Ocena narażenia na azot amoniakalny w mechanizmach obronnych układu odpornościowego występujących w śledzionie i głowie nerki leszcza wuchang (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Abstrakcyjny:Amoniak jest jednym z najważniejszych czynników środowiskowych w ekosystemach wodnych. Jednakże istnieją ograniczone badania dotyczące skutków przewlekłego lub długotrwałego stresu amoniakalnego i jego potencjalnego mechanizmu molekularnego u ryb. Celem tego badania było zbadanie odpowiedzi immunologicznej i mechanizmów molekularnych w śledzionie i głowie-nerkach ryb po przewlekłej ekspozycji na amoniak.Amblycephala megalobrama(9.98 ± {{0}},48 g) poddano działaniu całkowitego azotu amonowego o różnym stężeniu (0–30 mg/l) przez 30 dni. Ekspozycja na amoniak spowodowała znaczny wzrost poziomu kortyzolu i zmniejszenie stężenia lizozymu i dopełniacza w 3/4 surowicy, co wskazuje na hamujący wpływ stresu amoniakalnego na wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Ekspozycja na amoniak powodowała także zależne od stężenia wzrosty stężeń amoniaku w tkankach, uszkodzenia patologiczne oraz wskaźniki śledziony i głowy-nerek. Dodatkowo zawartość immunoglobuliny M (IgM), interleukiny 1 (IL-1 ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF- ), jak również poziomy mRNA receptorów Toll-podobnych (TLR)/niezależnych cząsteczek sygnalizacyjnych czynnika różnicowania szpiku 88 (MyD88) w śledzionie i głowie-nerkach zostały znacznie obniżone po ekspozycji na amoniak. Nasze odkrycia sugerują, że przewlekła ekspozycja na amoniak powoduje tłumienie wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych poprzez regulację w dół niezależnej sygnalizacji TLR/MyD88-. Niekorzystne skutki przewlekłego stresu amoniakalnego były poważniejsze w śledzionie niż w nerce głowy.
Słowa kluczowe: amoniak; stres; receptory Toll-podobne; śledziona; głowa-nerka; odporność
KLIKNIJ TUTAJ, ABY POBRAĆ ZIOŁOWY CISTANCHE NA NERKI
1. Wstęp
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) czasami z powodu nieskutecznego lub nieistniejącego oczyszczania ścieków lub z innych powodów [9,10].
Udowodniono, że immunosupresyjne działanie amoniaku u ryb przyczynia się do wybuchów chorób [11,12]. W niektórych badaniach nad Takifugu rubripes, Scophtalmus maximus i Pelteobagrus fulvidraco wykazano, że ostra ekspozycja na amoniak może zwiększyć poziom ekspresji genów czynnika aktywującego komórki B, białka szoku cieplnego 70/90, tnf- i interleukiny- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang i in. podali również, że aktywność lizozymu w surowicy u Acanthopagrus schlegelii uległa znacznemu zmniejszeniu po 24 godzinach ekspozycji na amoniak [16]. Podobnie, obniżone poziomy mRNA dopełniacza C3 i IgM zaobserwowano w śledzionach Pelteobagrus vachellii i Rhynchocypris lagowski pod wpływem ostrej ekspozycji na amoniak [17,18]. Chociaż wiele uwagi poświęcono wpływowi ostrego narażenia na amoniak na odporność ryb, istnieją jedynie ograniczone badania dotyczące skutków przewlekłego lub długotrwałego stresu amoniaku i jego potencjalnego mechanizmu molekularnego. Ponadto niektórzy badacze donoszą o niekorzystnym wpływie azotu amonowego na ekspresję mRNA receptorów TLR na podstawie analizy transkrypcji [16,19–22]. W związku z tym stawiamy hipotezę, że utrzymująca się ekspozycja na amoniak może również wpływać na odporność ryb, w której szlak sygnałowy TLR może odgrywać ważną rolę.
Śledziona i nerka głowowa to główne narządy odpornościowe u teleostów, które są odpowiedzialne za wychwytywanie i usuwanie obcych cząstek oraz utrzymywanie stabilnego środowiska wewnętrznego [23,24]. Są także głównymi miejscami wytwarzania przeciwciał [25–27]. Dodatkowo u ryb wrodzony układ odpornościowy składa się z komórek stałych i ruchomych, a także szerokiego zakresu cząsteczek obronnych (takich jak lizozym, dopełniacz i cytokiny) [28,29]. Leszcz wuchang (Megalobrama amblycephala) to ryba karpiowata pochodząca z dorzecza Jangcy w Chinach, która w 2014 roku zajmowała 11. miejsce na świecie pod względem całkowitej rocznej produkcji tej ryby [30]. Jako główny gatunek akwakultury, M. amblycephala jest gatunkiem stosunkowo wrażliwym na azot amonowy i często cierpi na stres wywołany azotem amonowym [31–33]. W świetle powyższego przeprowadzono eksperyment z chronicznym narażeniem leszcza wuchang w celu wyjaśnienia cech odpowiedzi immunologicznych po przewlekłej ekspozycji na amoniak oraz mechanizmu stojącego za tymi skutkami poprzez wykrycie zmian w parametrach odpornościowych surowicy, histologii i cząsteczkach związanych ze szlakiem TLR w śledzionie i głowie-nerkach. Nasze wyniki sprzyjają również monitorowaniu stanu zdrowia i dobrostanu M. amblycephala w systemach intensywnej akwakultury.
2. Wyniki
2.1. Zawartość amoniaku w śledzionie i głowie-nerce
Rycina 1 przedstawia zawartość amoniaku w śledzionie i nerce głównej M. amblycephala po 30 dniach ekspozycji na różne poziomy amoniaku. Zaobserwowano istotny wzrost poziomu amoniaku w śledzionie ryb narażonych na działanie całkowitego azotu amonowego w ilości 30 mg/L w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,05). Nie stwierdzono statystycznej różnicy w stężeniu amoniaku w nerce głowy pomiędzy wszystkimi grupami leczonymi amoniakiem a grupą kontrolną (p > 0,05).
Rycina 1. Wpływ przewlekłej ekspozycji na amoniak na akumulację amoniaku w śledzionie i nerce głowy M. amblycephala. Każda kolumna reprezentuje średnią ± SE z sześciu duplikatów. Wartości p < 0.05 są reprezentowane jako „*” nad kolumną, co wskazuje, odpowiednio, na istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną.
2.2. Poziomy kortyzolu, lizozymu, C3 i C4 w surowicy
Jak pokazano na Rycinie 2, poziom kortyzolu w surowicy znacząco wzrósł we wszystkich grupach leczonych amoniakiem w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0.05). Przeciwnie, aktywność lizozymu w surowicy była znacząco obniżona u ryb narażonych na działanie wyższych stężeń amoniaku (20 i 30 mg/L całkowitego azotu amonowego) (p < 0,05). Poziomy dopełniacza C3 i C4 w surowicy były znacząco obniżone w grupach leczonych całkowitym azotem amonowym w stężeniu od 10 do 30 mg/l (p < 0,01).
Rycina 2. Wpływ przewlekłej ekspozycji na amoniak na poziom kortyzolu, lizozymu, C3 i C4(AD) w surowicy u M. amblycephala. Każda kolumna reprezentuje średnią + SE z sześciu duplikatów. Wartości p < 0.05 i 0.0l są reprezentowane jako „” i „” nad kolumną, wskazując odpowiednio istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną.
2.3. Indeksy narządów odporności
Zarówno wskaźniki śledziony, jak i głowy-nerki wzrastały wraz ze wzrostem całkowitego stężenia azotu amonowego po ekspozycji (ryc. 3). W porównaniu z grupą kontrolną wskaźnik śledziony był istotnie podwyższony u ryb leczonych wyższym całkowitym azotem amonowym (20 i 30 mg/L) (p < 0,05). Nie wykryto istotnej różnicy we wskaźniku głowa-nerka pomiędzy wszystkimi grupami leczonymi amoniakiem a grupą kontrolną (p > 0,05).
Rycina 3. Wpływ przewlekłego narażenia na amoniak na śledzionę (A) i wskaźniki głowa-nerka (B) u Mamblycephala. Wartości wyrażono jako Min. do Maks. (n=18). Wartości p < 0.05 i 0,01 są reprezentowane jako „” i „u” nad kolumną, wskazując odpowiednio istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną.
2.4. Ocena patologiczna
Śledziona leszcza wuchang w grupie kontrolnej wykazywała normalny wygląd z dużą liczbą erytrocytów i leukocytów (ryc. 4A). Po 30-dniowej ekspozycji na amoniak zaobserwowano nieznaczny wzrost liczby erytrocytów i pojawienie się centrów melano-makrofagów w śledzionie ryb narażonych na działanie całkowitego azotu amonowego w stężeniu 5 mg/l (ryc. 4B, tabela 1). Podobne, ale poważniejsze zmiany zaobserwowano u ryb leczonych całkowitym azotem amonowym w stężeniu od 10 do 30 mg/l, takie jak wzrost liczby i wielkości ośrodków czerniaka-makrofagów, a także znacznie zwiększona liczba erytrocytów (ryc. 4C, D). Ponadto wakuolizację cytoplazmy wykryto także w śledzionie ryb narażonych na działanie całkowitego azotu amonowego w stężeniu 30 mg/l (Figura 4E, Tabela 1).
Jeśli chodzi o głowę-nerkę, Rycina 5A przedstawia normalną strukturę tkanki głowy-nerki u ryb kontrolnych po narażeniu. Nie zaobserwowano żadnych wyraźnych objawów patologicznych w głowowej nerce ryb narażonych na działanie niższego całkowitego azotu amonowego (5 mg/l) (Rysunek 5B, Tabela 1). Nieznaczny wzrost liczby ośrodków czerniaka-makrofagów zaobserwowano u ryb narażonych na działanie całkowitego azotu amonowego w stężeniu 10 i 20 mg/l (ryc. 5C, D, tabela 1). Wielkość i liczba centrów czerniaka-makrofagów była zwiększona w grupie otrzymującej całkowity azot amonowy 30 mg/l (Figura 5E, Tabela 1).
2.5. Analiza parametrów odporności tkanek
Poziomy parametrów odporności wrodzonej (TNF-, IL-1) i parametrów odporności nabytej (IgM) w śledzionie i nerce głowy zmniejszyły się wraz ze wzrostem poziomów ekspozycji na amoniak (ryc. 6, tabela uzupełniająca S1). W śledzionie zawartość i poziomy mRNA TNF- i IgM były znacząco obniżone we wszystkich grupach leczonych amoniakiem w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0.{{10}}5). W międzyczasie zawartość IL-1 w śledzionie i poziomy ekspresji mRNA były znacząco obniżone u ryb narażonych na działanie całkowitego azotu amonowego przekraczającego 20 mg/l (p < 0,05). Natomiast jedynie zawartość i poziom mRNA IL-1, jak również poziom ekspresji tnf- w głowie-nerce były znacząco obniżone w grupach leczonych amoniakiem w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,05). Nie stwierdzono istotnych różnic w poziomie białka IgM i ekspresji genów oraz stężeniu TNF- w nerce głowy pomiędzy grupami leczonymi amoniakiem a grupą kontrolną (p > 0,05).
Rycina 6. Względne poziomy mRNA genów szlaku sygnałowego TLR, jak również zawartość TNF-, IL- 1 i IgM w śledzionie i głowie-nerce M. amblycephala. Wartości wyrażone jako średnie ± SE z sześciu duplikatów. igm: immunoglobulina M, il-1: interleukina 1, tnf-: czynnik martwicy nowotworu, jnk1: c-Jun N-końcowa kinaza1, erk1: zewnątrzkomórkowa regulowana kinaza białkowa 1, p38: aktywowana mitogenami kinaza białkowa p38, nf-κb1 /2: wiązanie genu czynnika jądrowego κ 1/2, pi3 k: kinaza 3-fosfatydyloinozytolu, akt: kinaza białkowa B, myd88: czynnik różnicowania szpiku 88, traf6: czynnik związany z receptorem czynnika martwicy nowotworu 6, tlr1 /2/3/4/5: receptor Toll-podobny 1/2/3/4/5. Wartości p < 0.05 i 0,01 są reprezentowane jako „*” i „**” nad kolumną, wskazując odpowiednio istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną
Aby wyjaśnić molekularny mechanizm przewlekłej toksyczności amoniaku na układ odpornościowy, określono zmiany transkrypcyjne kluczowych genów zaangażowanych w szlak sygnalizacyjny TLR wraz z poziomami TNF-, IL-1 i IgM. W śledzionie poziomy mRNA genów receptorów Toll-podobnych (tlr2, tlr4), genu związanego z niezależnym szlakiem MyD88-traft6, genu nf-κb2 związanego ze szlakiem sygnałowym NF-κB i genu erk1 związanego ze szlakiem sygnałowym MAPK były znacząco obniżone -regulowane w grupach leczonych amoniakiem w porównaniu z grupą kontrolną (p <{12}}.05), podczas gdy nie zaobserwowano znaczących zmian w ekspresji tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 i p38 a (p > 0.05). Podobnie poziomy transkrypcji tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 i jnk1 były istotnie czerwone, brak znaczących różnic w ekspresji tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 i p38 w głowie-nerce pomiędzy grupami leczonymi amoniakiem a grupą kontrolną (p > 0,05).
2.6. Analiza korelacji
Jak pokazano na rysunku 7 i tabeli dodatkowej S2, stężenie ekspozycji na amoniak było istotnie ujemnie skorelowane z zawartością TNF-, IL-1 i IgM, a także poziomami transkrypcji tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 i jnk1 w śledzionie. Tymczasem zawartość i poziomy transkrypcji śledzionowych TNF-, IL-1 i IgM wykazywały między sobą istotne dodatnie korelacje (p < 0.05). Stężenie IgM śledziony wykazało istotną dodatnią korelację z tlr2 i nf-кb2, a TNF- i IL-1 wykazywały istotnie dodatnie korelacje z tlr2, traf6 i nf-кb2 (p < 0.{{ 53}}5). Jednakże w nerce głowy poziomy narażenia na amoniak były jedynie znacząco ujemnie skorelowane z zawartością IL-1 i ekspresją genów tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 i erk1 (p < 0,05). IL-1 głowy nerki była dodatnio skorelowana z IgM, igm, il-1 , tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 i jnk1, podczas gdy IgM i TNF- wykazywały dodatnią korelację z odpowiednio p38 a i tlr2 (p < 0,05).
Rycina 7. Współczynniki korelacji Spearmana ® pomiędzy stężeniem narażenia na amoniak a parametrami immunologicznymi związanymi ze szlakiem sygnałowym TLR w śledzionie i głowie-nerce M. amblycephala po przewlekłej ekspozycji na amoniak. Wartości p < 0.05 i 0,01 są reprezentowane jako „*” i „**” nad kolumną, co wskazuje na istotne różnice w porównaniu z kontrolą, w odniesieniu
2.7. Indeksy IBR
Wartości IBR obliczono na podstawie standaryzowanych danych 22 biomarkerów w śledzionie i głowie-nerce leszcza wuchang przy różnych poziomach otaczającego amoniaku po 30-dniowym narażeniu (Tabela 2, Ryc. 8). Wraz ze wzrostem stężeń narażenia na amoniak wartości IBR wykazywały tendencję do zwiększania się zarówno w śledzionie, jak i nerce głównej. Wartości IBR były wyższe w śledzionie
Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kup więcej szczegółów specyfikacji:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
