Ocena i porównanie czterech ilościowych testów serologicznych SARS-CoV-2 u pacjentów z COVID-19 i uodpornionych zdrowych osób, pacjentów chorych na raka i pacjentów poddawanych terapii immunosupresyjnej

ABSTRAKCYJNY

Tło: Półilościowe i ilościowe testy immunologiczne są najczęściej stosowaną metodologią oceny odporności po immunizacji.

Cele: Porównanie czterech ilościowych testów serologicznych SARS-CoV-2 u pacjentów z COVID-19 i uodpornionych zdrowych osób, pacjentów chorych na raka i pacjentów poddawanych terapii immunosupresyjnej.

Projekt badania: Do utworzenia repozytorium próbek serologicznych wykorzystano 210 próbek serologicznych z kohort zakażonych-19 i szczepionych wirusem COVID{1}}. Metody serologiczne czterech producentów, a mianowicie Euroimmun, Roche, Abbott i DiaSorin, oceniano pod kątem ilościowych, półilościowych i jakościowych pomiarów przeciwciał. Wszystkie cztery metody mierzą przeciwciała IgG przeciwko domenie wiążącej receptor SARS-CoV-2 i podają wyniki w jednostkach przeciwciał wiążących/ml (BAU/mL). Jako kryteria określające, czy obie metody są klinicznie równoważne pod względem ilościowym, przyjęto dopuszczalny błąd całkowity (TEa) wynoszący ±25%. Wyniki półilościowe (miana) uzyskano, stosując numeryczne stężenie przeciwciał podzielone przez wartość odcięcia dla każdej metody. Wyniki: Wszystkie porównania ilościowe w parach wykazały niedopuszczalną wydajność. Przy ±25% jako TEa, najlepsza zgodność wyniosła 74 (35,2% z 210 próbek) pomiędzy firmami Euroimmun i DiaSorin, podczas gdy najniższa zgodność wyniosła 11 (5,2% z 210 próbek) pomiędzy firmami Euroimmun i Roche. Miana przeciwciał pomiędzy wszystkimi czterema metodami różniły się istotnie (p < 0,001). Największa różnica w mianie tej samej próbki występuje pomiędzy firmami Roche i DiaSorin i jest 1392-krotna. W porównaniu jakościowym żadne z porównań par nie wykazało akceptowalnego porównania (p < 0,001).

Wnioski: Istnieje słaba korelacja pomiędzy czterema ocenianymi testami, ilościowa, półilościowa i jakościowa. Aby uzyskać porównywalne pomiary, wymagana jest dalsza harmonizacja testów.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

1. Tło

Minęły ponad dwa lata od globalnej pandemii zakażenia SARS-CoV-2 i podano ponad dwanaście miliardów dawek szczepionek, a ponad 600 milionów ludzi zostało zarażonych-19 na całym świecie [1] . Health Canada (HC) i amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziły wiele szczepionek w celu uzyskania zezwolenia na użycie w sytuacjach awaryjnych (EUA), takich jak Moderna SpikeVax (mRNA-1273) i Pfizer-BioNTech Comirnaty (BNT162b2) [2, 3]. Koronawirusy mają cztery białka strukturalne: białko kolców (S), nukleokapsyd (N), białko otoczki (E) i białko błonowe (M) [4]. Białko S wystające z otoczki wirusa jest immunodominujące i składa się z dwóch podjednostek: białka S1, które zawiera domenę wiążącą receptor (RBD) i białka S2, które pośredniczy w fuzji błony komórkowej [5]. Dostępnych jest wiele platform testów serologicznych przeciwko różnym antygenom SARS-CoV-2, takim jak białko kolca (S) i białko nukleokapsydu (N).

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Testy immunologiczne, np. test immunoenzymatyczny (ELISA), są najczęściej stosowaną metodologią oceny odporności po immunizacji [6]. W przypadku większości innych szczepionek często wybiera się uniwersalną wartość odcięcia opartą na półilościowym lub ilościowym teście immunologicznym, aby określić ochronę i odporność [6]. Jak wykazano w przypadku szczepionki przeciwko różyczce, wartość odcięcia powinna być stale monitorowana i dostosowywana za pomocą dużych badań epidemiologicznych [7] i może różnić się w zależności od kraju [8]. Dlatego niezwykle ważne jest, aby wyniki uzyskane na różnych platformach analitycznych były porównywalne i umożliwiały prawidłowe określenie odporności zarówno po szczepieniu, jak i po zakażeniu. Krajowy Komitet Naukowców Laboratoryjnych Klinicznych (NCCLS) okresowo publikuje wytyczne dla laboratoriów klinicznych, aby prawidłowo raportować wyniki badań w zakresie odporności po osiągnięciu wysokiego poziomu zgodności pomiędzy różnymi platformami analitycznymi [7,9]. Wiadomo, że u zdrowych osób odpowiedź humoralna może znacznie wzrosnąć po podaniu dodatkowych dawek przypominających szczepionki SARS-CoV-2 [10]. Co więcej, odpowiedź humoralna po szczepieniu u osób z obniżoną odpornością jest słaba [11]. W rezultacie metody serologiczne zatwierdzone do użytku klinicznego muszą zapewniać dokładne wyniki w szerokim zakresie dynamiki przeciwciał, od niskiego do wysokiego zakresu.

Tabela 1 Charakterystyka badanej populacji.

2. Cele

Porównanie czterech ilościowych testów serologicznych SARS-CoV-2 u pacjentów z COVID-19 i uodpornionych osób zdrowych, pacjentów z nowotworem i pacjentów poddawanych terapii immunosupresyjnej, z wykorzystaniem próbek pobranych od pierwszej do czwartej dawki szczepionki. Oceniliśmy cztery testy serologiczne przeznaczone do użytku klinicznego w rozszerzonym zakresie dynamicznym (mierzalnym).

3. Projekt badania

3.1. Rekrutacja, próba i zbieranie danych

Uzyskano akceptację i zgodę instytucjonalnej komisji etyki od uczestników. Od maja 2021 r. do lipca 2022 r. do badania w Kingston w Ontario w Kanadzie włączaliśmy zdrowe osoby, pacjentów chorych na raka i pacjentów poddawanych terapii immunosupresyjnej po jednej do czterech dawek szczepionki przeciwko COVID-19. Pobrano również próbki surowicy od hospitalizowanych pacjentów z COVID-19, przyjętych do Centrum Nauk o Zdrowiu w Kingston w okresie od lutego 2021 r. do kwietnia 2022 r. Łącznie pobrano 210 próbek, w tym 82 próbki-19-z wynikiem pozytywnym na obecność wirusa COVID i 128 próbek od osób zaszczepionych. Ta ostatnia obejmuje 42 próbki od osób zdrowych, 44 od pacjentów chorych na nowotwory i 42 od pacjentów leczonych immunosupresyjnie (23 od pacjentów po przeszczepieniu nerki i 19 od pacjentów otrzymujących inną terapię immunosupresyjną). Terapia immunosupresyjna pacjentów po przeszczepieniu nerki obejmowała potrójną terapię inhibitorem kalcyneuryny (takrolimus lub cyklosporyna), lekiem antyproliferacyjnym (mykofenolan, azatiopryna, syrolimus lub ewerolimus) i kortykosteroidami. Zaszczepieni uczestnicy otrzymali BNT162b2, AZD1222, mRNA-1273 lub mieszaninę szczepionek od wielu producentów. Spośród 128 próbek krwi od zaszczepionych uczestników, 35, 70, 22 i 1 pobrano odpowiednio po pierwszej, drugiej, trzeciej i czwartej dawce immunizacji. Żaden uczestnik nie otrzymał szczepionki dwuwalentnej. U hospitalizowanych pacjentów z COVID-19 zakażenie potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)/analizy mutacji genowych przeprowadzonej w Kingston Health Sciences Center zgodnie ze standardowym protokołem. Do bazy danych Public Health Ontario zgłoszono zarówno pozytywne, jak i negatywne wyniki PCR.

Cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

3.2. Ilościowy, półilościowy i jakościowy pomiar przeciwciał

Oceniono cztery metody serologiczne, w tym Euroimmun Anti-SARS-CoV-2 QuantiVac ELISA (IgG) (numer produktu: EI 2606- 9601-10 G), Abbott Architect AdviseDx SARS-CoV-2 IgG II ( numer produktu: 6S60), Roche Elecsys Anti-SARS-CoV-2 S (numer produktu: 09289267190) i DiaSorin LIAISON SARS-CoV-2 TrimericS IgG (numer produktu: 311510). Technolodzy laboratoriów medycznych przeprowadzili badanie 210 próbek w trzech akademickich laboratoriach klinicznych. Testy przeprowadzono na instrumentach każdego producenta testów serologicznych, a mianowicie EUROIMMUN Analyzer 1, Abbott ARCHITECT, Roche Cobas e602 i DiaSorin LIAISON. Wszystkie wyniki podano w jednostkach przeciwciał wiążących/ml (BAU/ml). Wszystkie cztery metody mierzą przeciwciała IgG przeciwko domenie wiążącej receptor SARS-CoV-2 (S1). Półilościowe miano przeciwciał IgG przeciwko domenie wiążącej receptor szczytowy SARS-CoV-2 (S1) uzyskano z ilościowego pomiaru przeciwciał. Miano określono poprzez podzielenie ilościowych poziomów przeciwciał przez odpowiednie wartości odcięcia dla każdego producenta. Miana przeciwciał zaokrąglono do liczby całkowitej, a do porównania włączono te, które są większe niż 1. Ilościowe poziomy przeciwciał dla domeny SARS-CoV-2 S1 porównano z odpowiadającą im dodatnią wartością odcięcia, aby określić jakościowy wynik testu, dodatni lub ujemny. Test EUROIMMUN ma zakres graniczny (większy lub równy 25,6 do<35.2 BAU/mL); antibody results within the borderline range were excluded from the quantitative comparison. 

3.3. Prezentacja danych i analiza statystyczna

Prezentację danych i porównanie metod ilościowych przeprowadzono przy użyciu EP Evaluator 12 (Data Innovations LLC, Stany Zjednoczone). W oparciu o wspólne wymagania regulacyjne dotyczące testów immunologicznych jako kryterium określające, czy obie metody są klinicznie równoważne, wybrano dopuszczalny błąd całkowity (TEa) wynoszący ±25%. Analizę porównań półilościowych i ilościowych przeprowadzono przy użyciu programu SPSS Statistics (IBM SPSS Statistics, Stany Zjednoczone). Ustalono, że wszystkie grupy nie mają rozkładu normalnego (s< 0.001, Shapiro-Wilk normality test). The results were reported as medians and interquartile range (IQR). Friedman's and Pearson's Chi-Square tests were used to determine statistical significance between groups.

Tabela 2. Główna charakterystyka czterech ocenianych testów immunologicznych.

Ryc. 1. Porównania parami ilościowych testów serologicznych.

4. Wyniki

4.1. Charakterystyka badanej kohorty

Dane demograficzne i ilościowe poziomy przeciwciał uczestników badania podsumowano w Tabeli 1. Dane dotyczące kohorty zaszczepionej dodatkowo podzielono na osoby zdrowe, pacjentów chorych na raka i pacjentów poddawanych terapii immunosupresyjnej (IST). Pokazano zakres dynamiczny ilościowych poziomów przeciwciał IgG przeciwko SARS-CoV-2.

Ryc. 2. Porównanie parami zgodności półilościowych testów serologicznych.

4.2. Charakterystyka metod badań serologicznych

Główne cechy czterech metod testów serologicznych na obecność IgG przeciwko białku S1 SARS-CoV-2 podsumowano w Tabeli 2. Wszystkie cztery metody zostały zatwierdzone do stosowania przez HC do użytku klinicznego i FDA dla EUA. Trzej producenci ustalili pojedynczą wartość odcięcia reprezentującą serokonwersję, podczas gdy Euroimmun podaje zakres graniczny (większy lub równy 25,6 do<35.2 BAU/mL). 

4.3. Porównanie ilościowego pomiaru przeciwciał

Ryc. 1 przedstawia porównania czterech metod serologicznych na 210 próbkach, które obejmowały zarówno próbki zaszczepione, jak i próbki-19-dodatnie na obecność wirusa COVID. Wszystkie porównania parami wykazały niedopuszczalną zgodność, stosując jako kryterium TEa wynoszące ±25%. Najlepsza zgodność wyniosła 74 (35,2% z 210 próbek) pomiędzy Euroimmun i DiaSorin, natomiast najniższa zgodność wyniosła 11 (5,2% z 210 próbek) pomiędzy Euroimmun i Roche. Ryc. 1 pokazuje również model regresji liniowej (statystyki regresji Deminga) dla każdego porównania, z nachyleniem w zakresie od 1,3 do 7,6. Dalsza analiza oparta na osobnych próbkach zaszczepionych i-19-dodatnich na obecność wirusa SARS-CoV-2 wykazała podobne wyniki, które przedstawiono w danych uzupełniających.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

4.4. Porównanie półilościowego pomiaru przeciwciał 

Ryc. 2 przedstawia miana przeciwciał dla czterech metod serologicznych porównane parami, przy użyciu 210 próbek. Miano przeciwciał w każdej próbce obliczono poprzez liczbowe stężenie przeciwciał podzielone przez wartość odcięcia dla każdej metody. Miana przeciwciał pomiędzy wszystkimi czterema metodami różniły się istotnie (p < 0,001, test Friedmana). Największą różnicę w mianie tej samej próbki stwierdzono pomiędzy firmami Roche i DiaSorin, przy czym różnica była 1392-krotna. Dalsza analiza oparta na osobnych próbkach zaszczepionych i-19-dodatnich na obecność wirusa SARS-CoV-2 wykazała podobne wyniki, które przedstawiono w danych uzupełniających.

4,5. Porównanie jakościowego pomiaru przeciwciał

Jakościowe porównanie czterech metod badań serologicznych podsumowano w Tabeli 3. Spośród 173 próbek, w których stwierdzono doskonałą zgodność w zakresie wszystkich czterech metod serologicznych, 148 wyników było pozytywnych, a 25 było negatywnych. W 31 próbach nie było zgody co najmniej w jednej z czterech metod badawczych. Te rozbieżne próbki zostały następnie sklasyfikowane w oparciu o to, który test zapewnił odmienny wynik. Żadne z porównań par opartych na wynikach jakościowych nie wykazało zgodności (p < 0,001, test ChiSquare Pearsona).

Tabela 3. Umowa dotycząca jakościowego badania serologicznego przeciwciał.

5. Dyskusja

W oparciu o wiedzę zdobytą w ramach innych programów szczepień istnieje wiele markerów zastępczych umożliwiających określenie odporności. Należą do nich poziomy przeciwciał określone za pomocą testu immunologicznego, testu neutralizacji wirusów i bakterii, testu interferonu i testu hemaglutynacji [6]. Monitorowanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej na antygen wirusowy w laboratorium jest procedurą pracochłonną. Wykonuje się je wyłącznie w specjalistycznych laboratoriach, np. w laboratoriach zaawansowanych cytometrów przepływowych, a nie wykorzystuje się rutynowo w celach klinicznych. Natomiast wykrycie krążących przeciwciał można stosunkowo łatwo przeprowadzić przy użyciu wysokowydajnych testów serologicznych. Dlatego też test immunologiczny półilościowy (pomiar miana przeciwciał) i ilościowy (pomiar stężenia przeciwciał) jest najczęściej stosowaną metodologią oceny odporności po immunizacji [6].

Badania serologiczne są niezbędne do oceny skuteczności szczepienia przeciwko SARS CoV-2 [12,13]. Od początku pandemii COVID-19, a zwłaszcza po udostępnieniu na całym świecie szczepionek przeciwko SARS-CoV-2, opublikowano obszerną literaturę badawczą oceniającą humoralne odpowiedzi immunologiczne za pomocą różnych testów immunologicznych [12,13]. Wyniki różnych metod analitycznych powinny być porównywalne, aby właściwie zrozumieć wnioski płynące z różnych publikacji. Ponadto, aby wiarygodnie ocenić skuteczność szczepień przeciwko SARS-CoV-2 do celów klinicznych, kluczowe znaczenie ma opracowanie solidnych testów immunologicznych oraz przeprowadzenie szeroko zakrojonych porównań i standaryzacji metod. Gdy wymagany jest wysoki poziom zgodności między różnymi metodami, można wybrać punkt odcięcia oparty na półilościowych lub ilościowych testach na obecność SARS-CoV-2, aby zapewnić ochronę i odporność.

Nasze badanie wykazało słabą zgodność pomiędzy czterema metodami serologicznymi zatwierdzonymi do użytku klinicznego przez Health Canada i FDA, wyprodukowanymi przez Euroimmun, Abbott, Roche i DiaSorin. Ponieważ TEa nie jest jeszcze znana w odpowiedzi serologicznej na SARS-CoV-2, arbitralnie wybraliśmy ±25%, co jest powszechnie stosowane w innych testach immunologicznych. Stosując to kryterium, we wszystkich porównaniach pomiędzy dowolnymi dwiema metodami zaobserwowano słabą zgodność. Chociaż porównanie firm Euroimmun i DiaSorin jest lepsze niż jakiekolwiek inne porównania, jedynie 35,2% z 210 próbek uznano za dopuszczalne. Półilościowo, po przeliczeniu wyników ilościowych na miana poprzez podzielenie ilościowych poziomów przeciwciał przez odpowiednie wartości odcięcia każdego producenta, miana dowolnymi dwiema metodami różniły się znacząco (p < 0,001). Największa różnica w mianie występowała pomiędzy firmami Roche i DiaSorin i była 1392-krotna. Jest oczywiste, że obecnie dostępne metody serologiczne różnią się znacznie zarówno pod względem ilościowym, jak i półilościowym i nie mogą zapewnić wydajności wymaganej w rutynowym zastosowaniu klinicznym. Co więcej, gdy do wyników zastosowaliśmy wartości odcięcia serokonwersji i określiliśmy współczynniki dodatnie we wszystkich czterech metodach w 210 próbach, wystąpiły istotne różnice statystyczne (p < 0,001) w dowolnych dwóch porównywanych metodach.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

W listopadzie 2020 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) ustanowiła międzynarodowy standard i materiał referencyjny dla immunoglobuliny anty-SARSCoV-2 (kod NIBSC 20/136) [14]. Celem tego materiału referencyjnego jest ujednolicenie oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej po naturalnej infekcji lub szczepieniu. Wszystkie czwarte oceniane metody można powiązać z tym materiałem referencyjnym, a ich wyniki można podać w BAU/ml, jednostce zalecanej przez WHO. Euroimmun w swojej instrukcji podał korelację z tym materiałem referencyjnym z R2=0.99. Nie jest jasne, dlaczego w naszym badaniu zaobserwowano słabą zgodność. W lipcu 2022 r. WHO zapewniła drugi międzynarodowy standard immunoglobuliny-2 przeciw SARS-CoV oraz panel referencyjny dla przeciwciał przeciwko budzącym obawy wariantom SARS-CoV-2 [15]. Prawdopodobnie zastosowanie tego nowego materiału referencyjnego mogłoby poprawić zgodność pomiarów przeciwciał, szczególnie w przypadku próbek dodatnich pod względem wirusa COVID. Podsumowując, stwierdziliśmy słabą korelację pomiędzy wszystkimi ocenianymi testami, ilościową, półilościową i jakościową. Aby uzyskać porównywalne pomiary, wymagana jest dalsza harmonizacja testów.

Bibliografia

[1] Statystyki i badania dotyczące szczepień przeciwko koronawirusowi (COVID-19). https://ourworldindata.org/covid-vaccinations (dostęp: 3 sierpnia 2022 r.).

[2] Health Canada, Approved COVID-19 Vaccines (dostęp: 3 sierpnia 2022 r.). https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/ covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines.html.

[3] Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków, „COVID-19 Szczepionki” (dostęp: 3 sierpnia 2022 r.). https://www.fda.gov/emergency-preparedness-and-response/coronavirus-disease-2019-covid-19/covid-19-szczepionki.

[4] J. Cui, F. Li, Z.-L. Shi, Pochodzenie i ewolucja patogennych koronawirusów, Nat. Ks. Mikrobiol. 17 ust. 3 (2019) 181–192.

[5] H. Bisht, A. Roberts, L. Vogel, A. Bukreyev, PL Collins, BR Murphy, K. Subbarao, B. Moss, Severe ostrego zespołu oddechowego koronawirusowe białko kolcowe wyrażone przez atenuowany wirus krowianki ochronne immunizuje myszy, Proc . Natl. Acad. Nauka. USA 101 (17) (2004) 6641–6646.

[6] SA Plotkin, Korelaty ochrony wywołanej szczepieniem, Clin. Szczepionka Immunol. 17 (7) (2010) 1055–1065.

[7] Krajowy Komitet Naukowców z Laboratorium Klinicznego (NCCLS). Wykrywanie i oznaczanie ilościowe przeciwciał IgG przeciw różyczce w laboratorium klinicznym; Zatwierdzone wytyczne. 1997 Wayne, Pensylwania.

[8] Z. Gao, JG Wood, MA Burgess, RI Menzies, PB McIntyre, CR MacIntyre, Models of strategie for control of różyczka i wrodzony zespół różyczki – A 40-letnie doświadczenie z Australii, Vaccine 31 (4) (2013) 691–697.

[9] Krajowy Komitet Naukowców z Laboratorium Klinicznego (NCCLS). Kryteria oceny i działania wieloskładnikowych produktów testowych przeznaczonych do wykrywania i oznaczania ilościowego przeciwciał IgG przeciw różyczce, I/LA6-T, wstępne wytyczne. 1985 Wayne, Pensylwania.

[10] K. Macrae, CY Gong, P. Sheth, J. Martinez-Cajas, Y. Gong, Ilościowa analiza odpowiedzi serologicznych SARS-CoV-2 po trzech dawkach szczepienia i przed przełomowym zakażeniem wirusem COVID{{4 }} infekcje, Szczepionki 10 (10) (2022) s., https://doi.org/ 10.3390/vaccines10101590.

[11] A. Robinson, A. Mazurek, M. Xu, Y. Gong, Quantitative Analysis of SARS-CoV-2 status przeciwciał pomiędzy pacjentami chorymi na raka a osobami zdrowymi z wydłużonymi odstępami między dawkami szczepień w Kanadzie, Curr. Onkol. 29 (1) (2022) 68–76, https://doi.org/10.3390/curroncol29010006.

[12] PM Folegatti i wsp., Bezpieczeństwo i immunogenność szczepionki ChAdOx1 nCoV-19 przeciwko SARS-CoV-2: wstępny raport z fazy 1/2, z pojedynczą ślepą próbą, randomizowaną grupą kontrolną , Lancet 396 (10249) (2020) 467–478.

[13] LA Jackson, EJ Anderson, NG Rouphael, PC Roberts, M. Makhene, RN Coler, poseł McCullough, JD Chappell, MR Denison, LJ Stevens, AJ Pruijssers, A. McDermott, B. Flach, NA Doria-Rose, KS Corbett, KM Morabito, S. O'Dell, SD Schmidt, PA Swanson, M. Padilla, JR Mascola, KM Neuzil, H. Bennett, W. Sun, E. Peters, M. Makowski, J. Albert, K. Cross, W. Buchanan, R. Pikaart Tautges, JE Ledgerwood, BS Graham, JH Beigel, Wstępny raport dotyczący szczepionki mRNA przeciwko SARS-CoV-2 -, N. Engl. J. Med. 383 (20) (2020) 1920–1931.

[14] Mattiuzzo. i in. Utworzenie Międzynarodowego Standardu i Panelu Referencyjnego WHO dla przeciwciał anty-SARS-CoV-2.2020.(https://www.who.int/publications/m/item/WHO-BS-2020. 2403).

[15] WHO/BS/2022.2427: Utworzenie drugiego międzynarodowego standardu WHO dla immunoglobulin-2 przeciw SARS-CoV i panelu referencyjnego dla przeciwciał przeciwko budzącym obawy wariantom SARS CoV-2. https://www.who.int/publications/m/item/who-bs- 2022.2427 (dostęp: 30 listopada 2022 r.).