Doświadczenie 3 Wpływ glikozydu fenyloetanolowego Cistanche Deserticola na szczurzy model okołomenopauzalny Ⅲ

Doświadczenie 3 Wpływ glikozydu fenyloetanolowego Cistanche desericola na szczurzy model okołomenopauzalny

1 Materiały eksperymentalne

1.1 Zwierzęta doświadczalne

Szczury Wistar, klasa SPF, samice, dostarczone przez Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., numer certyfikatu szczura dla tej partii: 0017216; numer certyfikatu laboratorium SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Leki eksperymentalne

Glikozyd fenyloetanolowy Cistanche desericolaprzygotowano według metody z Eksperymentu 1, a zawartość osiągnęła 66,47%. Kapsułka Gengnian'an, składniki: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, kora piwonii, Poria cocos, masa perłowa, curculigo, Schisandra chinensis, magnetyt, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, pływająca pszenica, Polygonum multiflorum . Funkcje i wskazania:Odżywiaj yin i ujarzmij yang, złagodzić kłopotyi uspokoić umysł. Stosowany w przypadku uderzeń gorąca i pocenia się w okresie menopauzy, zawrotów głowy, szumów usznych, drażliwości i bezsenności. Dane techniczne: 0.3 g na kapsułkę. Sposób użycia i dawkowanie: Doustnie, jednorazowo 3 kapsułki, 3 razy dziennie. Producent: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Numer partii produkcyjnej: 121104. Numer zatwierdzenia: Krajowy numer zatwierdzenia leku Z14021848.

Izoflawony sojowe i kapsułki miękkie z witaminą E, skład: izoflawony sojowe w proszku, witamina E, olej słonecznikowy, żelatyna, gliceryna, woda, tartrazyna, dwutlenek tytanu. Kultowe składniki i zawartość: Każde 100 g zawiera 55,2 mg izoflawonów sojowych (w przeliczeniu na genisteinę) i 608,5 mg witaminy E. Funkcje zdrowotne: Zwiększają gęstość kości. Sposób użycia i dawkowanie: 1 kapsułka 2 razy dziennie popijając ciepłą wodą. Dane techniczne: 500 mg x 100 kapsułek. Producent: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Numer partii produkcyjnej: 13070302. Numer zatwierdzenia: National Food Health G20080032.

JAK DŁUGO DZIAŁA CISTANCHE?

1.3 Odczynniki eksperymentalne

Karboksymetyloceluloza sodowa, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., numer partii: 20120418; penicylina sodowa do wstrzykiwań, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specyfikacja: 4 miliony jednostek, numer partii produkcyjnej: c1206807;

Roztwór formaldehydu (analitycznie czysty), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., numer partii produkcyjnej: 20130902; 0,9% roztwór chlorku sodu do wstrzykiwań, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specyfikacja: 250ml, numer partii produkcyjnej: 13082405B;

Wodzian chloralu, Instytut Badań Chemicznych Fine Chemical Research Institute w Tianjin Guangfu, numer partii 20120827; Zestaw do wykrywania szczura E2 ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; Zestaw do wykrywania szczura T ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; Zestaw do wykrywania szczura LH ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; Zestaw do wykrywania szczurzego FSH ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A;

2 Metody eksperymentalne

2.1 Modelowanie i administracja lekami

Metoda modelowania: Weź 100 samicę szczura Wistar o masie ciała 210–230 g, losowo wybierz 12 szczurów jako grupę ślepą i poddaj pozorowanej operacji, a pozostałe szczury zostaną wykorzystane do wywołania menopauzy modele. Po zważeniu szczurów, szczury uśpiono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 10% wodzianu chloralu (0,3 ml/100 g) i ustawiono pozycję brzucha. Następnie szczurom wycięto spod ostatniego żebra na grzbiecie w miejscu przecięcia linii środkowo-pachowej i około 2 cm od bocznej strony kręgosłupa, a następnie zdezynfekowano. Skórę i mięśnie pleców nacina się na głębokość około 1 cm, w polu widzenia nacięcia widać mlecznobiałą, błyszczącą masę tłuszczową, w której osadzony jest jajnik. Za pomocą małej pęsety delikatnie chwyć masę tłuszczową i wyciągnij ją z nacięcia, oddziel masę tłuszczową, a zobaczysz grupę cienkich, nieregularnych, żółto-czerwonych jajników. Podczas cięcia należy najpierw podwiązać jajowód (wraz z tłuszczem) pod jajnikiem cienką nitką, całkowicie usunąć lewy jajnik i usunąć 80% prawego jajnika. Po operacji rogi macicy ponownie wprowadzono do jamy brzusznej, zaszyto mięśnie i skórę oraz w ten sam sposób usunięto oba jajniki. Po operacji zwierzęta ostrożnie hodowano i wstrzykiwano im domięśniowo 200000 u/kg penicyliny (po 0,1 ml), aby zapobiec infekcji, raz dziennie przez 3 kolejne dni. Po 5 dniach od operacji rozpoczęto badanie wymazów z pochwy szczurów, jeden po drugim, raz dziennie przez 5 kolejnych dni. Szczury z reakcjami rujowymi w rozmazie odrzucano. Wybrano 72 całkowicie wykastrowane szczury i losowo podzielono je na 6 grup. Do celów eksperymentalnych są to grupa modelowa, grupa Gengnianan, grupa izoflawonów sojowych oraz grupa glikozydów fenyloetanolowych Cistanche Deserticola o dużych, średnich i małych dawkach.

Metoda przygotowania: Metoda przygotowania: {{0}}.5% CMC Metoda przygotowania: Odważ 4 g karboksymetylocelulozy sodowej i wymieszaj z wodą destylowaną, aby uzyskać 800 ml. Dawki dużych, średnich i małych dawek grupy glikozydów fenyloetanolowych Cistanche desericola wynosiły odpowiednio 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg i 33,33 mg/kg (objętość podania 1 ml/100 g). Sposób przygotowania: Odważyć odpowiednio 1333,3 mg, 666,7 mg i 333,3 mg całkowitej zawartości flawonoidów malinowych, rozpuścić je w niewielkiej ilości 0,5% CMC, następnie uzupełnić objętość do 100 ml, dobrze wymieszać i gotowe. Gengniangan kapsułki (450 mg/kg, zmieszane z wodą destylowaną do 45 mg/ml, 1 ml/100 g, co odpowiada 10-krotności dawki klinicznej); Sposób przygotowania: Weź 15 kapsułek Gengniangan, najpierw rozpuść je w małej ilości 0,5% CMC, następnie dostosuj objętość do 100ml i dobrze wymieszaj, co odpowiada dawce zawiesiny kapsułek Gengnianan (450mg/kg). Kapsułki miękkie z izoflawonem sojowym i witaminą E (166,67 mg/kg, użyj wody destylowanej, aby uzyskać 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, co odpowiada 10-krotności dawki klinicznej); Sposób przygotowania: Weź 4 kapsułki miękkie zawierające izoflawony sojowe i witaminę E, najpierw rozpuść w małej ilości 0,5% CMC, następnie dostosuj objętość do 120 ml i dobrze wymieszaj, aby otrzymać dawkę zawiesiny kapsułek miękkich izoflawonów sojowych i witaminy E (16,67 mg/kg ).

Metoda podawania: zwierzętom w każdej grupie podano odpowiednie leki pierwszego0 dnia po operacji. Grupie ślepej i grupie modelowej podano przez zgłębnik tę samą objętość 0,5% roztworu CMC (objętość zgłębnika wynosiła 1 ml/100 g), a grupie Gengnianan podano przez zgłębnik zawiesinę kapsułek Gengnianan (450 mg/kg, co odpowiada 10-krotności dawki klinicznej). ). ), grupie otrzymującej izoflawony z soi podawano doustnie zawiesinę miękkich kapsułek z izoflawonem z soi i witaminą E (166,67 mg/kg, co odpowiada 10-krotności dawki klinicznej), a grupie otrzymującej dużą, średnią i małą dawkęGlikozyd fenyloetanolowy Cistanche desericolagrupom podawano doustnie, w zależności od grupy. Duże, średnie i małe dawki glikozydu fenyloetanolowego Cistanche desericola (dawki wynoszą odpowiednio 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg i 33,33 mg/kg, objętość dawki wynosi 1 ml/100 g), podawane raz dziennie dożołądkowo, w sposób ciągły . lek na 30 dni.

2.2 Elementy obserwacyjne i metody wykrywania

Oceny ruchu poziomego i pionowego szczurów w każdej grupie mierzono 29 dni po podaniu. 2 godziny po ostatnim podaniu do żołądka (15 godzin na czczo) usunąć gałki oczne w celu pobrania krwi, oddzielić surowicę iosoczei zmierzyć zawartość E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP w surowicy oraz zawartość -EP w osoczu; szczury zostały poddane sekcji. Usuń grasicę, śledzionę, macicę i pozostałe 20% tkanki jajnika, zważ ich mokrą masę i oblicz wskaźnik narządowy grasicy, śledziony i macicy (wskaźnik narządowy=mokrej masy narządu mg/masa szczura g) , a następnie usunąć mózg. Dla podwzgórza i przysadki mózgowej przygotowano homogenaty tkankowe z podwzgórza, przysadki mózgowej i 1/2 macicy oraz zawartość receptorów estrogenowych w podwzgórzu, przysadce mózgowej i homogenatach tkanki macicy oraz androgenu Oznaczono zawartość receptorów w homogenatach tkanki podwzgórza. Grasicę, śledzionę, macicę i jajnik utrwalono w 10% roztworze formaldehydu, zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki i wybarwiono HE. Thezmiany histomorfologicznew każdej grupie obserwowano pod mikroskopem świetlnym.

2.2.1 Badanie metodą otwartego pola

Urządzeniem doświadczalnym jest sześcienne otwarte pudełko o wysokości 40 cm i długości i szerokości 80 cm. Otaczające ściany i dno są czarne. Dno składa się z 25 bloków o równej powierzchni, rozdzielonych białymi liniami. Podczas eksperymentu szczura umieszczano w kwadracie pośrodku otwartego pudełka, a poziomą aktywność oceniano na podstawie liczby bloków, które szczur przekroczył na dnie w ciągu 5 minut (można policzyć kwadraty, w których wprowadzono wszystkie cztery łapy), oraz ile razy tylne kończyny stały w pozycji pionowej (dwie przednie łapy były w powietrzu). (lub przyleganie do ściany) wynik aktywności pionowej. Po każdym doświadczeniu należy całkowicie usunąć kał, a każdego szczura mierzono raz 2 godziny po podaniu. Ten eksperyment przeprowadzono w cichym pomieszczeniu.

2.2.2 Metoda określania zestawu

Pobieranie próbek surowicy: Używaj probówek wolnych od pirogenów i endotoksyn. Podczas operacji należy unikać stymulacji komórek. Po pobraniu krwi należy ją odwirować przy 3000 obr/min przez 10 minut, aby szybko i dokładnie oddzielić surowicę od czerwonych krwinek. Pobrać próbki osocza: antykoagulantem za pomocą probówek z antykoagulantem heparynowym. Wirować przy 3000 obr/min przez 30 minut i pobrać supernatant. Pobrać próbki homogenatu tkankowego: Dodać do tkanki odpowiednią ilość soli fizjologicznej i rozetrzeć. Wirować przy 3000 obr/min przez 10 minut i pobrać supernatant.

Metoda oznaczania zestawu ELISA szczura (szczura) estradiolu (E2) jest taka sama jak w eksperymencie 2. Stężenia standardów (S0-S5) wynoszą 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pmol/l.

Metoda oznaczenia zestawu Rat (szczur) testosteron (T) ELISA jest taka sama, jak metoda oznaczenia zestawu estradiol ELISA. Stężenia standardów (S{0}}S5) wynoszą {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 i 320 pg /ml. Metoda oznaczania zestawu do wykrywania hormonu luteinizującego (LH) szczura (szczura) ELISA jest taka sama, jak metoda oznaczania zestawu do wykrywania estradiolu ELISA. Stężenia standardów (S0-S5) wynoszą 0, 3, 6, 12, 24 i 48 ml/ml. Metoda oznaczenia zestawu ELISA dla hormonu folikulotropowego (FSH) szczura (szczura) jest taka sama, jak metoda testu dla zestawu ELISA na estradiol. Stężenia standardów (S0-S5) wynoszą 0, 0,75, 1,5, 3, 6 i 12 IU/l. Metoda oznaczania zestawu do wykrywania hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH) szczura (szczura) ELISA jest taka sama jak metoda oznaczania zestawu do wykrywania estradiolu ELISA. Stężenia standardów (S0-S5) wynoszą 0, 5, 10, 20, 40 i 80 mlU/ml.

Metoda oznaczania zestawu do wykrywania osteokalcyny szczura (BGP/OCN) ELISA jest taka sama jak metoda oznaczania zestawu do wykrywania estradiolu ELISA. Stężenia standardów (S{{0}}S5) wynoszą 0, 0,75, 1,5, 3, 6 i 12 ng/ml. Metoda oznaczania zestawu do wykrywania szczurzej (szczura) -endorfiny (-EP) ELISA jest taka sama, jak metoda oznaczania zestawu do wykrywania estradiolu ELISA. Stężenia standardów (S0-S5) wynoszą 0, 3, 6, 12, 24 i 48 pg/ml. Metoda oznaczania zestawu do wykrywania receptora estrogenowego (ER) szczura (szczura) ELISA jest taka sama, jak metoda oznaczania zestawu do wykrywania estradiolu ELISA. Stężenia standardów (S{{20}}S5) wynoszą 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pg/ml. Metoda oznaczania zestawu do wykrywania receptora androgenowego (AR) szczura (szczura) ELISA jest taka sama, jak metoda oznaczania zestawu do wykrywania estradiolu ELISA. Stężenia standardów (S0-S5) wynoszą 0, 25, 50, 100, 200 i 400 pg/ml.

2.3 Metody przetwarzania statystycznego

Do analizy danych wykorzystano pakiet statystyki medycznej SPSS17.0 do statystycznego przetwarzania danych. Dane pomiarowe wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (-x±s). Do porównania pomiędzy grupami wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji. Do sprawdzenia jednorodności wariancji wykorzystano metodę LSD. w przypadku nierównych wariancji zastosowano test Gamesa-Howella, a w przypadku danych o ocenach – test Ridita.

Z Tabeli 11 i Ryciny 14 można zobaczyć, że w porównaniu z grupą ślepą, wskaźnik grasicy, wskaźnik śledziony i wskaźnik macicy u szczurów w grupie modelowej uległy znacznemu zmniejszeniu (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Wpływ na poziomy wskaźników biochemicznych krwi u szczurów w okresie okołomenopauzalnym

Zawartość E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP w surowicy oraz zawartość -EP w osoczu szczurów w każdej grupie pokazano w Tabelach 12-13 i Figurach 15-17.

Z Tabeli 12–13 i Ryc. 15–18 można zobaczyć, że w porównaniu z grupą ślepą, poziomy E2 i T w surowicy szczurów w grupie modelowej były znacząco obniżone (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabela 14 Wpływ glikozydu fenyloetanolowego Cistanche desericola na poziomy GnRH i -EP w osoczu w szczurzym modelu okołomenopauzalnym (-x±s)

Z Tabeli 14 i Ryc. 19-20 można zobaczyć, że w porównaniu z grupą ślepą, poziom GnRH w surowicy szczurów w grupie modelowej był znacząco zwiększony, a poziom -EP w osoczu znacznie obniżony (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Wpływ na zawartość ER i AR w tkankach szczurów modelowych w okresie okołomenopauzalnym

Zawartość ER i AR w odpowiednich tkankach szczurów w każdej grupie pokazano w tabelach 16-17 i rycinach 22-23.

Z Tabeli 17 i Ryciny 23 wynika, że ​​w porównaniu z grupą ślepą poziom AR w podwzgórzu grupy modelowej był istotnie niższy (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Wpływ na morfologię tkanek narządów u szczurów w okresie okołomenopauzalnym

Wyniki obserwacji patologicznych i histologicznych macicy, grasicy i śledziony szczurów w każdej grupie doświadczalnej są następujące. Zdjęcia patologiczne przedstawiono w Załączniku 1, zawierającym zdjęcia patologiczne szczurów modelowych w okresie okołomenopauzalnym.

5.1 Wpływ na morfologię tkanki macicy u szczurów w okresie okołomenopauzalnym

W zależności od różnego stopnia zmian w endometrium, gruczołach i myometrium szczurów w każdej grupie doświadczalnej, zastosowano półilościowe standardy w celu podzielenia patologicznej morfologii tkanki na cztery poziomy i macice szczurów w każdej grupie doświadczalnej oznaczono wymierzony. Wyniki obserwacji przedstawiono w tabeli 18.

„-” Komórki nabłonka endometrium, gruczoły, myometrium i błona surowicza są w normie; „+” komórki nabłonka i gruczoły endometrium ulegają zanikowi, a myometrium i błona surowicza są w normie; "++" nabłonek endometrium Komórki i gruczoły są częściowo zaniknięte, warstwa mięśniowa jest nieznacznie zaniknięta, a błona surowicza jest prawidłowa; „+++” Komórki i gruczoły nabłonka endometrium ulegają znacznej atrofii, a błona surowicza jest prawidłowa.

Po teście Ridita z tabeli 18 wynika, że ​​w porównaniu z grupą ślepą macica szczurów w grupie modelowej wykazywała istotne zmiany patologiczne w tkankach (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Wpływ na morfologię tkanki jajnika u szczurów w okresie okołomenopauzalnym

W zależności od różnego stopnia zmian w pęcherzykach, ciałku żółtym, komórkach ziarnistych i naczyniach krwionośnych w jajnikach szczurów w każdej grupie eksperymentów, zastosowano półilościowe standardy w celu podziału patologicznej morfologii tkanki na cztery poziomy. Zmierzono i obserwowano jajniki szczurów w każdej grupie eksperymentów. Wyniki przedstawiono w tabeli 19.

Tabela 19 Wpływ glikozydu fenyloetanolowego Cistanche desericola na zmiany patologiczne w jajnikach u szczurów w okresie okołomenopauzalnym Jednostka: tylko

„-” może pokazywać rosnące pęcherzyki, dojrzałe pęcherzyki i ciałko żółte na wszystkich poziomach. Ciałko żółte jest dobrze rozwinięte, z wieloma warstwami komórek ziarnistych, bogatym płynem pęcherzykowym i bogatymi naczyniami krwionośnymi; „+” może pokazywać rosnące pęcherzyki, dojrzałe pęcherzyki i ciałko żółte, ale liczba dojrzałych pęcherzyków i ciałka żółtego jest niewielka. , pęcherzyki są mniejsze, a komórki ziarniste są mniej warstwowe; „++” może ukazywać dojrzałe pęcherzyki i ciałko żółte, z większą ilością ciałka żółtego, mniejszą liczbą komórek ziarnistych i mniejszą liczbą naczyń krwionośnych; „+++” nie ma pęcherzyków, ma więcej ciałka żółtego i jajnika Zanikowego, beznaczyniowego.

Po teście Ridita z Tabeli 19 wynika, że ​​w porównaniu z grupą ślepą, jajniki szczurów z grupy modelowej wykazywały istotne patologiczne zmiany w tkankach (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Wpływ na morfologię tkanki grasicy i śledziony u szczurów w okresie okołomenopauzalnym

Za pomocą mikrometru zmierz grubość najgrubszej i najwęższej części kory grasicy każdego szczura w każdej grupie doświadczalnej, aby uzyskać średnią; Użyj linii podstawowej mikrometru, aby opaść na guzki śledziony, zmierz grubość guzków śledziony po obu stronach z tętnicą centralną w środku i oblicz średnią. Zmierzone wyniki przedstawiono w Tabeli 20 i Rycinie 24.

Z Tabeli 20 i Ryciny 24 wynika, że ​​w porównaniu z grupą ślepą, grubość kory grasicy i objętość guzków śledziony w grupie modelowej uległy znacznemu zmniejszeniu (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).