto transport cząsteczek może być ograniczony przez dyfuzję w obrębie organoidów, tworząc różne trendy w akumulacji w obrębie tego samego organoidu.

Ponadto naprawę nerek można również ocenić na platformach organoidowych, co umożliwi wgląd w mechanizmy odwrócenia uszkodzenia nerek i podstawy genetyczne, które mogą predysponować pacjentów do choroby nerek. Na przykład badania takie jak Gupta i in. (2022) zbadali szlaki genowe, których ekspresja uległa zwiększeniu w obecności pojedynczej lub wielokrotnej ekspozycji na cisplatynę, cząsteczkę powodującą uszkodzenie nerek, w platformach organoidowych nerek [30]. Wreszcie, tworzenie cyst można analizować w organoidach w celu badania wielotorbielowatości nerek (PKD) poprzez aktywację cAMP [26]. Cysty można następnie zmierzyć, określić ilościowo i traktować jako wskaźniki zastępcze ludzkich cyst nerkowych.

3.1.2. Analiza in vivo

Istotną wadą stosowania organoidów nerkowych in vitro jako układu modelowego jest brak ich wzajemnego oddziaływania z resztą organizmu. Mnóstwo schorzeń wpływających na odległe części ciała może wpływać na nerki i odwrotnie. Na przykład zmiany ciśnienia krwi mogą drastycznie zmienić ciśnienie kłębuszkowe, które z kolei mogą regulować nerki. Jednakże in vitro układy organoidalne nie odpowiadają za te interakcje ogólnoustrojowe. W związku z tym zbadano metody przeszczepiania, które obejmują organoidy nerkowe pochodzące od człowieka u myszy, szczurów i jaj kurzych. W takich badaniach tkanki ludzkie i zwierzęce rozróżnia się poprzez barwienie immunologiczne ludzkiego antygenu jądrowego lub dopasowanie odczytu chromosomu Y do połączonego odniesienia do genomu [21]. Dodatkowo organoidy można przeszczepiać za pomocą rusztowania (np. jedwabiu), aby zapewnić wyższy poziom integralności strukturalnej [31]. Takie podejście może pozwolić na łatwiejsze analizy specyficzne dla tkanek organoidów po przeszczepieniu.

Kluczową zaletą przeszczepiania organoidów nerkowych jest to, że umożliwiają one organoidom unaczynienie, dojrzewanie, a nawet filtrowanie moczu. Van den Berga i in. (2018) wykazali, że po podtorebkowym przeszczepieniu nerek myszom, kłębuszki i kanaliki organoidalne nerki znacznie dojrzewają [32]. W innym badaniu Subramanian i in. (2019) wykazali, że przeszczepienie organoidów pochodzących z hiPSC myszom prowadzi do zwiększonego dojrzewania kanalików bliższych i dalszych oraz zmniejszonej obecności populacji komórek poza docelowymi w organoidzie [21]. Co ważniejsze, po przeszczepieniu organoidy nerkowe mogą pełnić ostateczną funkcję nerki, czyli filtrować krew. Po podskórnym przeszczepieniu myszy organoidy nerek utworzyły struktury filtrujące mocz, o czym świadczy transfer dekstranu znakowanego FITC [33]. Zatem przeszczep nie tylko pozwala na badanie skutków mutacji w organoidzie nerki in vivo, ale także poprawia podobieństwo organoidu do ludzkiej nerki i czyni z niego układ w pewnym stopniu funkcjonalny.

Chociaż myszy z niedoborem odporności są często wykorzystywane do przeszczepiania organoidów nerkowych hiPSC, wykorzystywano również innych żywicieli, takich jak błony kosmówkowo-moczomoczowe piskląt (CAM). CAM charakteryzuje się naturalnym niedoborem odporności i sprzyja unaczynieniu organoidu [16]. Brakuje mu jednak typowych układów narządów ssaków, co powoduje, że organoidy nerek są odłączone od innych układów, w przeciwieństwie do myszy. Pomimo niepowodzeń związanych z żywicielem, wytwarzanie chimer za pomocą organoidów nerkowych pochodzących od człowieka umożliwia szeroko zakrojone badania in vivo chorób nerek u ludzi na niezwykle wpływowej platformie.

3.2. Dotychczasowe badania nad modelowaniem chorób

3.2.1. Organoidy nerkowe jako modele chorób genetycznych

Organoidy nerkowe wykorzystano do badania genetycznych chorób nerek kanalików i kłębuszków [26,34,35]. U ludzi do najważniejszych chorób kanalików zalicza się wielotorbielowatość nerek u dzieci (PKD), która wynika z autosomalnych recesywnych mutacji w genie włóknisto-torbielowatym (PKHD1) oraz PKD u dorosłych, która wynika z autosomalnych dominujących mutacji w policystynie-1 i -2 geny [36–38]. Mutacje te można sztucznie wprowadzić do hiPSC za pomocą technologii edycji genów, takich jak system CRISPR-Cas 9. Edytowane hiPSC można następnie hodować w organoidy ludzkiej nerki modelujące PKD i analizować poprzez barwienie białek i profilowanie RNA. Na przykład Freedman i in. (2015) oraz Cruz i in. (2017) wyeliminowali geny policystyny ​​w liniach hiPSC przy użyciu systemu CRISPR/Cas9, a następnie uzyskali organoidy, które naśladują fenotyp torbielowaty występujący in vivo u chorych pacjentów [14,26]. Badania te pokazują, że organoidy nerek można wykorzystać jako łatwo obserwowalne platformy istotne dla choroby do badania PKD. Co więcej, organoidy wykonane z linii komórkowych pochodzących od pacjentów umożliwiają wgląd w mutacje specyficzne dla pacjenta i prawdopodobieństwo rozwoju choroby. Na przykład Low i in. (2019) opracowali organoidy nerkowe pochodzące od pacjentów z mutacjami PKHD1 i porównali je z organoidami typu dzikiego [39]. Chore organoidy wykazywały znacznie częstsze tworzenie się cyst, co pokazało potencjał organoidów nerkowych w przewidywaniu objawów choroby na podstawie genotypu [39]. W innym badaniu Hernandez i in. (2021) uzyskali hiPSC od pacjentów z mutacjami w genie kompleksu stwardnienia guzowatego-2, który powoduje, że pacjent jest podatny na rozwój nowotworu nerki [40]. Następnie skorygowali mutację pacjenta za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Organoidy nerkowe z tych skorygowanych izogenicznych linii mutantów wykazywały zmniejszone tworzenie cyst i przywrócone szlaki genowe w porównaniu z chorymi organoidami, wykazując w ten sposób przydatność organoidów nerkowych w badaniu dalszych skutków funkcjonalnych określonych mutacji w izogenicznych układach narządowopodobnych.

Naukowcy wykorzystali także organoidy pochodzące od pacjentów, aby uzyskać wgląd w choroby genetyczne wpływające na kłębuszki. Na przykład Hale i in. (2018) skupili się na genie NPHS1 (nefryna), który w przypadku zmutowania powoduje nieprawidłowe tworzenie się wyrostków stopy podocytów i nieszczelną filtrację moczu, co skutkuje chorobą nerek [34]. Hale i in. (2018) wykorzystali pochodzące od pacjenta zmutowane komórki NPHS1 hiPSC do uzyskania organoidów nerkowych, które modelowały wadliwe procesy stopy podocytów, w tym obniżony poziom białek specyficznych dla podocytów, nefryny i podocyny [34]. Podobnie Freedman i in. (2015) wyeliminowali kłębuszkowy gen PODXL w hiPSC i odkryli, że organoidy wykazują wadliwą architekturę podocyt-podocyt [14].

Jednym z w dużej mierze niewykorzystanym potencjałem organoidów nerek jest ich zdolność do modelowania wad embrionalnych i płodowych. Obecnie badacze starają się modelować nerkę dorosłego człowieka za pomocą organoidu nerkowego. Jednakże w obecnym stanie I i II trymestru organoid nerki może być stosowany do badania rozwojowych wad nerek [41]. Wady rozwojowe układu moczowego, takie jak dysplazja nerek, należą do jednych z najpowszechniejszych i najcięższych zaburzeń rozwojowych [42]. Ponieważ wiele z tych chorób można wykryć już w 11. tygodniu życia, organoidy nerkowe szczególnie dobrze nadają się do badania wrodzonych wad nerek. Do dyspozycji mamy nie tylko organoidy nerkowe przypominające metanerkę w pierwszym i drugim trymestrze ciąży, ale także prymitywne linie komórkowe nerek mezonerczyka (np. Tsujimoto i in., 2020) do badania wad embrionalnych i płodowych [24]. Ponieważ niewiele systemów pozwala na badanie i manipulowanie rozwijającą się ludzką nerką, organoid nerkowy zapewnia ogromny potencjał w badaniach genetycznych, toksykologicznych i rozwojowych płodu.

3.2.2. Organoidy nerkowe jako modele innych chorób

Oprócz chorób genetycznych organoidy nerek wykorzystano do badania reakcji układów ludzkich na infekcję wirusową, raka i urazy. Na przykład Jansen i in. (2021) wykorzystali platformę organoidów nerkowych do oceny wpływu wirusowego SARS-CoV-2 na ludzkie nerki [43]. Grupa ta odkryła, że ​​infekcja SARS-CoV-2 prowadzi do zwiększonej ekspresji kolagenu I w organoidach ludzkiej nerki, dostarczając w ten sposób mechanistycznego wyjaśnienia uszkodzenia nerek i zwłóknienia, które często towarzyszą ciężkim przypadkom długiego przebiegu COVID-19 [ 43]. Jeśli chodzi o badania nad rakiem, Hernandez i wsp. (2021) przeszczepili organoidy nerek szczurom z niedoborem odporności, aby modelować rzadkie nowotwory nerek o podłożu genetycznym. Tutaj w organoidach pochodzących od pacjentów rozwinęły się zmiany nowotworowe, przypominając w ten sposób ludzkie nowotwory nerki [40]. Ponadto wykorzystali modele nowotworów na bazie organoidów nerek jako półfunkcjonalne struktury pochodzenia ludzkiego oraz przetestowali leki i terapie oparte na nanocząsteczkach. Wreszcie, ostatnie badania wykazały, że organoidy nerek można wykorzystać do badania odpowiedzi na uszkodzenie nerek. Na przykład Prezpiorski i in. (2022) wykazali, że organoidy nerkowe wytwarzają markery uszkodzeń oksydacyjnych i zwiększoną ekspresję markerów uszkodzeń poprzez podawanie heminy cząsteczki uszkodzenia do organoidów nerkowych wraz z biosensorem [44].

3.2.3. Organoidy nerkowe w ocenie leków

Oprócz zapewnienia wglądu w choroby, organoidy nerek wykorzystuje się do badań przesiewowych leków. W szczególności organoidy nerek wykorzystano do badania uszkodzenia nerek wywołanego lekami (DIKI), które jest główną przyczyną ostrego uszkodzenia nerek [45]. W ocenie skutków ubocznych cisplatyny Czerniecki i wsp. (2018) wykazali, że organoidy nerkowe są pomocne jako modele o wysokiej wydajności do sprawdzania nowych leków pod kątem różnorodnej genetyki człowieka [46].

Inni, jak Wu i in. (2018) przeprowadzili izolację jąder i sekwencjonowanie snRNA, oprócz sekwencjonowania scRNA DropSeg w organoidach nerek. Oprócz poziomów RNA określono ilościowo różne poziomy białek i porównano je z lizatu organoidów nerkowych za pomocą immunoblotu (np. Cruz i in., 2017; Morais i in., 2022) [26,27]. Ponadto rutynowo przeprowadza się analizę immunocytochemiczną organoidów nerek w celu zbadania specyficznych struktur nefronów. Często przeprowadza się to w formie barwienia całych organoidów; alternatywnie do sondowania wykorzystywano również skrawki tkanek (np. Takasato i in., 2015; Cruz i in., 2017) (20,26). Badania te wykazały, że organoidy nerek wykazują kłębuszki, kanalik proksymalny, kanalik dystalny, błonę podstawną i układ przewodu zbiorczego (20,27). Ryc. 3 poniżej przedstawia przykład zatopionych w parafinie i podzielonych na kawałki organoidów ludzkiej nerki wygenerowanych przy użyciu protokołu Takasato i wsp. (2016). (12) Skrawek barwiono pod kątem kłębuszków, kanalików bliższych i dystalnych białka markerowe kanalików i wykazuje ciągłe struktury nefroniczne od kłębuszków do kanalików dystalnych. Oprócz tych struktur wiadomo, że organoidy nerki wykazują również układ naczyniowy, jednakże jest on ograniczony, szybko zanika i nie jest zorganizowany jak w typowej nerce (28).

Rycina 4. Podsumowanie sposobów wykorzystania organoidów nerek do modelowania choroby. Podsumowanie sposobów wykorzystania organoidów nerkowych do modelowania di