Eksperyment 4 Wpływ glikozydu fenyloetanolowego Cistanche Deserticola na zespół okołomenopauzalny u myszy Model depresji Materiały i metody 1 Materiały doświadczalne
Apr 17, 2024
1.1 Zwierzęta doświadczalne
Myszy klasy SPF, rasa Kunming, samice, 18–22 g, dostarczone przez Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., numer certyfikatu tej partii myszy: 0016003; numer certyfikatu laboratorium SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Leki eksperymentalne
Glikozyd fenyloetanolu Cistancheprzygotowano według metody z Eksperymentu 1, a zawartość osiągnęła 66,47%. Kapsułka Gengnian'an, składniki: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, kora piwonii, Poria cocos, masa perłowa, curculigo, Schisandra chinensis, magnetyt, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, pływająca pszenica, Polygonum multiflorum . Funkcje i wskazania:Odżywiaj yin i ujarzmij yang, złagodzić kłopotyIuspokój umysł. Stosowany w przypadku uderzeń gorąca i pocenia się w okresie menopauzy, zawrotów głowy, szumów usznych, drażliwości i bezsenności. Dane techniczne: 0.3 g na kapsułkę. Sposób użycia i dawkowanie: Doustnie, jednorazowo 3 kapsułki, 3 razy dziennie. Producent: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Numer partii produkcyjnej: 121104. Numer zatwierdzenia: Krajowy numer zatwierdzenia leku Z14021848.
Izoflawony sojowe i kapsułki miękkie z witaminą E, skład: izoflawony sojowe w proszku, witamina E, olej słonecznikowy, żelatyna, gliceryna, woda, tartrazyna, dwutlenek tytanu. Kultowe składniki i zawartość: Każde 100 g zawiera 55,2 mg izoflawonów sojowych (w przeliczeniu na genisteinę) i 608,5 mg witaminy E. Funkcje zdrowotne: Zwiększają gęstość kości. Sposób użycia i dawkowanie: 1 kapsułka 2 razy dziennie popijając ciepłą wodą. Dane techniczne: 500 mg × 100 kapsułek. Producent: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Numer partii produkcyjnej: 13070302. Numer zatwierdzenia: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Odczynniki eksperymentalne
Karboksymetyloceluloza sodowa, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., numer partii: 20120418; penicylina sodowa do wstrzykiwań, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specyfikacja: 4 miliony jednostek, numer partii produkcyjnej: c1206807; roztwór formaldehydu (stopień analityczny), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., numer partii produkcyjnej: 20130902; 0,9% roztwór chlorku sodu do wstrzykiwań, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; specyfikacja: 250ml, numer partii produkcyjnej: 1301265303;
Wodzian chloralu, Instytut Badań Chemicznych Fine Chemical Research Institute w Tianjin Guangfu, numer partii 20120827; zestaw do wykrywania myszy E2 ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; zestaw do wykrywania myszy T ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; Zestaw do wykrywania mysiego LH ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; Zestaw do wykrywania myszy FSH ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A;
Zestaw do wykrywania myszy DA ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A; Mysz 5-Zestaw do wykrywania HT ELISA, firma badawczo-rozwojowa, numer partii: 20140101A. 1.4 Instrumenty eksperymentalne
Waga elektroniczna, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., model: JY601; elektroniczna waga analityczna firmy Ohaus (Shanghai), model: AR1140/C; szybka wirówka stołowa, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, model: TGL-168 ; Elektryczna termostatyczna łaźnia wodna, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., model: HWS12; Tester aktywności autonomicznej myszy, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: ZZ-6; Miernik unikania ciemności przez mysz, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: BA-200; tester zawieszenia ogonowego, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: TS-200; szybkoobrotowa wirówka z chłodzeniem, oddział HKUST Innovation Co., Ltd. w Zhongjia, model: KDC-160HR; regulowany przyrząd do pipetowania, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;
Czytnik mikropłytek amerykańskiej firmy BIO-RAD, model: 680;
Mikroskop elektryczny, japońska firma OLYMPUS, model: BX61.
2 Metody eksperymentalne
2.1 Modelowanie i podawanie leków
Wybrano 90 samic myszy Kunming o masie ciała 23-25 g, a 10 wybrano losowo jako grupę ślepą i poddano pozorowanej operacji, a pozostałe myszy wykorzystano do stworzenia modele okołomenopauzalne. Po zważeniu myszy znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 10% wodzianu chloralu (0,03 ml/10 g) i ustawiono pozycję brzucha. Następnie obcięto sierść z grzbietu myszy pod ostatnim żebrem, w miejscu przecięcia linii środkowej pachy i około 1 cm od zewnętrznej strony kręgosłupa, a następnie nacięto po dezynfekcji. Szerokość skóry i mięśni pleców wynosi około 0,5-1cm. W polu nacięcia widać mlecznobiałą, błyszczącą masę tłuszczową, w której osadzony jest jajnik. Za pomocą małej pęsety delikatnie chwyć masę tłuszczową i wyciągnij ją z nacięcia, oddziel masę tłuszczową, a zobaczysz grupę cienkich, nieregularnych, żółto-czerwonych jajników. Podczas cięcia należy najpierw podwiązać jajowody (w tym tłuszcz) pod jajnikami cienkimi nitkami, a następnie usunąć jajniki. Po operacji rogi macicy umieszcza się z powrotem w jamie brzusznej, zszywa mięśnie i skórę oraz w ten sam sposób usuwa się oba jajniki. Po operacji zwierzęta ostrożnie hodowano i raz dziennie wstrzykiwano domięśniowo penicylinę w dawce 200000 u/kg (po 0,1 ml) w celu zapobiegania infekcji przez 3 kolejne dni. Po 5 dniach od operacji u każdej myszy raz dziennie przez 5 kolejnych dni wykonywano po kolei badanie wymazu z pochwy w celu sprawdzenia, czy jajniki zostały całkowicie usunięte. Myszy wykazujące reakcję rujową w rozmazie odrzucono, a 60 całkowicie wykastrowanych myszy losowo i równomiernie podzielono na 6 grup do celów eksperymentalnych, mianowicie grupę modelową, grupę Mengnianana, grupę izoflawonów sojowych, duże, średnie iGrupa niskodawkowa Cistanche fenyloetanologlikozydowa. Zwierzętom w każdej grupie podano odpowiednie leki 10 dnia po operacji. Po 6 dniach podawania myszy w grupie ślepej hodowano w ilości 5 sztuk na klatkę, z normalnym pożywieniem i wodą, bez żadnej stymulacji. Wszystkie 6 grup modelowych hodowano w liczbie 1 myszy na klatkę i każdego dnia podawano losowo różne stymulacje. W ciągu 18 dni losowo zastosowano siedem czynników stresowych: wilgotna ściółka (1 g ściółki/1 ml wody); pływanie w lodowatej wodzie (4 stopnie, 5 min); stres cieplny (45 stopni, 5 min); oświetlenie nocne (24h); zaciskanie ogona (1 min); pozbawienie wody (24 h); na czczo (24h). Bodziec podawano losowo każdego dnia i żaden bodziec nie mógł pojawiać się w sposób ciągły przez 18 dni.
Metoda przygotowania: 0.5% CMC Metoda przygotowania: Odważ 4 g karboksymetylocelulozy sodowej i wymieszaj z wodą destylowaną, aby uzyskać 800 ml.
Dawki dużych, średnich i małych dawek grupy glikozydów fenyloetanolowych Cistanche wynosiły 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg i Odpowiednio 50mg/kg (objętość podawania 0,1ml/10g). Sposób przygotowania: Odważ odpowiednio 2000 mg, 1000 mg i 500 mg glikozydu fenyloetanoidowego Cistanche, rozpuść je w niewielkiej ilości 0,5% CMC, następnie dostosuj objętość do 100 ml, dobrze wymieszaj i gotowe. Gengniangan Capsules (675 mg/kg, zmieszane z wodą destylowaną do 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, co odpowiada 15-krotności dawki klinicznej); sposób przygotowania: weź 9 kapsułek Gengniangan, najpierw użyj małej ilości 0,5% CMC Dissolve, następnie dostosuj objętość do 40ml i dobrze wymieszaj, aby otrzymać dawkę zawiesiny kapsułek Gengnianan (675mg/kg). Kapsułka miękka z izoflawonem sojowym i witaminą E (250 mg/kg, użyj wody destylowanej, aby uzyskać 25 mg/ml, 0,1 ml/10 g, co odpowiada 15-krotności dawki klinicznej); Sposób przygotowania: Weź 2 kapsułki miękkie z izoflawonem sojowym i witaminą E, użyj najpierw. Rozpuść niewielką ilość 0,5% CMC, następnie dostosuj objętość do 40 ml i dobrze wymieszaj, aby uzyskać dawkę zawiesiny kapsułek miękkich z izoflawonem sojowym i witaminą E (250 mg/kg). ). Sposób przechowywania: przechowywać w lodówce, podczas stosowania utrzymywać w cieple.
Sposób podawania: Zwierzętom w każdej grupie podano odpowiednie leki 10 dnia po zabiegu. Grupie Gengnian'an podano doustnie Gengnian'an zawiesinę kapsułek w dawce 675 mg·kg-1, grupie izoflawonów sojowych podano doustnie 250 mg·kg-1 zawiesiny miękkich kapsułek izoflawonu sojowego i witaminy E, a grupie dużej, średnie imałe dawki Cistanchefenyloetanol. Grupie glikozydów podano doustnie duże, średnie i małe dawki glikozydu fenyloetanolowego Cistanche 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, odpowiednio 0,1 ml/10 g. Grupie ślepej i grupie modelowej podawano przez sondę tę samą objętość 0,5% roztworu CMC raz dziennie przez 30 kolejnych dni.
2.2 Elementy obserwacyjne i metody wykrywania
Przymusowe pływanie: Pierwszego dnia po zakończeniu chronicznej stymulacji stresem mierzono czas bezruchu myszy w każdej grupie w ciągu 6 minut przez 2-6 minut. (Włóż myszy z każdej grupy do zlewki o pojemności 2000 ml. Temperatura wody wynosi 25 stopni. Oprócz niezbędnego minimalnego ruchu wymaganego do utrzymania pływania, kończyny zwierząt przestają się poruszać i rejestruje się je jako nieruchome. Zapisz całkowity czas bezruchu od 2 do 6 minut w ciągu 6 minut) Test aktywności dobrowolnej: Drugiego dnia po zakończeniu stymulacji chronicznym stresem mierzono liczbę spontanicznych aktywności myszy w każdej grupie w ciągu 5 minut.
Metoda unikania ciemności: Trzeciego dnia po zakończeniu stymulacji chronicznym stresem włóż ogon myszy do pudełka pomiarowego skierowanego w stronę małego otworu w ciemni i przeprowadź szkolenie. Po 24 godzinach ponownie zmierz opóźnienie myszy wchodzącej do ciemni po raz pierwszy i czas potrzebny na wejście do ciemni w ciągu 5 minut. Liczba porażenia prądem.
Test zawieszenia ogona: Piątego dnia po zakończeniu stymulacji chronicznym stresem mierzono czas bezruchu myszy w każdej grupie w ciągu 6 minut przez 2-6 minut.
2 godziny po ostatniej dawce (12 godzin bez jedzenia i wody) myszy zważono, usunięto gałki oczne, pobrano krew, oddzielono surowicę i oznaczono zawartość E2, T, LH i FSH w surowicy. wymierzony; myszy następnie uśmiercano przez zwichnięcie kręgów szyjnych i myszy poddano sekcji. , usuń grasicę, śledzionę i tkankę macicy, zważ ich mokrą masę i oblicz wskaźnik narządowy (wskaźnik narządowy=mokra masa narządu mg/masa myszy g), następnie usuń mózg, odetnij połowę i przygotuj mózg homogenat tkankowy. Do określenia zawartości neuroprzekaźników monoaminowych 5-HT i DA w homogenacie tkanki mózgowej wykorzystano test immunoenzymatyczny. Grasicę, śledzionę, macicę i tkanki mózgu utrwalono w 10% roztworze formaldehydu, zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki i wybarwiono HE. Zmiany morfologiczne każdej grupy obserwowano pod mikroskopem świetlnym. 2.3 Metoda oznaczania zestawu
Pobieranie próbek surowicy: Używaj probówek wolnych od pirogenów i endotoksyn. Podczas operacji należy unikać stymulacji komórek. Po pobraniu krwi należy ją odwirować przy 3000 obr/min przez 10 minut, aby szybko i dokładnie oddzielić surowicę od czerwonych krwinek. Pobrać próbki homogenatu tkankowego: Dodać do tkanki odpowiednią ilość soli fizjologicznej i rozetrzeć. Wirować przy 3000 obr/min przez 10 minut i pobrać supernatant.
Metoda oznaczania mysiego (mysiego) estradiolu (E2) zestawu ELISA jest taka sama jak w eksperymencie 2. Stężenia produktów wzorcowych (S0-55) wynoszą: 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pmol/l.
Metoda oznaczania zestawu testosteronu myszy (T) ELISA jest taka sama, jak w przypadku estradiolu (E2). Stężenia standardowych produktów (S0-55) to: 0, 50, 100, 200, 400, 800 pg/mL.
Metoda oznaczania za pomocą zestawu ELISA dla hormonu folikulotropowego (FSH) u myszy jest taka sama, jak w przypadku estradiolu (E2). Stężenia produktów standardowych (S0-55) to: 0, 5, 10, 20, 40 i 8{{30} }mIU/ml. Metoda oznaczania mysiego (mysiego) hormonu luteinizującego (LH) ELISA jest taka sama, jak w przypadku estradiolu (E2). Stężenia standardu (S0-55) wynoszą: 0, 0,5, 1, 2, 4 i 8 mIU/ml. Metoda oznaczania zestawu mysiego 5-hydroksytryptaminy (5-HT) ELISA jest taka sama jak w przypadku estradiolu (E2). Stężenia produktów standardowych (S0-55) wynoszą: 0, 15, 30, 60, 120, 240 ng/ml. Metoda oznaczania mysiego (mysiego) zestawu do wykrywania dopaminy (DA) ELISA jest taka sama, jak w przypadku estradiolu (E2). Stężenia standardowych produktów (S0-55) wynoszą: 0, 7,5, 15, 30, 60 i 120 pg/ml.
Z Tabeli 21 i Ryciny 25 można zobaczyć, że w porównaniu z grupą ślepą, czas bezruchu myszy w grupie modelowej znacznie wzrósł w eksperymentach z wymuszonym pływaniem i zawieszeniem ogona (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).
2 Wpływ na czynności autonomiczne u myszy w modelu depresji w okresie okołomenopauzalnym
Wyniki testu aktywności autonomicznej myszy w każdej grupie eksperymentalnej przedstawiono w Tabeli 22 i Rycinie 26.
Z Tabeli 23 oraz Ryc. 27 i 28 wynika, że w porównaniu z grupą ślepą, okres utajenia myszy w grupie modelowej był znacznie zmniejszony, a liczba wstrząsów elektrycznych znacznie wzrosła (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).
4 Wpływ na wskaźnik narządów u myszy w modelu depresji w okresie okołomenopauzalnym
Z Tabeli 24 i Ryciny 29 wynika, że w porównaniu z grupą ślepą, wskaźniki grasicy, śledziony i macicy w grupie modelowej uległy znacznemu obniżeniu (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Glikozyd fenyloetanolu Cistanchegrupa Wskaźnik grasicy i wskaźnik macicy myszy mogą być znacznie zwiększone (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).
