Wpływ Runing II na wzrost i przerzuty przeszczepionego guza u myszy z rakiem sutka i jego mechanizm

Cel:

Zbadanie wpływu Runing II (chińskiego preparatu ziołowego na raka sutka) na wzrost i przerzuty przeszczepionych guzów raka sutka MA-891-mających TA2 u myszy i jego mechanizmu. Metody: Opracowano model nowotworu przeszczepionego szczepu komórek raka sutka MA{2}} myszy TA2 z przerzutami do płuc w celu obserwacji wpływu Runing II na wzrost i przerzuty przeszczepionego guza. Metodę immunohistochemiczną i analizę obrazu zastosowano do wykrywania poziomów czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGFR), liczby mikronaczyń (MVC) i powierzchni mikronaczyń (MVA).

Wyniki: W grupie Running II stopień zahamowania masy guza i wskaźnik zahamowania przerzutów do płuc wyniósł odpowiednio 37,3% i 65,4%, wzrost guza i przerzuty do płuc były wyraźnie zahamowane; A poziomy VEGF i VEGFR, MVC i MVA były znacząco obniżone w porównaniu z tymi w grupie kontrolnej z nowotworem (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

Ponadto w tym samym czasie badań stwierdziliśmy, że jeżówka w Cistanche ma działanie przeciwnowotworowe. W celu zastosowania echinakozydu w lekach przeciwnowotworowych, niniejszy wynalazek najpierw dodaje MTH1, nieorganiczną pirofosfatazę i dGTP do roztworu reakcyjnego (100mM pH 8,0 Kwas Tris-octowy, 40 mM NaCl, 10 mM octan magnezu, 0,005 procent Tween20 i 1 mMDTT) W tej metodzie enzym i substrat inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie dodano 25 ul roztworu zieleni malachitowej w celu zakończenia reakcji. Absorbancję wykrywano przy 630 nm za pomocą czytnika mikropłytek BIO‑RAD iMark. Wyniki pokazały, że echinakozyd miał znaczący wpływ hamujący na aktywność enzymatyczną MTH1; Po drugie, wpływ echinakozydu na komórki nowotworowe na poziomie komórkowym wykryto w teście MTT, a wyniki wykazały, że echinakozyd może znacząco hamować wzrost komórek raka okrężnicy SW480 i komórek ludzkiego kostniakomięsaka U2OS, a niniejszy wynalazek hamuje wzrost echinakozydu MTH1, specyficzny enzym, który utrzymuje przeżycie w komórkach nowotworowych, prowadzi do włączenia utlenionych nukleotydów do DNA, powodując śmiertelne pęknięcia dwuniciowe DNA w komórkach nowotworowych, wywołując w ten sposób efekty przeciwnowotworowe. Nowa aplikacja medyczna położy podwaliny pod rozwój nowych leków przeciwnowotworowych w przyszłości.

Kliknij produkt z efektami cistanche

Słowa kluczowe:

guz sutka; angiogeneza; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF); Running II (chiński preparat ziołowy na raka sutka)

Rak sutka jest nowotworem złośliwym poważnie zagrażającym zdrowiu kobiet, a zapadalność na tę chorobę zajmuje pierwsze miejsce wśród nowotworów złośliwych u kobiet, z tendencją do wzrostu z roku na rok. Chociaż jego metody terapeutyczne poczyniły pewne postępy, wskaźnik długoterminowego przeżycia pacjentów z rakiem sutka nie został zwiększony z powodu inwazyjnego wzrostu i przerzutów guzów. Angiogeneza nowotworów jest podstawowym warunkiem wzrostu, inwazji i przerzutów nowotworów.

Dlatego hamowanie angiogenezy nowotworów jest skutecznym sposobem zapobiegania powstawaniu i rozwojowi nowotworów oraz przedłużania życia pacjenta.1 W niniejszym badaniu mechanizm chińskiego leku Running II o funkcjach uzupełniania qi i odżywiania yin, regulujące drogi przelotowe i naczynia zapłodnione, rozpuszczające masę i detoksykujące w hamowaniu nowotworu i przeciwdziałaniu przerzutom badano na podstawie angiogenezy i jej czynników regulacyjnych w przeszczepionym guzie raka sutka MA-891 myszy TA2 z przerzutami do płuc.

MATERIAŁY

Sześćdziesiąt samic myszy SPF TA2, ważących (20 ± 2) g, w wieku 6-8 tygodni, zakupiono z Wydziału Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Szczep komórek raka sutka MA{4}} myszy został dostarczony przez prof. Luo Liqina z Laboratorium Patologicznego Instytutu Nowotworów Chińskiej Akademii Nauk Medycznych.

Runing II składa się z Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren ( Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis) itp., w stosunku dawek 1,67:1,67:1,33:1,33:1,33:1,33:1,33:1, które sporządził wywar Sekcja Farmaceutyczna Szpitala Longhua, zgodnie z tradycyjną techniką i utrzymywana w temperaturze 4ć do użytku; Cyklofosfamid (CTX, 200 mg/ampułkę, numer oddziału: 981104) i tamoksyfen (TAM) zostały wyprodukowane przez firmę Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd.; Normalna sól fizjologiczna została wyprodukowana przez firmę Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

Przeciwciało poliklonalne czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) (rozcieńczenia robocze 1:25–1:50), receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGFR, rozcieńczenia robocze 1:30–1:50) i przeciwciało poliklonalne FVIIIAg (rozcieńczenie robocze 1:50) ) zostały zakupione od Santa Cruz Biotechnology Inc; Drugie przeciwciało EnVision, królicze przeciwciało przeciw szczurzemu VEGF, kozie przeciwciało przeciw króliczemu FVIII Ag i kozie przeciwciało przeciw króliczemu VEGFR oraz zestaw EnVision zakupiono od Dako Co., Dania; 3,3- diaminobenzydynę (DAB) zakupiono z Shanghai Huamei Bioengineering Factory.

METODY

Opracowanie modelu zwierzęcego

Model zwierzęcy został opracowany w oparciu o metody Luo i Gao, et al.2,3. Wyselekcjonowano hodowane in vitro komórki raka sutka MA-891 myszy w logarytmicznej fazie przeżycia i stężenie komórek regulowano jako 1x107/ml. W warunkach aseptycznych ssacze komórki rakowe zaszczepiono myszom TA2 podskórną część prawej pachy (0,2 ml/mysz, tj. 2x106 komórek/mysz).

Grupowanie zwierząt i sposoby podawania

Dwa dni po inokulacji myszy podzielono losowo na 4 grupy, po 15 myszy w każdej grupie. 1) Grupa kontrolna z nowotworem: 0,4 ml normalnej soli fizjologicznej podawano dożołądkowo, raz dziennie, pięć razy w tygodniu. 2) Grupa Wybieg II: Wybieg II rozcieńczono roztworem soli fizjologicznej i 0,4 ml tego rozcieńczenia odpowiadało 48 g·kg{{10}}·d{11}}, co obliczoną zgodnie z załączoną tabelą „Tabela przeliczeniowa między powierzchniami ciała ludzi i zwierząt” w „Metodologii badań nad farmakologią leków chińskich”4 podawano dożołądkowo, raz dziennie, pięć razy w tygodniu. 3) Grupa kontrolna CTX: O dawce stosowanej przez Jiang Bo, 5 CTX rozcieńczono normalną solą fizjologiczną i 0,4 ml odpowiadające 50 mg·kg{18}}·d{19}} podawany dożołądkowo, raz co drugi dzień, trzy razy w tygodniu. 4) Grupa kontrolna TAM: TAM rozcieńczono roztworem soli fizjologicznej i 0,4 ml odpowiadające 2,7 mg·kg{25}}·d{26}} podawano dożołądkowo, raz dziennie, pięć razy w tygodniu. Leki podawano przez 3 tygodnie we wszystkich czterech grupach.

Próbowanie

W 22 dniu po podaniu myszy uśmiercono przez zwichnięcie kręgów szyjnych i zważono. Następnie pobrano i odpowiednio zważono masę guza i płuca. Rzeczywista masa ciała myszy=ważona masa ciała – masa guza. Szare węzły na powierzchni płuc, tj. ogniska przerzutów, policzono gołym okiem. Masę guza umieszczono w 10% obojętnym roztworze formaldehydu w celu utrwalenia, a następnie zatopiono w parafinie, pocięto na ultracienkie skrawki, dwuetapowe naprężenie immunohistochemiczne Envision i oznaczono VEGF, VEGFR, liczbę mikronaczyń (MVC) i powierzchnię mikronaczyń (MVA).

Szybkość hamowania masy guza

Szybkość hamowania nowotworu=(średnia masa guza w grupie kontrolnej po leczeniu – średnia masa guza w grupie leczonej po leczeniu)/średnia masa guza w grupie kontrolnej po leczeniu × 100 procent.

Szybkość hamowania przerzutów do płuc

Szybkość hamowania przerzutów w płucach=(średnia liczba węzłów przerzutów w płucach grupy kontrolnej – średnia liczba węzłów przerzutów w płucach w grupie leczonej)/średnia liczba węzłów przerzutów w płucach w grupie kontrolnej x 100 procent.

Dwuetapowe barwienie immunohistochemiczne Envision

Pobrano skrawek parafiny o grubości 4 μm, a następnie rutynową deparafinę z ksylenem, odwodnienie gradientowe i przemycie PBS, 5 min x 3 razy; skrawek zanurzono w 0.01 mol/L, buforze cytrynianowym o pH 6,0, umieszczono w kuchence mikrofalowej o temperaturze 98°C na 10 minut w celu naprawy antygenowej i naturalnie ochłodzono do temperatury pokojowej po pobraniu z kuchenka mikrofalowa; nakraplanie pierwszego przeciwciała (odpowiednio wspomniane powyżej przeciwciało i rozcieńczenie odpowiedniego przeciwciała), 37ć, 90 min, przemycie PBS, 5 min x 3 razy; kapanie drugiego przeciwciała Envasion, w temperaturze pokojowej przez 60 min, przemywanie PBS, 5 min x 3 razy; kapanie świeżo przygotowanego roztworu wywoływacza DAB, kontrolowanie rozwijania się koloru przez 3–10 min pod mikroskopem, barwienie kontrastujące kampaniną przez 45 s, płukanie wodą wodociągową, suszenie dmuchawą, zamykanie neutralną gumą. Komórkę z cytoplazmą ziarnistości brązowo-żółtych lub czarno-brązowych uznano za dodatnią. Znany pozytywny skrawek raka sutka zastosowano jako kontrolę pozytywną, a ten, w którym bufor PBS zastąpił pierwsze przeciwciało, zastosowano jako kontrolę negatywną.

Analiza obrazu

Zastosowano kamerę wideo ACE (rozdzielczość 930 linii) oraz analizator obrazu LEICAQ500W i w pełni automatyczny system analizy obrazu LEICA. Pod mikroskopem x 200 wybrano losowo 2 pola widzenia w każdym skrawku do oznaczenia VEGF lub 3 pola widzenia do oznaczenia VEGFR i MVA, a następnie we wszystkich grupach obliczono procent pola dodatniego do całego pola widzenia . W celu oznaczenia MVC wybrano 5 regionów z najbogatszymi naczyniami krwionośnymi w każdym skrawku pod mikroskopem x 100, a następnie pod x 400 zliczono mikronaczynia w każdym polu widzenia 5 nienachodzących na siebie obszarów i zastosowano średnią jako średni licznik mikronaczyń (MVC) guza.

Metoda statystyczna

Zastosowano oprogramowanie SPSS8.{1}} i do porównania między współczynnikami zastosowano test chi-kwadrat, a do porównania średnich zastosowano test t lub jednokierunkową ANOVA.

WYNIKI

Hamujące nowotwory i przeciwprzerzutowe działanie Running II na przeszczepiony guz raka sutka u myszy MA-891-mających TA2 z przerzutami do płuc

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 procent, z istotną różnicą (oba P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

Wpływ Running II na ekspresję VEGF i VEGFR w przeszczepionym guzie myszy MA-891- z TA2

Jak pokazano w Tabeli 2, ekspresja VEGF i VEGFR zarówno w grupie Running II, jak i grupie kontrolnej CTX była znacznie niższa niż w grupie kontrolnej z nowotworem (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05), ekspresja VEGF była znacznie niższa niż w grupie kontrolnej TAM (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0.05), a ekspresja VEGFR była niższa niż w grupie kontrolnej z nowotworem (P<0.05).

Wpływ Running II na MVA i MVC przeszczepionego guza u myszy MA-891-mających TA2

Jak pokazano w Tabeli 3, poziomy MVA i MVC w przeszczepionym raku w grupach leczonych były znacznie niższe niż w grupie kontrolnej z nowotworem (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

DYSKUSJA

Tradycyjna medycyna chińska utrzymuje, że geneza i rozwój nowotworu jest wynikiem kompleksowego działania czynników idiopatycznych i empatycznych, ale z naciskiem na te pierwsze. W poprzednim badaniu klinicznym prof. Lu i Tang utrzymywali, że niedobór witalnej qi we wnętrzu oraz dysharmonia dróg przelotowych i naczyń poczęcia są głównymi przyczynami powstawania guzów, a wewnętrzna inwazja, przemieszczanie i rozprzestrzenianie się patogenów nowotworowych są głównymi warunkami rozwoju nowotworu. wzrost i przerzuty raka sutka.6 Dlatego w leczeniu zalecają odżywianie witalnej qi i usuwanie mas. Running II to chińska formuła ziołowa, która została podsumowana wieloletnią praktyką kliniczną zgodnie z zasadą leczenia polegającą na wzmocnieniu odporności organizmu w pierwszej kolejności i eliminacji czynników chorobotwórczych w drugiej kolejności. W formule Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii) są składnikami suwerennymi, o działaniu uzupełniającym qi i odżywiającym yin, regulującym naczynia krwionośne i naczynia poczęcia, co jest zgodne z powszechnie obserwowanymi cechami raka sutka, takimi jak niedobór zarówno qi, jak i yin oraz dysharmonia naczyń przelotowych i naczyń poczęcia. Klinicznie ta formuła osiąga oczywisty efekt wydłużenia czasu przeżycia, podniesienia jakości życia, stabilizacji ogniska nowotworowego i zapobiegania przerzutom raka.

W niniejszym badaniu ustalono model guza przeszczepionego szczepu komórek raka sutka MA-891 myszy TA2 z przerzutami do płuc i zaobserwowano wpływ Running II na wzrost guza litego i przerzuty do płuc oraz stwierdzono, że istniały znaczące różnice w guzie szybkość hamowania i szybkość hamowania przerzutów do płuc między grupą Running II a grupą z nowotworem oraz między grupą Running II a grupą kontrolną CTX, pokazując, że Running II ma oczywiste funkcje hamowania wzrostu guza i przeciwdziałania przerzutom. Ponadto tamoksyfen (TAM) nie ma oczywistej funkcji hamowania wzrostu guza i przeciwdziałania przerzutom u myszy modelowych, co jest podobne do wyniku, w którym rak sutka MA -891 jest szczepem komórek ER, a raport o bezpośrednim działaniu niskiego stężenia TAM za granicą.7

Guz jest typową chorobą zależną od naczyń krwionośnych, a jego wzrost, naciek i przerzuty zależą od angiogenezy. Jednocześnie neowaskularyzacja ponownie zapewnia kanał przerzutowy dla komórek nowotworowych, tworząc korzystne warunki dla wzrostu, przerzutów i rozprzestrzeniania się guza. 8,9 VEGF jest czynnikiem proangiogennym o najsilniejszym, unikalnym i specyficznym działaniu na komórki śródbłonka naczyń, a wiele komórek nowotworowych może wydzielać VEGF, który zwiększa przepuszczalność naczyń i bezpośrednio oddziałuje na komórki śródbłonka naczyń poprzez wiązanie się z receptorem VEGF, stymulując jego podział i proliferację, indukując angiogenezę guza i wpływając na liczbę mikronaczyń, w celu promowania wzrostu i przerzutów guza.10,11 Większość komórek nowotworowych wykazuje wysoką ekspresję VEGF, podczas gdy w prawidłowych tkankach tylko niewielka liczba narządów, takich jak nerka, jajnik itp. mają wyższą ekspresję VEGF. Dlatego niektórzy badacze uważają, że VEGF może być stosowany jako marker metabolizmu nowotworu i przerzutów,12 i bardziej idealny element docelowy blokowania neoangiogenezy w nowotworach,13 i zakłócania naczyniowych czynników regulacyjnych nowotworów i jego działającego ogniwa, regulującego ekspresję czynników angiogenezy, oraz hamowanie angiogenezy prawdopodobnie kontroluje wzrost i przerzuty nowotworu.

Wyniki niniejszego badania wskazują, że Runing II może zmniejszać ekspresję VEGF i VEGFR, aby prawdopodobnie blokować przewodzenie sygnału migracji i proliferacji komórek śródbłonka indukowanej przez VEGF, a ponadto hamować angiogenezę w nowotworach, a tym samym wywierać działanie przeciwnowotworowe i przeciw przerzutom .

Wcześniejsze badania wykazały, że w przebiegu wzrostu guzów złośliwych, zbyt szybki wzrost tkanki nieuchronnie indukował poważne niedotlenienie miejscowej tkanki, a niedotlenienie mogło stymulować syntezę mRNA VEGF i spowolnić degradację mRNA VEGF, indukując genezę duża liczba miejscowych nowych naczyń włosowatych.14,15 Obserwując dodatnie wyniki immunohistochemiczne komórek, autorzy stwierdzili wyraźną ekspresję VEGF w cytoplazmie obumierających martwiczych komórek nowotworowych, przeciwnie, mniejszą lub brak ekspresji VEGF w komórkach nowotworowych z aktywną proliferacją , co może być związane z wyższym poziomem czynnika indukującego anoksję w komórkach nowotworowych, zgodnie z raportem Talks KL i in.16 Running II zawiera Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae) itp., które aktywują krążenie krwi, rozpuszczają flegmę i usuwają zmętnienia. Hamują syntezę i wydzielanie VEGF prawdopodobnie poprzez poprawę miejscowego mikrokrążenia w guzie, zwiększenie dopływu tlenu do komórek nowotworowych, a tym samym hamowanie wzrostu guza w celu przeciwdziałania przerzutom.

BIBLIOGRAFIA

1. Folkman J. Angiogeneza i rak piersi. J Clin Oncol 1994; 12: 441-443.

2. Folkman J. Badania nad angiogenezą: od laboratorium do kliniki. Forum (Genua) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. Ekspresja czynnika przepuszczalności naczyń wpływa na angiogenezę guza w liniach ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka nagim myszom. Am J Pathol 1995; 5: 775-782.

4. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC i in. Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego jest rynkiem inwazji guza i przerzutów w rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi. Clin Cancer Res 1999; 5: 775-782.

5. Warren RS, Yuan H, Matli MR i in. Regulacja przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego przez niedotlenienie. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. Posttranskrypcyjna regulacja czynnika wzrostu śródbłonka naczyń przez niedotlenienie. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

7. Rozmowy KL, Turley H, Gatter KC i in. Ekspresja i dystrybucja czynników indukowanych niedotlenieniem HIF-1 alfa i HIF-2 alfa w normalnych tkankach ludzkich, nowotworach i makrofagach związanych z nowotworami. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com