Ocena transportu jelitowego ekstraktu bogatego w glikozydy fenyloetanoidowe z Cistanche Deserticola przez model jednowarstwowy komórek Caco-2

Wstęp

Linia komórkowa Caco-2, która została uzyskana z ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy, wykazuje cechy podobne do enterocytów. W normalnych warunkach komórki Caco-2 samoistnie różnicują się od komórek dojrzałych i tworzą nienaruszone monowarstwy. Sąsiednie komórki przylegają poprzez ścisłe połączenia utworzone po wierzchołkowej stronie monowarstwy, co może pasywnie rozróżniaći aktywnie transportuje leki przez warstwę nabłonkową. Ze względu na morfologiczne i biochemiczne podobieństwo do normalnych enterocytów, monowarstwy komórek Caco-2 służą jako dobrze przyjęty model in vitro do badania potencjału wchłaniania jelitowego i właściwości transportowych leków.

W przeciwieństwie do substancji chemicznych, ekstrakty roślinne (PE) są mieszaninami, których aktywność biologiczna i składniki aktywne często nie są dobrze zidentyfikowane. Ponadto właściwości PE w transporcie jelitowym, w przeciwieństwie do właściwości jego składników, są ściśle powiązane z zastosowaniem klinicznym. Pomiary strumienia próbki testowej przez monowarstwę komórek Caco-2 zwykle obejmują metody chemiczne, takie jak HPLC, LC/MS itp. Chociaż metody te są potężnymi narzędziami, są złożone, czasochłonne, drogie i czasami wymagają zaawansowanego sprzętu. Co ważniejsze, ani pojedynczy, ani mniejszościowy element nie może odzwierciedlać PE jako całości. Zatem należy opracować nowatorskie podejście, niezależne od określenia składników, aby zidentyfikować i ocenić właściwości transportowe PE.

Cistanche desericola YC Ma (CD), roślina holopasożytnicza, jest powszechną tradycyjną medycyną chińską stosowaną głównie w leczeniu niewydolności nerek, osłabienia organizmu i zaparć, a zastosowania te zostały oficjalnie odnotowane w Farmakopei Chińskiej.Glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), w tym echinakozyd (EC), akteozyd (AC) i izoakteozyd (IS) itp., stanowią klasę związków polifenolowych. Są uważane za jeden z głównych bioaktywnych składników gatunków Cistanche. Badania farmakologiczne wykazały, że bioaktywność PhG jest zróżnicowana i obejmuje działanie przeciwutleniające, przeciwzmęczeniowe, hepatoprotekcyjne, immunomodulujące, przeciwzapalne i neuroprotekcyjne. Jednakże nie zbadano właściwości transportu jelitowego PhG. W tym badaniu zbadaliśmy przepuszczalność jelitową ekstraktu bogatego w PhG (PRE) z CD jako zintegrowanego systemu oraz przepuszczalność trzech głównych PhG (AC, IS i EC) w zróżnicowanych komórkach Caco-2. Nasze wyniki wskazują, że PRE jest transportowany głównie poprzez słabo wchłanianą bierną dyfuzję w dół gradientu stężeń bez wypływu, co stanowi podstawę farmakokinetyczną dla klinicznego zastosowania PhG w CD.

Cistanche tubulosa extract

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiały i metody

Materiały

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) zakupiono od Must Biotechnology Co. (Chengdu, Chiny). Pożywka Eagle'a modyfikowana Dulbecco (DMEM), płodowa surowica bydlęca (FBS) i aminokwasy egzogenne (NEAA) zostały wyprodukowane przez firmę Gibco BRL (Grand Island, Nowy Jork, USA). Płytki TranswellTM z 6-studzienkami (powierzchnia wzrostu błony wstawki 4,67 cm2) otrzymano od Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Kolagen z ogona szczura otrzymano z firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Wszystkie odczynniki i substancje chemiczne do analizy HPLC były klasy analitycznej.

Przygotowanie PRE z płyty CD

Wysuszony na powietrzu materiał CD sproszkowano i ekstrahowano przez perkolację 70% etanolem. Frakcję bogatą w PhG przygotowano jak opisano wcześniej i ekstrahowano nasyconym wodą alkoholem n-butylowym. Ług ekstraktu zatężono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Spektrofotometria UV na makroporowatej żywicy zmierzyła zawartość PhG na poziomie 78,4%. Końcowa próbka reprezentowała 1,75% wydajności surowca w przeliczeniu na suchą masę. Otrzymaną próbkę przechowywano do czasu dalszego użycia w temperaturze -20 stopni.

Oznaczanie AC, IS i EC metodą HPLC

Do oznaczenia zawartości AC, IS i EC w PRE wykorzystano system Shimadzu HPLC wyposażony w oprogramowanie do rozwiązywania LC. Zastosowano kolumnę Intersil C18 z odwróconą fazą (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) i utrzymywano ją w temperaturze pokojowej. Fazami ruchomymi były acetonitryl i woda zawierająca 0,1% kwasu fosforowego (v/v) z elucją gradientową (Tabela 1) przy szybkości przepływu 1,0 ml/min. Detektor spektrofotometru UV ustawiono na 334 nm. Aby dokładnie określić strumień AC i IS, opracowaliśmy nowatorską metodę detekcji fluorescencyjnej HPLC (HPLC-FLD). Po analizie strukturalnej i skanowaniu długości fali fluorescencji (dane nie pokazane) uzyskaliśmy optymalne warunki detekcji fluorescencji dla AC (np.: 338 nm, Em: 448 nm) i IS (np.: 320 nm, Em: 434 nm).

Metodę analityczną HPLC sprawdzono, stosując następujące charakterystyki wydajności: stabilność, liniowość, czułość, precyzję (zmienność w ciągu dnia i między dniami) oraz dokładność. Anality w buforze transportowym przechowywano w temperaturze 25 stopni w ciemności przez 24 godziny i mierzono ich stabilność. Anality były wysoce stabilne w obecności witaminy C (0,4%), ponieważ wartości względnego odchylenia standardowego (RSD) w obszarach pików wynosiły < 3,5%. Równanie regresji liniowej, współczynnik korelacji, zakres liniowości, LOD i LOQ dla AC, IS i EC przedstawiono w tabeli 2. LOD (18–30 nM) i LOQ (60–100 nM) Wartości pokazują, że metody HPLC-FLD i HPLC-UV są bardzo czułe. Wszystkie wartości RSD wyrażające precyzję metody wynosiły < 2% dla zmienności w ciągu dnia i między dniami, co wskazuje na dobrą precyzję. W celu oceny odzysku do buforu transportowego dodano AC, IS i EC, aby uzyskać trzy poziomy stężeń (wysoki, średni i niski). Wartości odzysku analitów według metody podsumowano w Tabeli 3. Średnie odzyski mieściły się w zakresie od 90,0% do 96,4%, co wskazuje na dobrą dokładność. Podsumowując, ustalone metody HPLC są zadowalające pod względem liniowości, czułości, precyzji i dokładności w przypadku ilościowego oznaczania AC, IS i EC w buforze transportowym.

Oznaczanie PRE metodą testów biologicznych

Test biologiczny (całkowita zdolność przeciwutleniająca) został oparty na teście FRAP (siła redukcji żelaza/przeciwutleniacz), który opisaliśmy wcześniej [16] i został zweryfikowany pod względem liniowości i precyzji (zmienność w ciągu dnia i między dniami). Liniowość metody biologicznej określono na podstawie krzywych kalibracyjnych. Zakres stężeń liniowości wynosił 0.0625 - 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Precyzję ustalonej metody testu biologicznego określono na podstawie zmienności śród- i międzydniowej analizy PRE (10,0 µg/ml). Powtarzalność metody w ciągu dnia określono na podstawie pięciu kolejnych oznaczeń wykonanych tego samego dnia. Powtarzalność międzydniową mierzono na podstawie pięciu kolejnych oznaczeń w trzech różnych dniach. Wartości RSD dla precyzji metody wyniosły odpowiednio 1,014% i 4,72% dla zmienności wewnątrz- i międzydniowej, co wskazuje na dobrą precyzję. Zatem ustalona metoda testu biologicznego jest zadowalająca pod względem liniowości, precyzji i dokładności w zakresie ilościowego oznaczania PRE w buforze transportowym.

Hodowlę komórkową

Komórki Caco{{0}} hodowano w temperaturze 37 stopni i przy wilgotności względnej 95% w atmosferze zawierającej 5% CO2 i pożywce składającej się z DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutaminy, penicyliny (100 U/ml) i streptomycynę (100 ug/ml). Pożywkę zmieniano co drugi dzień podczas wzrostu i różnicowania komórek. Komórki hodowano w plastikowych kolbach o pojemności 75-cm2 i zbierano co 3–5 dni za pomocą 0,05% EDTA-trypsyny. Do eksperymentów związanych z transportem komórki wysiano przy gęstości 1 x 105 komórek/cm2 na wkładkach Transwell pokrytych kolagenem. Około 21 dni po wysianiu monowarstwy wykorzystano do doświadczeń transportowych. Ich integralność określono mierząc przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER) w poprzek monowarstw za pomocą EVOM wyposażonego w ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). Wartości TEER monowarstwy komórek Caco-2 musiały przekraczać 500 O∙cm2.

cistanche tubulosa extract

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA o działaniu łagodzącym i przeczyszczającym PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperymenty transportowe

Monowarstwę przemyto buforem transportowym (bufor P zawierający 10 mM HEPES, 1 mM pirogronian sodu, 10 mM glukozę, 3 mM CaCl2 i 145 mM NaCl, pH 7,4), a następnie inkubowano wstępnie przez 20 minut w 37 stopniach. Po usunięciu buforu transportowego do komory wierzchołkowej (AP) (1,5 ml) w badaniach kierunkowych AP do podstawno-bocznych (BL) lub komory BL (2,5 ml) w badaniach kierunkowych BL do AP dodano świeży bufor transportowy zawierający próbki testowe. W przypadku testów AC, IS i EC przy użyciu HPLC, porcję (300 ul) pobierano z każdej komory odbiorczej w różnych odstępach czasu (30, 60, 90 i 120 minut). Komorę odbiorczą uzupełniano taką samą objętością świeżego, podgrzanego (37 stopni) buforu transportowego po każdym pobraniu próbki. Pobrane próbki przechowywano w temperaturze -20 stopni do dalszego wykorzystania. Do oznaczenia PRE za pomocą testu biologicznego pobrano jedynie próbki po 120 minutach. Ze względu na niestabilność PRE, AC, IS i EC, dodano 0,4% (w/v) witaminy C w celu ustabilizowania próbek w celu określenia zawartości AC, IS i EC metodą HPLC, a próbki do testu biologicznego PRE oznaczane bezpośrednio po pobraniu próbki. Obliczono wartość pozornego współczynnika przepuszczalności (Papp lub 'Papp) każdej próbki.

Analiza danych

Wartości Papp w kierunkach AP BL lub BLAP AC, IS i EC obliczono w oparciu o następujące równanie: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), gdzie Papp jest pozornym współczynnikiem przepuszczalności (cm/s) określonym metodą HPLC. (4Q/4t) to szybkość pojawiania się badanego związku (AC, IS lub EC) po stronie odbiornika (μmol/s); A jest powierzchnią wkładki (cm2); C0 to początkowe stężenie badanego związku po stronie dawcy (µmol/ml). W szczególności przy obliczaniu wartości Papp zamiast „µmol” stosowano jednostkę masy „ug”. Dane wyrażono jako średnie ± SD.

Wyniki

Skład AC, IS i EC w PRE z CD

Ponieważ AC, IS i EC są uważane za główne substancje bioaktywnePhG z gatunku Cistanche, analizowaliśmy ich zawartość w PRE za pomocą HPLC-UV. Reprezentatywny chromatogram pokazano na rys. 1. Identyfikację tych składników przeprowadzono na podstawie porównania czasów retencji i widma UV z autentycznymi wzorcami przy długości fali 334 nm. Zawartość AC, IS i EC w PRE wynosiła odpowiednio 26,60%, 1,84% i 32,83%. Zatem te trzy związki stanowią 61,27% PRE; ponadto powyższe wyniki wskazują, że zawartość PhG w PRE wynosi 78,4%. Dlatego AC, IS i EC stanowią około 80% PhG w PRE.

Całkowite zdolności antyoksydacyjne PRE, AC, IS i EC

Studiadziałanie przeciwutleniające PhGz CD, a AC, IS i EC stanowią około 80% PhG w PRE. W związku z tym oznaczono całkowite zdolności przeciwutleniające PRE, AC, IS i EC i wyrażono je za pomocą wartości FRAP (× 10–6 mmol). Jak pokazano na ryc. 2, gdy wartość FRAP wynosiła 8 × 10–6 mmol, końcowe stężenia PRE, AC, IS i EC wynosiły 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml i 4,89 ug /ml, co wskazuje, że całkowita zdolność przeciwutleniająca tych czterech próbek była następująca: AC > EC > PRE > IS. Bioaktywność PRE przypisuje się grupom składników aktywnych (AIG). Dla około 60% PRE, AC i EC wykazały silniejsze całkowite działanie przeciwutleniające niż PRE i IS. Ponieważ IS (1,84%) stanowi bardzo małą część PRE, inne składniki, takie jak słabo przeciwutleniający IS, są również wyraźnie aktywne w PRE. Co zaskakujące, całkowita aktywność przeciwutleniająca różniła się prawie 7-krotnie między AC i jego izomerem IS, co wskazuje, że na działanie przeciwutleniające wpływa nie tylko liczba fenolowych grup hydroksylowych, ale także położenie fenolowych grup hydroksylowych w cząsteczce .

Walidacja monowarstw Caco-2

Aby zweryfikować system monowarstw komórek Caco-2, obliczono wartości Pappa dla propranololu (dobrze transportowanego markera) i żółcieni Lucyfera (słabo transportowany marker) z AP do BL przez monowarstwy Caco-2 określono odpowiednio na 1,51 × 10–5 cm/s i 2,8 × 10–7 cm/s i wartości te były zgodne z opublikowanymi w poprzednich raportach. Test aktywności fosfatazy alkalicznej potwierdził również, że monowarstwy komórek Caco-2 były jakościowo porównywalne z nabłonkiem jelita cienkiego.

Przepuszczalność AC, IS i EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1,0 × 10–5 cm/s), natomiast w przypadku leków słabo wchłaniających się były niskie (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion.

Przepuszczalność PRE

Powyższe wyniki wskazują, że całkowita zdolność przeciwutleniająca PRE wynika co najmniej z 61,27% AIG z PRE. W związku z tym oceniliśmy TR PRE w oparciu o krzywą stężenie-efekt całkowitej zdolności przeciwutleniającej i obliczyliśmy wartości Papp, aby odzwierciedlić charakterystykę transportową PRE. Wartości Papp PRE dla AP!BL i BL!AP wyniosły (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s i (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, co wskazuje, że związek ten był słabo przepuszczalny. Co więcej, wypływ lub aktywny transport nie były oczywiste, ponieważ stosunek 'Papp BL do AP / 'Papp AP do BL dla PRE wynosił 1,45. Co więcej, dwukierunkowy TR PRE wzrastał liniowo pomiędzy około 300 a 900 ug/ml (ryc. 5). Brak preferencji kierunkowej wyników sugeruje, że głównym mechanizmem transportu PRE jest dyfuzja bierna.

cistanche tubulosa extract

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY ODPORNOŚCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dyskusja

W porównaniu z wysoce oczyszczonymi produktami leczniczymi, PE jest na ogół mieszaniną składającą się z setek składników o bardzo różnych właściwościach fizykochemicznych. Dlatego PE wywiera systematyczne, wielokierunkowe i wielokanałowe działanie synergiczne ze względu na ich złożony AIG [21], co utrudnia analizę charakterystyk transportowych PE. Aby ocenić właściwości transportowe PE w sposób bardziej naukowy, niektórzy badacze zidentyfikowali w PE wiele składników, a nie pojedynczy składnik [22–24]. Niemniej jednak ograniczona liczba składników nie może odzwierciedlać PE jako całości. Jednakże określenie wszystkich składników w PE nie jest możliwe. Co więcej, jeśli różne komponenty PE wykazują zupełnie odmienne właściwości transportowe, trudno będzie zidentyfikować całościowe właściwości transportowe PE.

W latach 90. XX wieku do oceny TR środków przeciwdrobnoustrojowych stosowano systemy testów biologicznych [25]. Do 2005 roku Eguchi i jego współpracownicy [26] ocenili działanie przeciwutleniające ekstraktu z marchwi, stosując pożywki BL ze zróżnicowanych komórek Caco-2; podejście to jest bardziej odpowiednie do odzwierciedlenia sytuacji in vivo.

Na podstawie poprzedniego raportu na temat aktywności PhG i naszych wyników (ryc. 2), TR AIG w PRE można ocenić poprzez określenie całkowitej zdolności przeciwutleniającej ośrodka w komorze odbiorczej. Po eksperymentach z transportem odkryliśmy, że TR PRE był podobny w obu kierunkach, a transport ten był nienasycony i słabo absorbowany ('Papp < 1,0 × 10–6 cm/s) i nie wskazują na wypływ, co sugeruje, że bierna dyfuzja w dół gradientu stężeń jest głównym mechanizmem transportu PRE (ryc. 5). Ponadto właściwości transportowe PRE są zgodne z właściwościami AC, IS i EC, skutecznych składników wykazujących działanie przeciwutleniające w PRE (ryc. 4 i tabela 4). Wynik ten był oczekiwany i wskazywał, że niniejszy system testów biologicznych jest odpowiedni i niezawodny do oceny właściwości transportowych AIG w PRE w zróżnicowanych komórkach Caco-2.

W przeciwieństwie do kanonicznej wartości Papp, która jest powszechnie stosowana do odzwierciedlenia transportu pojedynczego związku, wartość Papp uzyskana z TR w oparciu o krzywą stężenie-efekt może nie tylko odzwierciedlać składniki przenikające przez monowarstwy o nienaruszonej strukturze, ale obejmują także inne czynniki związane z docelową aktywnością, takie jak metabolity składników, produkty rozkładu chemicznego, a nawet niektóre cytokiny wydzielane z komórek Caco-2 w odpowiedzi na stymulację, która może wpływać na docelową aktywność biologiczną. Zatem wspomniany powyżej wieloczynnik, a nie tylko transportowane nienaruszone komponenty, określa wartość Papp. Dlatego „Papp może korelować silniej z sytuacjami in vivo niż kanoniczna wartość Papp. W tym badaniu wyjaśniliśmy biernie rozproszony i słabo wchłaniany charakter PRE w oparciu o jego wartość Papp, a charakter ten może być związany z wysokimi dawkami i długim okresem leczenia klinicznego CD. Niemniej jednak odkrycia te zapewnią klinicystom bardziej systematyczne wytyczne dotyczące stosowania CD, gdy zidentyfikowano jedynie właściwości transportowe większości AIG w CD, a nie tylko PhG.

Jednakże wybrany element bioaktywności musi być wystarczająco czuły, aby można go było wykryć w pożywce komory odbiorczej, co stanowi wyzwanie dla opracowania systemu testów biologicznych oceniających właściwości transportowe PE. Ponadto bioaktywność powinna również zależeć od jak największej liczby składników. W naszym badaniu test całkowitej zdolności antyoksydacyjnej był bardziej odpowiedni niż kilka innych metod (ryc. S1). Ale mimo to nasz test może wykryć TR PRE jedynie po 120 minutach.

Podsumowując, w niniejszym badaniu ustanowiono nowatorski system testów biologicznych do oceny przepuszczalności jelitowej PRE w zróżnicowanych komórkach Caco-2. Uzyskane wyniki wykazały, że słabo wchłaniana bierna dyfuzja w dół gradientu stężeń bez wypływu jest głównym mechanizmem transportu PRE (ryc. 5), co stanowi podstawę farmakokinetyczną dla klinicznego zastosowania PhG w CD. Możliwe jest zastosowanie nowego systemu testów biologicznych do oceny TR i obliczenia w ten sposób wartości Papp w celu oceny właściwości AIG w PE w zakresie transportu jelitowego. Podejście to może być również odpowiednie dla innych PE, biorąc pod uwagę odpowiednią bioaktywność.