Skuteczność i mechanizm ekstraktu Cistanches Herba w leczeniu dysfunkcji reprodukcyjnej u szczurów z niedoborem nerek-yang w oparciu o metabolomikę

AbstrakcyjnyTo badanie badaEfekt ochrony reprodukcyjnejIPotencjalny mechanizm ekstraktu Cistanches Herba(Che) na modelu szczuraNiedobór nerki-yangindukowane przez adeninę. Szczury zostały losowo podzielone na pięć grup: normalny, model, niska dawka che (0. 6 g · kg -1 · d -1), che (1,2 g · kg -1 · d -1) i l-carnitine (100 mg · kg -1 · d -1). Szczurom administrowano adeninę (200 mg · kg -1 · d -1) przez Gavage przez pierwsze 14 dni, aby wywołać niedobór Yang nerek, jednocześnie otrzymując leczenie narkotykami. Po 14 dniach modelowanie zostało przerwane, ale leczenie narkotyków trwało przez 49 dni. Zawartość komponentów w ChE analizowano za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC). Model niedoboru nerki indukowanego adeniną oceniono poprzez charakterystykę objawów i pomiar poziomów testosteronu (T) przy użyciu zestawu immunosorbentowego (ELISA). Patologiczne uszkodzenie jądra i najądrza oceniono na podstawie mokrej masy i wykonania barwienia hematoksylinowej-eozyny (HE). Gęstość i ruchliwość nasienia mierzono za pomocą analizy nasienia wspomaganej komputerowo (CASA), a żywotność plemników oceniono za pomocą zestawów do barwienia plemników żywych/martwych, a morfologię plemników oceniono za pomocą barwienia eozyny, określając w ten sposób jakość nasienia szczura. Metabolomi CS zastosowano do analizy zmian w metabolitach surowicy, wzbogaconych szlaków metabolicznych i zbadania mechanizmu ChE w poprawie uszkodzenia funkcji reprodukcyjnej u szczurów zZespół niedoboru nerki. W porównaniu z grupą normalną grupa modelowa wykazywała znaczącąObjawy niedoboru nerek, obniżone poziomy T, zmniejszone mokre ciężary jąder i najądrzy oraz znaczące uszkodzenie patologiczne jądra i nabłowoństwa. Gęstość, ruchliwość i żywotność nasienia, ze zwiększoną szybkością nieprawidłowości plemników. Natomiast szczury leczone CHE wykazały znaczną poprawę objawów niedoboru nerek-yang, przywrócone poziomy T, złagodzone uszkodzenie patologiczne jądra i najądrza oraz poprawiły różne parametry nasienia. Wyniki metabolomiki ujawniły 286 różnicowych metabolitów między grupami normalnymi i modelowymi (191 regulowane w górę i 95 w dół). Zidentyfikowano siedemdziesiąt pięć różnicowych metabolitów między modelami modelowymi i niskimi dawkami (21 regulowanych w górę i 54 w dół). W trzech grupach zidentyfikowano 24 wspólne różnicowe metabolity, a 22 z tych metabolitów wykazywało przeciwne trendy regulacyjne między dwiema grupami porównawczymi. Te metabolity były przede wszystkim zaangażowane w metabolizm kwasu linolowego, metabolizm lipidów eterowych oraz kwas pantotenowy i koenzym biosyntezy, a także metabolity, w tym 13- kwas wodoroksylinolowy (13- hpode), lizofosfatydyny i presetetyny. CHE może poprawić objawy niedoboru nerek u szczurów, złagodzić uszkodzenie narządów rozrodczych i zwiększyć jakość nasienia. Regulacja metabolizmu lipidów może być potencjalnym mechanizmem, dzięki którym ChE poprawia funkcję reprodukcyjną u szczurówNiedobór nerki-yang. Potencjalne bioaktywne związki Che obejmująEchinaakozyd, werbasków, salidrozid, betaina i cistanosid A.

 

Słowa kluczowe Ekstrakt Cistanches Herba; Niedobór nerki-yang; oligasthenospermia; adenine; metabolom; Metabolizm lipidów

 

 

Podróż klientówo Cistanche w celu poprawy funkcji reprodukcyjnej

 

 

 

Zespół niedoboru nerekjest rodzajem zespołu niedoboru, który spowodował niedobór Yang nerek, niepowodzeniem funkcji ocieplenia i niepowodzeniem transformacji Qi. Współczesna medycyna uważa, że ​​jest to choroba metaboliczna spowodowana zaburzeniami neuroendokrynnymi, w tym osi podwzgórze-przysadka (HPG). Pacjenci kliniczni zwykle wykazują objawy, takie jak zmniejszone libido, niska objętość nasienia, niska ruchliwość nasienia i ból dolnej części pleców. Ciężkie objawy mogą prowadzić do niepłodności i wad wrodzonych [1]. Rozgrzewanie nerki Yang jest podstawową metodą leczenia tradycyjnej medycyny chińskiej dla niepłodności męskiej spowodowanej niedoborem nerek [2]. Cistanche Deserticola to wysuszony mięsisty łodyga ze łuszczącymi liśćmi rośliny Cistanche Deserticola Ycma z rodziny Orobanchaceae. Wpływ tonizyny nerki Yang i korzyści esencji i krwi. Jest często stosowany w leczeniu niedoboru, impotencji i niepłodności nerek [3]. Według Statistics Cistanche Deserticola jest również najczęściej stosowanym lekiem w receptach tonikujących nerki i wytrzymałości na Yang na przestrzeni wieków [4]. Współczesne badania farmakologiczne potwierdziły, że ekstrakty takie jak glikozydy i oligosacharydy Cistanche Deserticola mogą regulować homeostazę osi HPG i osi podwzgórza-przysadka-nadnercza u szczurów z niedoborem nerek [[5]. Ekstrakt Cistanche Deserticola może również poprawić spermatogenezę i dysfunkcję seksualną u szczurów z niedoborem nerek Yang [6-7]. Jednak potencjalne mechanizmy tych efektów terapeutycznych nie zostały szczegółowo zbadane. Metabolomika dynamicznie łączy w ogóle zmiany metabolitów z procesami biologicznymi, ujawniając metaboliczny charakter procesów fizjologicznych i chorobowych oraz mechanizmów farmakodynamicznych leków. Ta holistyczna i dynamiczna cecha jest zgodna z koncepcją tradycyjnej medycyny chińskiej [8]. Dlatego w tym badaniu wykorzystano technologię metabolomiki do zbadania skuteczności i mechanizmu ekstraktu z pustynnej Cistanche w zakresie uszkodzeń funkcji reprodukcyjnej u szczurów z niedoborem nerek spowodowanego przez adeninę, oraz do wyjaśnienia nowoczesnej naukowej konotacji Cistanche Deserticola w tonizującym yang nerki.

1 materiały

1.1 Zwierzęta

50 SPF Klasa 9- tygodniowe szczury SD, ważenie 330-340 g, zakupiono od Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., numer licencji Scxk (Beijing) 2019-0008. Zwierzęta trzymano w pokoju zwierząt SPF w eksperymentalnym centrum zwierząt Instytutu Chińskiego Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, z naturalnym oświetleniem okołodobowym, stałą wilgotnością i temperaturą oraz bezpłatną dietą i aktywnością. Eksperyment na zwierzętach przejął etyczny przegląd eksperymentalnego dobrostanu zwierząt w Instytucie Chińskiego Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences (numer etyczny 2021B166).

 

1.2 Narkotyki

Plasterki Cistanche Deserticola zostały zakupione od Pekinu Tongrentang (sklep Chongwenmen), partii 1806016, i zostały zidentyfikowane przez Zhu Jingjing, badacz w Instytucie Chińskiej Materia Medica, Chin Academy of Chinese Medical Sciences, jako suszone mięsiste łodygi z skali liściami Cistache Eserticola, rodziny Orobanchea. Waż 500 g Cistanche Deserticola i dodaj
10 -krotność ilości 70% etanolu do ekstraktu refluksowego przez 2,5 godziny, filtruj, dodaj 8 razy większą ilość 70% etanolu do reszty i ekstraktu refluksowego przez 2,5 godziny, filtruj, połącz dwa filtraty i zmniejszyć ciśnienie, aby wysuszyć połączony ekstrakt do proszku. Wydajność suchego proszku wynosi 47%i przechowuje ją w stanie suchym.

1.3 Odczynniki

Echinakozyd, werbaskud, salidrozid, betaina, cistancheside A, tubulozyd A i kwas kofeinowy zakupiono od Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd., z liczbami partii Jot -10172, Jot -10007, Jot {2}, jot}, jot}, 3}, 3}, 3}, 3}, JOT -11356, JOT11627 i JOT -10196; Acetonitryl klasy chromatograficznej, metanol klasy chromatograficznej i kwas fosforowy o stopniu analitycznym zakupiono od Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., z liczbami partii SIGMA-WXBF1922V, SIGMA-WXBF2452V i 20240220, i 20240220, i 20240220,; Adenine zakupiono od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., z numerem partii S18009; L-carnityna (LC) zakupiono od Shenyang nr 1 Pharmaceutical Co., Ltd., z numerem partii 210372;
Zestawy wykrywania komórek Calcein/Pi i cytotoksyczność zakupiono od Beijing Biolab Technology Co., Ltd., numeru partii HR0444; Testosteron (T) enzymatyczny zestaw immunosorbent (ELISA) Zestaw zakupiono od Wuhan Elaruite Biotechnology Co., Ltd., numer E-EL -0155 C; Woda amoniaku została zakupiona od Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., partii numer 10002108; Roztwór barwienia hematoksylinowego-eozyny (HE) zakupiono od Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., numer partii BSBA -4025.

 

2.2 Analiza składników chemicznych ekstraktu z pustkowia Cistanche

2.2.1 Przygotowanie referencyjnego rozwiązania podstawowego

Dokładnie waży 10,41 mg salidrozdu, 11,19 mg echinakozydu, 10. 86 mg cistancheside A, 10,19 mg tubulozydu A, 10,28 mg werbascydu i 10,67 mg kwaśnego kwasu kofeinowego do 25 ml objętościowych objętościowych, Dodaj 50% metanol do Dissol i Diliut Saine, Shoy Toor do Yor uzyskać.

 

2.2.2 Przygotowanie mieszanego roztworu odniesienia

Dokładnie pipeta 1 ml odniesienia roztworu podstawowego salidrozdu, 5 ml echinakozydu, 2 ml cistancheside A, 100 μl tubulozyd A, 350 μl werbascydu i 100 μl kwasu kofeinowego do tego samego 25 ml płata objętościowego, dodaj wodę do rozcieńczania do skalowania, wytrząsając dobrze do uzyskania roztworu mieszanego. Dokładnie waży 12,24 mg betainy na 10 ml kolby objętościowej, dodaj 50% metanolu, aby rozpuścić i rozcieńczyć do znaku, dobrze wstrząsnąć i uzyskać roztwór odniesienia betainy.

2.2.3 Przygotowanie rozwiązania testowego

Dokładnie waży 310,14 mg próbki testowej na 25 ml kolby objętościowej, dodaj wodę, aby rozpuścić i rozcieńczyć do znaku, dobrze wstrząsnąć i filtruj.

 

2.2.4 Warunki chromatograficzne
Metoda wykrywania betainy: kolumna Xamide (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); mobilna faza acetonitrylowa-woda (80:20); temperatura kolumny 30 stopni; Szybkość przepływu 1 ml · min -1; Objętość wstrzyknięcia 10 μl.
Inne Warunki wykrywania komponentów: kolumna Kromasil 100-5- C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); acetonitryl fazy mobilnej (a)

i {{0}}. 1% Rozwiązanie kwasu fosforowego (b); temperatura kolumny 30 stopni; Szybkość przepływu 1 ml · min -1; Objętość wtrysku 10 μl, elucja gradientu (0 ~ 10 min, 10%A; 10 ~ 20 min, 10%~ 15%A; 20 ~ 25 min, 15%A; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%a).

 

2.3 Wykrywanie indeksu

2.3.1 Parametry dynamiczne nasienia najądrzy

Jamę brzuszną szczura wycięto w celu odsłonięcia lewego najądrza. Lewy ogon najądkowy szybko odcięto i umieszczono w 2 ml fenolu bez czerwonego pożywki hodowlanej DMEM podgrzano w 37-stopniowej kąpieli wodnej. Został wycięty na kawałki nożyczkami okulistycznymi, lekko wstrząśnięto i umieszczono w kąpieli wodnej o 37 stopni do inkubacji przez 10 minut, aby wszystkie plemniki wypłynąć z najądrza i przygotować zawieszenie nasienia. 10 μl zawiesiny nasienia upuszczono na szkiełka zliczającym nasienie, a technikę CASA zastosowano do obserwacji i rejestrowania gęstości plemników, średniej prędkości ścieżki (VAP), prędkości krzywiakowej (VCL), liniowości (LIN), WoBble (WOB), prostości (STR) i częstotliwości krzyżowejtej (BCF).

 

2.3.2 Motory i wskaźnik deformacji nasienia

Pipeta 20 μl świeżo przygotowanego zawiesiny nasienia w wstępnie przygotowanym jodku propidium (PI) (rozcieńczonym 3 000} Times) i Calcein-AM (rozcieńczonym 200-krotnym) roztworu barwienia, inkubuj w kąpieli wodnej 37-stopniowej przez 30 minut i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Policz całkowitą liczbę przeżywających nasienia i plemników przejściowych w każdym 200 nasieniach w różnych dziedzinach widzenia. Żywe plemniki: pod mikroskopem można zaobserwować pod mikroskopem głowę, korpus i ogon plemników. Przejściowe nasienie: głowica plemników jest czerwona fluorescencyjna, a ciało jest oczywiście zielone fluorescencyjne. W tym czasie nasienie znajduje się w okresie przejściowym śmierci. Martwa nasienie: Tylko głowa plemników jest czerwona fluorescencyjna, a całe ciało nie ma zielonej fluorescencji.
Weź 100 μl zawiesiny nasienia i umieść ją w 60 -stopniowym kąpieli wodnej do inaktywacji przez 10 minut, a następnie narysuj 5 μl i upuść na zjeżdżalnię, rozłóż równomiernie i wysuszyć, napraw za pomocą metanolu, zabarwiaj go barwnikiem eozynowym, spłucz go bieżącą wodą, pozwól jej stać i wysuszyć, sprawić, że jest przezroczysty z ksylenem i uszczelnić. Policz liczbę nieprawidłowych plemników w każdym 200 nasieniach w różnych polach pod mikroskopem i oblicz stosunek.

 

2.3.3 Patologiczne barwienie najądrzy i jądra

Po utrwaleniu w 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 48 godzin, najądrzy i tkanki jądra umieszczono w skrzynkach osadzających, odwodniono stopniowanym etanolem, osadzone w parafinie i pokrojono. Po zabarwieniu i nawodnieniu przeprowadzono go, a pod mikroskopem optycznym zaobserwowano zmiany patologiczne tkanek jądra i najądrza, w celu określenia stopnia zmian w strukturze kanalików nasiennych, zmiany w świetle najądowym i gęstość plemników.

 

2.3.4 Serum T zawartość

Po zbiorze krwi orbitalnej pozostawiono ją w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny, wirowano na 3 000 r · min -1 przez 20 minut, a supernatant został pobrany w celu wykrycia poziomu t w surowicy zgodnie z instrukcjami zestawu T.

 

2.4 Analiza metabolomiczna

2.4.1 Przygotowanie próbki surowicy

W dniu pobierania próbek szczury znieczulono, a pełną krew zebrano przez aortę brzucha. Krew utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny i wirowano na 3 000 r · min -1 dla 2 0 min. Supernatant podzielono na 2 ml rur wirówkowych z odpowiednimi liczbami i przechowywano w stopniu -80. Odwilż w 4 stopnie Przed testowaniem, wiru wymieszaj próbki, dokładnie przenieś 5 0 μl próbek surowicy do 0,5 ml rur EP, dodaj 300 μl 20% acetonitryl-metanol wewnętrzny standardowy ekstrakt, mieszanka vortex mieszanka Supernatant i umieść go w kolejnej czystej rurce 0,5 ml EP, pozwól jej stać w stopniu -20 przez 30 minut, a następnie wirować w 4 stopnie, 12 000 r · min -1 przez 3 minuty, weź 180 μl supernatantu do wstrzyknięcia.

 

2.4.2 Warunki chromatograficzne

Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 Kolumna (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 μm). Fazy ​​mobilne to 0. 1% kwas mrówkowy w wodzie (a) i 0,1% roztworu kwasu mrówkowego-acetonitrylowego (b), z elucją gradientową (0-11 min, 5% -90% b; 11-12 min, 90% b; 12-12. 12. 1-14 min, 5% b). Temperatura kolumny wynosiła 40 stopni, a szybkość przepływu wynosiła 0,40 ml · min -1.

 

2.4.3 Warunki spektrometrii masowej

Źródło jonów elektrorozpylania skanowano w trybach jonów dodatnich i ujemnych. Gaz natryskowy wynosił 50 psi (1 psi 6,895 kPa), pomocniczy gaz grzewczy wynosił 60 psi, gaz zasłony wynosił 35 psi, a temperatura źródła jonów wynosiła 550 stopni. W trybie dodatniej jonów napięcie jonizacji wynosiło 5 500 v, przyjęto tryb wysokiej wrażliwości, napięcie odkazania wynosiło 60 V, a energia zderzenia wynosiła 30 V. W trybie jonowym ujemnym, napięcie jonizacji wynosiło -4 500 v, napięcie odkształcającego wynosiło -60}, a energia jonizacji wynosiła {12} {{10}. Przyjęto tryb skanowania wrażliwości danych półilościowych.

 

2.4.4 Przetwarzanie i analiza danych

Surowe dane wykrywania LC-MS zostały przekształcone w format MZML za pomocą oprogramowania proteowizard, a pakiet oprogramowania XCMS zastosowano do korekcji szczytowej, wyrównania i retencji. Analiza regresji wektorowej (SVR) zastosowano do skorygowania powierzchni piku, a piki z brakującą szybkością przekraczającą 5 0% zostały przefiltrowane. Piki po badaniu zostały zintegrowane z biblioteką publiczną, bazę danych zbudowaną przez Wuhana Metwell Biotechnology Co., Ltd. i algorytm MetDNA w celu zidentyfikowania informacji strukturalnych metabolitów. Następnie pakiet R został użyty do przeprowadzenia jednoczynnikowej analizy statystycznej i wielowymiarowej analizy statystycznej przy użyciu metody testu t i ortogonalnej analizy dyskryminacyjnej najmniejszych kwadratów (OPLS-DA). Różnicowe warunki badań przesiewowych metabolitów zostały ustawione na zmienne znaczenie w projekcji (VIP)> 1, dwustronny test p <0. 05, a różnicowe metabolity uzyskane w tym stanie zostały adnotowane przy użyciu encyklopedii kioto genów i genomów (Kegg) złożonego danych danych Uzyskany identyfikator CPD _ został wprowadzony do strony internetowej Metabo Analyst 6.0
(https://www.metabaanalyst.ca/) do analizy wzbogacania. Do identyfikacji kluczowych ścieżek z znacznym wzbogacaniem zastosowano P testu hipergeometrycznego.

 

2.5 Analiza statystyczna

𝑥̅ ± S wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (𝑥̅ ± S) i zastosowano jednokierunkową analizę wariancji do porównania danych między wieloma grupami. P<0.05 was considered statistically significant.